البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق
Summary
تشكيل مجمعات البروتين في الجسم الحي يمكن تصور من قبل ثنائي الجزيء تكامل مضان. وتنصهر شركاء التفاعل إلى أجزاء مكملة من العلامات الفلورية وأعرب عابر في أوراق التبغ، مما أدى إلى إعادة تشكيل إشارة الفلورسنت على مقربة من البروتينات اثنين.
Abstract
العديد من البروتينات تتفاعل مع بروتينات أخرى عابر أو يتم دمجها في المجمعات متعددة البروتين لأداء الوظيفة البيولوجية الخاصة بهم. تكامل مضان ثنائي الجزيء (BiFC) هو أسلوب في الجسم الحي لرصد هذه التفاعلات في الخلايا النباتية. في بروتوكول المعروضة وتنصهر البروتينات مرشح التحقيق إلى نصفين التكميلية من البروتينات الفلورية وقدم يبني منها في الخلايا النباتية عن طريق التحول بوساطة الأجرعية. بعد ذلك، يتم التعبير عن البروتينات عابر في أوراق التبغ، ويمكن أن يتم الكشف عن إشارات الفلورسنت استعادة مع متحد البؤر المجهر المسح الضوئي ليزر في خلايا سليمة. وهذا يسمح التصور ليس فقط من التفاعل في حد ذاته، ولكن أيضا توطين التحت خلوية من المجمعات البروتين يمكن تحديده. لهذا الغرض، تحتوي على جينات علامة علامة فلوري يمكن coexpressed جنبا إلى جنب مع ثوابت BiFC، وبالتالي تصور الهياكل الخلوية مثل رانه هيولي باطني شبكية، الميتوكوندريا، جهاز جولجي أو غشاء البلازما. يمكن رصد إشارة الفلورسنت إما مباشرة في خلايا البشرة ورقة أو في protoplasts واحد، والتي يمكن عزلها من أوراق التبغ تحول. هي مناسبة بشكل مثالي لدراسة BiFC البروتين البروتين التفاعلات في بيئاتها الطبيعية داخل الخلية الحية. ومع ذلك، فإنه لابد من النظر إلى أن التعبير يجب أن تكون مدفوعة من قبل المروجين قوية والتي يتم تعديلها الشركاء التفاعل بسبب الانصهار من علامات مضان كبيرة نسبيا، والتي قد تتداخل مع آلية التفاعل. ومع ذلك، BiFC هو نهج تكميلية ممتازة لتطبيق أساليب أخرى عادة التحقيق البروتين البروتين التفاعلات، مثل coimmunoprecipitation، في المختبر فحوصات المنسدلة أو التجارب الخميرة اثنين والهجين.
Introduction
دراسة تشكيل مجمعات البروتين والتعريب في الخلايا النباتية في الجسم الحي لا بد من التحقيق في الشبكات الخلوية، مما يشير إلى والعمليات الأيضية. BiFC يسمح التصور من البروتين البروتين التفاعلات في البيئة الطبيعية مباشرة داخل الخلية النباتية الحية 1-5.
في BiFC الاقتراب من تكامل اثنين من شظايا وN-C-محطة nonfluorescent من الرصاص بروتين فلوري إلى بروتين فلوري المعاد. وقد استخدمت أجزاء من العديد من البروتينات الفلورية مختلفة للكشف عن تفاعلات البروتين، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وحامل اللون من الذي يتكون كيميائيا من قبل ثلاثة بقايا متميزة 6. يمكن النصف البروتينات الفلورية ضمن حلقة أو حبلا ß أن ينتج في اثنين من شظايا nonfluorescent التي يمكن تنصهر إلى كل من البروتينات في المصالح. الفحص يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات في أي compartme التحت خلويةNT في أي كائن حي ينمو هوائيا أو الخلايا التي يمكن تعديلها وراثيا في التعبير عن البروتينات الانصهار. إذا كانت البروتينات اثنين حيز مقربة داخل الخلية، وأعيد مضان ويمكن رصدها بواسطة المجهر بدون إضافة fluorophores الخارجية أو الأصباغ 3.
