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Immunology and Infection

हेपेटाइटिस सी वायरस नकल विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल

Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51362
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Liver Program at Regenerative Medicine Institute, Department of Biomedical Sciences, Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA
* These authors contributed equally

Abstract

हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) दुनिया की आबादी का 3% को प्रभावित करता है और जीर्ण हेपेटाइटिस, सिरोसिस, और hepatocellular कार्सिनोमा सहित गंभीर जिगर की बीमारियों का कारण बनता है. एचसीवी परिवार Flaviviridae से संबंधित एक छा आरएनए वायरस है. वर्तमान उपचार पूरी तरह से प्रभावी नहीं है और प्रतिकूल दुष्प्रभाव का कारण बनता है. उपलब्ध नहीं एचसीवी टीका नहीं है. इस प्रकार, निरंतर प्रयास एक टीका और बेहतर चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक है. एक HCV सेल संस्कृति प्रणाली वायरल प्रविष्टि, जीनोम प्रतिकृति, पैकेजिंग, और निकास सहित एचसीवी विकास के विभिन्न चरणों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. प्रस्तुत मौजूदा प्रक्रिया में, हम एक जंगली प्रकार intragenotype 2A कैमेरिक वायरस, FNX-एचसीवी, और वायरस नकल का अध्ययन करने के लिए एक Renilla luciferase संवाददाता जीन ले एक पुनः संयोजक FNX-Rluc वायरस का इस्तेमाल किया. एक मानव hepatoma सेल लाइन (हं -7 आधारित) में इन विट्रो की अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया गया था एचसीवी जीनोमिक RNAs लिखित. सेल मुक्त संस्कृति supernatants, प्रोटीन lysates और टीotal आरएनए एचसीवी विकास का आकलन करने के बाद अभिकर्मक बताते विभिन्न समय पर काटा गया. एचसीवी जीनोम प्रतिकृति स्थिति मात्रात्मक RT-पीसीआर और एचसीवी की उपस्थिति visualizing डबल असहाय शाही सेना द्वारा मूल्यांकन किया गया था. एचसीवी प्रोटीन अभिव्यक्ति एचसीवी NS3 और NS5A प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी धब्बा और immunofluorescence assays के द्वारा सत्यापित किया गया था. संस्कृति सतह पर तैरनेवाला और वायरल अनुमापांक में संक्रामक कणों जारी किया HCV शाही सेना कोशिकाओं मापा गया था. Luciferase assays संवाददाता एचसीवी की प्रतिकृति स्तर और संक्रामकता का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया. अंत में, हम HCV प्रतिकृति चक्र के विभिन्न चरणों के लिए निस्र्पक विभिन्न विषाणुजनित assays प्रस्तुत करते हैं.

Introduction

हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) सिरोसिस और लीवर कैंसर का कारण बनता है. यह 350,000 लोगों को प्रतिवर्ष 1-3 मरने के साथ दुनिया भर में 170 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है. एचसीवी 9.6 केबी के एक जीनोम आकार के साथ एक सकारात्मक किनारा आरएनए वायरस है. एचसीवी जीनोम proteolytically 10 polypeptides में विभिन्न सेलुलर और वायरल proteases से cleaved है कि ~ 3000 अमीनो एसिड के अवशेष का एक भी polyprotein के रूप में अनुवाद किया है. एचसीवी जीनस Hepacivirus में प्रोटोटाइप वायरस है और परिवार Flaviviridae 4 के अंतर्गत आता है. जोखिम पर, एचसीवी व्यक्तियों के 80% में पुराने संक्रमण स्थापित करता है. संक्रमण निदान जिगर गिरावट को रोकने के लिए चिकित्सकीय हस्तक्षेप अनुमति दे सकते हैं ज्यादातर स्पर्शोन्मुख और समय पर है. वर्तमान उपचार suboptimal है और कोई टीका 5,6 उपलब्ध है.

