Un protocole pour l'analyse de l'hépatite C de réplication
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
L'hépatite C (VHC) affecte 3% de la population du monde et provoque des maladies graves du foie comme l'hépatite chronique, la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Le VHC est un virus à ARN enveloppé de la famille des Flaviviridae. Le traitement actuel n'est pas pleinement efficace et provoque des effets secondaires indésirables. Il n'ya pas de vaccin disponible VHC. Ainsi, la poursuite des efforts est nécessaire pour développer un vaccin et une meilleure thérapie. Un système de culture cellulaire du VHC est essentielle pour l'étude des diverses étapes de la croissance de VHC, y compris l'entrée virale, la réplication du génome, à l'emballage, et la sortie. Dans la procédure actuelle présentée, nous avons utilisé un virus de type sauvage intragenotype 2a chimérique, FNX-VHC, et un virus recombinant FNX-Rluc portant un gène rapporteur de la luciférase Renilla pour étudier la réplication du virus. Une lignée cellulaire d'hépatome humain (Huh-7 repose) a été utilisé pour la transfection in vitro de transcrits ARN génomiques du VHC. Surnageants de culture sans cellules, des lysats de protéines et total ARN ont été récoltés à divers moments post-transfection pour évaluer la croissance du VHC. Génome HCV état de réplication a été évaluée par RT-PCR quantitative et la visualisation de la présence de HCV ARN double brin. L'expression de la protéine du VHC a été vérifiée par blot et immunofluorescence dosages Western en utilisant des anticorps spécifiques des protéines du VHC NS3 et NS5A. les cellules transfectées de l'ARN du VHC libérés des particules infectieuses dans le surnageant de culture et le titre viral a été mesuré. dosages de la luciférase ont été utilisées pour évaluer le niveau de réplication et l'infectiosité de reporter le VHC. En conclusion, nous présentons diverses analyses virologiques pour caractériser les différentes étapes du cycle de réplication du VHC.
Introduction
L'hépatite C (VHC) provoque une cirrhose et un cancer du foie. Elle touche 170 millions de personnes dans le monde avec 350 000 personnes meurent chaque année 1-3. Le VHC est un virus à ARN à brin positif ayant une taille de génome de 9,6 kb. Le génome du VHC est traduit en une seule polyprotéine de ~ 3000 résidus d'acides aminés qui est clivée de manière protéolytique par diverses proteases cellulaires et virales en 10 polypeptides. Le VHC est le virus prototype du genre Hepacivirus et appartient à la famille des Flaviviridae 4. Lors de l'exposition, le VHC établit une infection chronique chez 80% des individus. L'infection est souvent asymptomatique et en temps opportun diagnostic peut permettre une intervention thérapeutique pour prévenir la détérioration du foie. Le traitement actuel est sous-optimale et aucun vaccin n'est disponible 5,6.
L'étiologie de l'hépatite C a été décrite pour la première en 1989 7. Etudier la réplication du VHC est important pour l'hépatite C vaccin et la recherche de traitement, mais il avait étélongue entravée par l'absence d'un système de culture virale efficace. Un clone moléculaire du VHC a été montré pour être infectieux chez les chimpanzés sur inoculation intrahépatique 8. Par la suite, des réplicons du VHC sub-génomiques ont été décrites, qui ont permis de disséquer l'étape de réplication du génome viral dans un système de 9,10 de la culture cellulaire. Découverte d'un VHC de génotype 2a isoler JFH-1 (hépatite fulminante-1 japonais), capable d'infecter la culture cellulaire a ouvert de nouvelles voies pour la recherche de la réplication du VHC 11-13. Souche de génotype 2a JFH-1 des systèmes de culture à base infectieuses basé virus chimériques inter-et intra-génotypiques et VHC de génotype 1 sont disponibles ainsi 14-18.
Nous avons utilisé avec succès JFH-1 et le VHC souche intragenotype 2a virus chimère pour obtenir la haute résolution profilage fonctionnelle carte de domaines protéiques et éléments agissant en cis d'ARN 19,20. Selon cette étude, nous décrivons ici un système de culture efficace couramment utilisé qui permetl'étude de différentes étapes du cycle de replication du VHC et de l'interaction hôte-pathogène. Nous présentons des tests virologiques pour évaluer la réplication du génome viral et de l'infectiosité de novo intragenotype 2a du VHC et un VHC de journaliste en Renilla.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette illustration décrit un procédé d'analyse du cycle de réplication du virus de l'hépatite C. VHC est un agent pathogène humain et le protocole sur la biosécurité prescrit devra être strictement suivies. Les systèmes de culture de cellules de VHC infectieuses ont été décrites précédemment 11-13,16,17. Il ya quelques points essentiels nous mettons en œuvre en suivant le protocole illustré. Premièrement, il est d'une grande importance d'avoir une bonne qualité de l'ARN …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
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