وقد ثبت التبغ (نيكوتيانا benthamiana) ليكون نموذج كائن مريحة لتصور تفاعل البروتينات النباتية، منذ البروتينات يمكن بسهولة أن أعرب عن طريق استخدام بوساطة الأجرعية تحول يترك التبغ مع بنيات ولدت. Agrobacteria استخدام ما يسمى البلازميد تي (الورم حمل) الترميز للأنزيمات التي تتوسط تنبيغ من الجينات في المصالح في الخلايا النباتية. BiFC ينطبق بشكل جيد للذوبان فضلا عن بروتينات الغشاء في جميع المقصورات الخلوية واستخدمت بنجاح خلال السنوات الماضية لتحديد التفاعل البروتينات في الجسم الحي وكذلك لتحليل مواقع التفاعلداخل البروتينات 7-9. على التعبير عن الجينات المدخلة، تفاعل البروتينات الفلورية يمكن تصور مباشرة في الأوراق، والتي هي مناسبة لهياكل الخلوية أكبر، مثل الشبكة الإندوبلازمية (ER)، غشاء البلازما أو البلاستيدات الخضراء. ومع ذلك، لرصد توطين في هياكل أكثر دقة، على سبيل المثال، المغلف بلاستيدات الخضراء، فإنه من المستحسن لتصور مضان في protoplasts معزولة من أوراق التبغ تحول. وهناك مجموعة من ناقلات BiFC يحتوي إما C-محطة أو علامة فلوري N-محطة لابد من استخدامها للنهج BiFC في النباتات 10. تم استخدام بروتوكول المشار إليه فيما بعد لدراسة التفاعل بين البروتين عصاري خلوي الصدمة الحرارية 90 (HSP90) مع تكرار tetratricopeptide (نظام الحماية المؤقت) التي تحتوي على البروتينات مجال الالتحام Toc64 وAtTPR7 المقيمين في المغلف الخارجي بلاستيدات الخضراء والشبكة الإندوبلازمية، على التوالي 11-13. لهذا الغرض، وتنصهر HSP90 إلى طجزء من erminal SCFP (SCFP C). كان العلامة N-عضال تنصهر إلى كوصي لضمان سهولة الوصول للMEEVD عزر ملزم C-محطة من HSP90 لكبح من نوع المجالات نظام الحماية المؤقت. في موازاة ذلك، كانت تنصهر الجزء N-محطة لكوكب الزهرة (فينوس N) إلى المجالات عصاري خلوي من المجال TPR تحتوي على بروتينات الالتحام Toc64 وAtTPR7، على التوالي. كعنصر تحكم السلبية علينا استنساخ-C محطة للذوبان جزء من SCFP C فقط الذي يتواجد في العصارة الخلوية وبالتالي فهي عنصر تحكم المناسبة.
علامات الفلورسنت من البروتينات درس يجب أن تواجه نفس المقصورة الخلوية للسماح مقربة وإعادة تشكيل إشارة الفلورسنت بذلك. لتحديد توطين إشارة الفلورسنت المعاد بروتين تنصهر علامة إلى علامة فلوري مختلفة يمكن cotransformed للتدليل على توطين التحت خلوية من التفاعل. تحولت بروتين ER علامة تنصهر لmCherrry في وقت واحد فيحالة ER تقع AtTPR7 14. وتألق ذاتي الكلوروفيل بمثابة علامة بلاستيدات الخضراء في حالة Toc64. هذا ليس فقط من خلال التفاعل في الجسم الحي من Toc64 وAtTPR7، على التوالي، مع HSP90 كوصي عصاري خلوي يمكن رصدها مباشرة في أوراق التبغ ولكن يمكن أيضا أن يتم التحقيق توطين التحت خلوية من التفاعل.
BiFC يناسب كذلك اتباع نهج متكامل لأساليب أخرى دراسة التفاعلات البروتين البروتين. مقارنة coimmunoprecipitation أو في المختبر التجارب المنسدلة، على سبيل المثال، لا أجسام مضادة محددة يجب أن تكون متاحة للبروتينات من الفائدة، والبروتينات لا يجب أن يتم التعبير recombinantly في المختبر، والتي يمكن أن يكون تحديا، خاصة بالنسبة للبروتينات الغشاء. وعلاوة على ذلك، وأيضا التفاعلات عابرة يمكن رصدها باستخدام BiFC، حيث يتم القبض على البروتينات عن طريق التفاعل من علامات الفلورسنت تنصهر 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند التخطيط لتجربة BiFC ينبغي النظر في عدة نقاط. على الرغم من أن ليس لديه معلومات حول هيكلية البروتينات ذات الاهتمام المطلوب، طوبولوجيا أن يكون معروفا عند العمل مع غشاء تمتد البروتينات. البروتينات الفلورية يجب أن تتواجد في نفس المكان التحت خلوية أو مواجهة نفس الجانب م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر يورغن سول لإجراء مناقشات مفيدة وكريس كاري لقراءة نقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل وDFG فون دير chemischen اندستري (أرقام المنح SFB 1035 A04 مشروع لSS وهل 187/22 إلى RS).
Materials
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
References
- Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
- Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
- McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
- Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
- Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
- Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
- Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
- Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).