हेपेटाइटिस सी के एटियलजि पहली बार 1989 7 में वर्णित किया गया था. HCV प्रतिकृति अध्ययन हेपेटाइटिस सी वैक्सीन और उपचार अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह किया गया थालंबे समय से एक कुशल वायरल संस्कृति प्रणाली की कमी आड़े आती. एचसीवी के एक आणविक क्लोन intrahepatic टीका 8 पर चिम्पांजी में संक्रामक होना दिखाया गया था. बाद में, एचसीवी उप जीनोमिक replicons एक सेल संस्कृति प्रणाली 9,10 में वायरल जीनोम प्रतिकृति चरण काटना करने की अनुमति दी है, जो वर्णन किया गया है. एक जीनोटाइप 2A एचसीवी की डिस्कवरी JFH -1 (जापानी एकाएक बढ़ानेवाला हैपेटाइटिस -1) को अलग सेल संस्कृति संक्रमित करने में सक्षम HCV प्रतिकृति अनुसंधान 11-13 के लिए नए रास्ते खोल दिया. जीनोटाइप 2A तनाव JFH -1 अंतर और इंट्रा genotypic कैमेरिक वायरस और जीनोटाइप 1 HCV आधारित आधारित संक्रामक संस्कृति सिस्टम के रूप में अच्छी तरह से 14-18 उपलब्ध हैं.

हम सफलतापूर्वक प्रोटीन डोमेन और सीआईएस से अभिनय आरएनए तत्वों 19,20 के उच्च संकल्प कार्यात्मक रूपरेखा नक्शा प्राप्त करने के लिए JFH -1 तनाव और एचसीवी intragenotype 2A कैमेरिक वायरस का इस्तेमाल किया है. इस के अनुसार, यहां हम अनुमति देता है कि नियमित रूप से इस्तेमाल के लिए एक प्रभावी संस्कृति प्रणाली का वर्णनHCV प्रतिकृति चक्र और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के विभिन्न चरणों का अध्ययन. हम वायरल जीनोम प्रतिकृति और intragenotype 2A एचसीवी और एक Renilla luciferase आधारित रिपोर्टर एचसीवी की नए सिरे से संक्रामकता का आकलन करने के लिए विषाणुजनित assays प्रस्तुत करते हैं.

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Protocol

प्रोटोकॉल की एक सामान्य रूपरेखा चित्र 1 में सचित्र है.

1. प्रकोष्ठों

  1. 10-15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 10 मिमी nonessential अमीनो एसिड, 10 मिमी HEPES, पेनिसिलिन (100 इकाइयों / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एमएल), और 2 मिमी एल glutamine होता है कि पूरा विकास मीडिया तैयार करें.
  2. हेपेटाइटिस सी वायरल प्रतिकृति चक्र की इन विट्रो विश्लेषण के लिए ऊपर की खुराक युक्त पूर्ण विकास मीडिया में हं-7.5.1 कोशिकाओं 13 बनाए रखें.
  3. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर निर्दिष्ट पूरक विकास मीडिया के साथ हं-7.5.1 कोशिकाओं में संस्कृति वायरल उपभेदों.

2. वायरस और प्लाज्मिड Constructs

  1. HCV शाही सेना के पूरक डीएनए (सीडीएनए) फार्म उत्पन्न और आनुवंशिक हेरफेर में आसानी के लिए एक प्लाज्मिड वेक्टर में यह क्लोन. नोट: जापानी एकाएक बढ़ानेवाला हैपेटाइटिस 1 की खोज, JFH -1 (जीनोटाइप 2A एचसीवी), एचसीवी अनुसंधान के लिए आलोचना की गई है और है को अलगमुख्य रूप से HCV प्रतिकृति चक्र 11-13 का अध्ययन किया. JFH -1 एचसीवी के आधार पर इंटर और intragenotypic कैमेरिक वायरस आमतौर पर अनुसंधान 14-18 में उपयोग किया जाता है. सिंथेटिक intragenotype 2A कैमेरिक वायरस, FNX-एचसीवी, और एक monocistronic कैमेरिक संवाददाता तनाव का निर्माण पहले 19 और निर्माण विवरण इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर हैं वर्णित किया गया था.
  2. यह (न्यूक्लियोटाइड 1-2878) J6CF पैतृक तनाव (NCBI परिग्रहण नहीं. AF177036) के रूप में एक 5'NTR, संरचनात्मक क्षेत्रों और P7, और NS2 गैर संरचनात्मक क्षेत्रों का हिस्सा होता है के रूप में pFNX-एचसीवी intragenotype 2A वायरस का प्रयोग करें अच्छी तरह से JFH -1 वायरल तनाव (NCBI परिग्रहण नहीं. AB047639) के गैर संरचनात्मक घटक के रूप में. नोट: FNX-एचसीवी Jc1 intragenotype 2A कैमेरिक एचसीवी के क्रम पर आधारित संश्लेषित किया गया था पहले से 15 की सूचना दी.
  3. एक आर डालने से (2.2 कदम में ऊपर) pFNX-एचसीवी तनाव पर आधारित एक monocistronic कैमेरिक संवाददाता वायरल का निर्माण, pFNX-Rluc, उत्पन्न5 'एनटीआर और (NT 388 और 389 के बीच) कोर जीन के बीच enilla luciferase जीन. बाद में, एक दरार के संकेत के रूप में काम करेगा जो एक पैर और मुंह रोग वायरस 2A (F2A) पेप्टाइड अनुक्रम, का उपयोग luciferase जीन और इस निर्माण के मूल जीन कनेक्ट.
  4. PFNX-एचसीवी या pFNX-Rluc वायरल पृष्ठभूमि का उपयोग शाही सेना पोलीमरेज़ अशक्त (पीओएल-) वायरल निर्माण इंजीनियर. , आग अमीनो एसिड के अवशेष के साथ इन वायरल अनिवार्य जरूरतों में से किसी की; NS5B पोलीमर्स उत्प्रेरक अवशेष, GDD (8615-8623 nt ए.ए. 2759-2761) बदलें.

3. इन विट्रो एचसीवी आरएनए प्रतिलेखन

  1. एक intragenotype 2A कैमेरिक वायरस FNX-एचसीवी और FNX-एचसीवी पोल अशक्त वायरल प्रतिकृति (2A चित्रा) के मूल्यांकन के लिए (पीओएल-) एचसीवी का प्रयोग करें.
  2. XbaI प्रतिबंध एंजाइम के साथ वायरल plasmids linearize और फिर कुंद समाप्त होता है उत्पन्न करने के लिए मूंग nuclease के साथ व्यवहार करते हैं. आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा पचा plasmids शुद्ध. ओ अखंडता को सत्यापितच जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 2B) agarose डीएनए subjecting द्वारा प्लाज्मिड linearized.
  3. T7 शाही सेना पोलीमरेज़ का उपयोग linearized वायरल plasmids टाइप करना.
  4. एक शाही सेना शुद्धि किट का उपयोग कर नए संश्लेषित DNase इलाज शाही सेना शुद्ध.
  5. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा -2) द्वारा आरएनए उत्पादन की जाँच करें.
  6. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा शाही सेना यों.
  7. 10 माइक्रोग्राम काम कर aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस में उत्पन्न शाही सेना स्टोर. नोट: एक ही समय में प्रत्येक वायरल नमूना और नियंत्रण के लिए सभी शाही सेना transcribing द्वारा प्रत्येक प्रयोगात्मक डिजाइन के भीतर शाही सेना गुणवत्ता की भिन्नता को कम करने के लिए.

4. एचसीवी आरएनए अभिकर्मक और नमूना संग्रह

  1. Trypsin का उपयोग हं-7.5.1 कोशिकाओं फसल.
  2. कोशिकाओं, अपकेंद्रित्र कुल्ला और ठंड कम सीरम मीडिया के साथ दो बार निलंबन resuspend. मिलीलीटर प्रति 1 x 10 7 कोशिकाओं में कम सीरम मीडिया में कोशिकाओं Resuspend.
  3. 10 और # की कुल मिक्स956, एक 0.4 सेमी electroporation क्युवेट में resuspended कोशिकाओं (4 x 10 6 कोशिकाओं) के 400 μl के साथ लिखित वायरल शाही सेना के जी. , 270 वी पर electroporation के माध्यम से 100 Ω, और 950 μF कोशिकाओं Transfect.
  4. 15% FBS के साथ 10 एमएल पूरा विकास मीडिया में electroporated कोशिकाओं Resuspend. नोट: है ना-7.5.1 कोशिकाओं 15% भ्रूण गोजातीय सीरम में सुसंस्कृत थे जब electroporated कोशिकाओं की वृद्धि survivability देखा जाता है.
  5. 4, 48 और 96 घंटा: दोनों T-25 बोतल (फ्लास्क प्रति ~ 1.2 x 10 6 कोशिकाओं) और 48 अच्छी तरह प्लेटें निम्नलिखित समय बिंदुओं में से प्रत्येक के लिए (अच्छी तरह से प्रति 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं) में कोशिकाओं थाली.
  6. सुसंस्कृत बोतल और प्लेटें से मृत सेल मलबा हटाने के लिए 10% FBS के साथ नए सिरे से पूरक विकास मीडिया के साथ 4-8 घंटे बाद अभिकर्मक पर मीडिया की जगह.
  7. 48, 96 घंटा समय अंक पर और 4 पर 10 मिनट के लिए 1500 rpm पर कोशिकाओं की centrifugation द्वारा एकत्र नमूनों से सेलुलर मलबे को हटाने हार्वेस्ट सेल संस्कृति supernatants डिग्री सेल्सियस
  8. -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल मुक्त supernatants स्टोर Lyse वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा प्रोटीन और आरएनए के विश्लेषण के लिए और संकेत समय बिंदुओं पर प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर रिवर्स कोशिकाओं.

5. एचसीवी जीनोम प्रतियां आकलन के लिए प्रतिलेखन मात्रात्मक पीसीआर (RT-qPCR) रिवर्स

  1. एचसीवी जीनोमिक शाही सेना की नकल संख्या निर्धारित करने के लिए एक दो कदम RT-qPCR प्रदर्शन करना.
  2. रिवर्स अनुलेखन 1 रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और 5'NTR (JFH RTQ आर: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA -3 ') को बांधता है कि एचसीवी भावना कतरा के लिए विशिष्ट एक प्राइमर का उपयोग कर कुल सेलुलर शाही सेना के ग्राम या गृह व्यवस्था जीन peptidylprolyl Isomerase जी (PPIG R के लिए विशिष्ट एक प्राइमर : 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT -3 '). इसके अलावा एचसीवी भावना कतरा प्राइमर का उपयोग ज्ञात जीनोम प्रतियां (10 1 9 मानक 10) के (चरण 3 में उत्पन्न) FNX-एचसीवी आरएनए नक़ल रिवर्स.
  3. (JFH आरटी विशिष्ट एचसीवी प्राइमरों का उपयोग परिणामस्वरूप लिखित सीडीएनए के 50 एनजी का उपयोग करके qPCR बाहर ले जाने के लिएQF: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA 3; JFH RTQ आर: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA -3 ') और डीएनए qPCR सुपर मिश्रण युक्त हरे रंग के बंधन. साथ ही गृह व्यवस्था जीन PPIG के लिए qPCR प्रदर्शन करना (प्राइमरों PPIG एफ: 5'-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC -3 '; PPIG आर: 5'-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT -3') नोट: नमूने भर सटीक intracellular एचसीवी आरएनए स्तर की गणना के लिए, सेलुलर गृह व्यवस्था जीन, PPIG उपयोग , सामान्य बनाने के लिए अभिव्यक्ति के स्तर (सीटी चक्र). नकल संख्या निर्धारण के लिए मानक के रूप में FNX-एचसीवी जीनोम की प्रतिलिपि नंबर का उपयोग करें.
  4. 15 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 60: qPCR चल एचसीवी आरएनए नकल संख्या निर्धारित करने के लिए जब निम्न शर्तों का उपयोग करें   वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली का उपयोग करते हुए 30 सेकंड (40 चक्र) के लिए डिग्री सेल्सियस.
  5. जीनोम प्रतिकृति परिणाम के लिए आंकड़े 3 ए और 3 बी देखें.

6. पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण एचसीवी प्रोटीन अभिव्यक्ति (चित्रा -3 सी) का पता लगाने के लिए

  1. सेल lysates fr प्रयोग करेंओम विषाणु आरएनए प्रोटीन पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण के लिए 96 घंटे बाद अभिकर्मक में ट्रांसफ़ेक्ट.
  2. एसडीएस पृष्ठ और polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली को हस्तांतरण का उपयोग सेल lysate का समाधान करें.
  3. 5% स्किम दूध, फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में 0.2% बीच 20 से युक्त एक अवरुद्ध समाधान का उपयोग झिल्ली ब्लॉक.
  4. प्राथमिक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी NS3 साथ झिल्ली (1 1,000 में कमजोर पड़ने) और बीटा actin (1 5,000 में कमजोर पड़ने) सेते हैं.
  5. हॉर्सरैडिश peroxidase (1 5,000 में कमजोर पड़ने) संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी जोड़ें और chemiluminescence द्वारा पता लगाने.

7. Immunofluorescence परख (यूके)

  1. Immunofluorescence परख के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मेथनॉल का उपयोग एचसीवी से संक्रमित और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को ठीक करें.
  2. पीबीएस के साथ तीन बार सेल धो लें और आइएफए अवरुद्ध बफर के साथ ब्लॉक.
  3. खरगोश पॉलीक्लोनल या माउस मोनोक्लोनल विरोधी DSR (कृपया डॉ. दासगुप्ता, यूसीएलए द्वारा प्रदान की) विरोधी NS5A मुख्य रूप से एंटीबॉडी का प्रयोग करेंएनए एंटीबॉडी 1:200 (1 ग्राम / एमएल) की एक कमजोर पड़ने पर J2 और 5 घंटे के लिए रात 4 बजे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
  4. तीन बार प्राथमिक एंटीबॉडी के बाद पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
  5. बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी 488 पॉलीक्लोनल माध्यमिक एंटीबॉडी या एक 1:1,000 कमजोर पड़ने (1 ग्राम / एमएल) में बकरी विरोधी माउस आईजीजी 594 पॉलीक्लोनल माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  6. पीबीएस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 डी) का उपयोग Hoechst डाई और दृश्य का उपयोग कर तीन बार और दाग नाभिक के साथ कोशिकाओं को धो लें.

8. मापने वायरस टिटर

  1. प्लेट भोले हं-7.5.1 कोशिकाओं में लगभग 3 x 10 3 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर. अगले दिन, विकास मीडिया का उपयोग HCV शाही सेना कोशिकाओं से काटा सेल मुक्त संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 10 गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन और हं-7.5.1 कोशिकाओं पर तीन प्रतियों में टीका लगाना.
  2. -20 पर 30 मिनट के लिए मेथनॉल (का उपयोग कर 72 घंटे के बाद संक्रमण में कोशिकाओं को ठीक करें
  3. NS5A सकारात्मक foci के लिए गिनती और मिली लीटर प्रति फोकस बनाने यूनिट की औसत संख्या (FFU) की गणना करने के लिए उच्चतम कमजोर पड़ने का प्रयोग करें. एचसीवी अनुमापांक के लिए 4 चित्र देखें.

वायरल जीनोम प्रतिकृति और संक्रामकता के लिए 9. Renilla luciferase संवाददाता परख

  1. वायरल जीनोम प्रतिकृति, 48 अच्छी तरह प्लेटें में तीन प्रतियों में थाली एचसीवी आरएनए electroporated हं-7.5.1 कोशिकाओं (1 x 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) के मूल्यांकन के लिए.
  2. Lyse 6 घंटा में निष्क्रिय lysis बफर के 75 μl, 48 घंटा, 96 घंटा बाद अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं.
  3. -80 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान और दुकान पर 15 मिनट के लिए धीरे प्लेटें रॉक
  4. , Renilla luciferase enzymatic गतिविधि को मापने के कमरे के तापमान को प्रोटीन lysate और Renilla luciferase परख अभिकर्मकों पिघलना करने के लिए.
  5. एक 96 wel के प्रति अच्छी तरह से प्रोटीन lysate के 20 μl जोड़ें एल सफेद luminescence प्लेट और एक luminometer में प्लेट रखें.
  6. Renilla luciferase परख अभिकर्मक (coelenterazine सब्सट्रेट + बफर) प्रति अच्छी तरह से और एक 2 सेकंड पूर्व पढ़ने के विलंब के बाद के 100 μl बग़ैर; 10 सेकंड के लिए उत्सर्जित प्रकाश को एकीकृत.
  7. जैविक triplicates की luciferase मूल्यों से प्रत्येक नमूने के लिए मतलब है और मानक विचलन की गणना और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए डेटा (चित्रा 5) के अधीन है.
  8. संक्रामकता का आकलन करने के लिए, 48 अच्छी तरह प्लेटें में भोले हं-7.5.1 कोशिकाओं पर तीन प्रतियों में संकेत समय अंक (48 घंटे और 96 घंटे) के लिए एचसीवी आरएनए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से प्राप्त सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला के 500 μl टीका लगाना.
  9. ठीक होने के बाद 6 घंटे के बाद संक्रमण प्रति ताजा माध्यम के 500 μl के साथ वायरल inoculum बदलें.
  10. Lyse 8.2-8.7 (चित्रा 5) चरणों में वर्णित के रूप में Renilla luciferase परख करने के लिए 48 घंटे के बाद संक्रमण और इस विषय पर कोशिकाओं.
itle "> 10. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. रेखांकन में त्रुटि सलाखों के मानक विचलन (एसडी) से संकेत मिलता है. पी मूल्यों unpaired टी परीक्षण द्वारा गणना की गई.

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Representative Results

हेपेटाइटिस सी वायरस एक आरएनए वायरस है. इस प्रकार आनुवंशिक हेरफेर उद्देश्य के लिए, एचसीवी जीनोमिक सीडीएनए एक जीवाणु प्लाज्मिड वेक्टर में क्लोन किया गया है. एक T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटर अनुक्रम एचसीवी जीनोम के 5 'अंत से पहले तुरंत शुरू की गई थी. एचसीवी विश्लेषण कार्यप्रवाह की एक सामान्य रूपरेखा चित्र 1 में प्रस्तुत किया है. सटीक 3 'अंत के साथ एचसीवी जीनोमिक शाही सेना उत्पन्न करने के लिए, प्लाज्मिड युक्त एचसीवी जीनोम Xba मैं प्रतिबंध एंजाइम और उत्पन्न एकल असहाय अधिकता मूंग nuclease पाचन के साथ पा लिया गया था के साथ कट जाता है . linearized एचसीवी प्लाज्मिड की गुणवत्ता agarose जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 2B) द्वारा मूल्यांकन किया गया था. एचसीवी डीएनए विट्रो प्रतिलेखन में मध्यस्थता T7 शाही सेना पोलीमरेज़ के अधीन है और जिसके परिणामस्वरूप आरएनए 9.6 kilobase (चित्रा -2) पर एक एकल उत्पाद झुकेंगे था.

हम एक intragenotype 2A एचसीवी (चित्रा के विकास कैनेटीक्स का परीक्षण किया60, 3). हं-7.5.1 कोशिकाओं जंगली प्रकार (WT) और पोलीमर्स अशक्त वायरस के इन विट्रो लिखित शाही सेना के साथ electroporated थे. हम RT-qPCR द्वारा वायरल भावना जीनोम प्रतिकृति का मूल्यांकन किया. परिणाम गुम्मट वायरस कुशलतापूर्वक जीनोम (आंकड़े 3 ए और 3 बी) दोहराया कि संकेत दिया. जंगली प्रकार पोल वायरस की तुलना में जीनोम प्रतिकृति के एक से तीन प्रवेश उच्च स्तर का प्रदर्शन किया. गुम्मट वायरस वायरल प्रोटीन दरार (प्रोटीज गतिविधि) में शामिल है कि NS3 प्रोटीन (चित्रा -3 सी), और जीनोम प्रतिकृति (helicase गतिविधि) पैदा करता है. Immunofluorescence परख (चित्रा 3 डी) के द्वारा मूल्यांकन के रूप में भी गुम्मट वायरस NS5A प्रोटीन व्यक्त किया. NS5A प्रोटीन एचसीवी आरएनए replicase परिसर का हिस्सा है. वायरल जीनोम प्रतिकृति कल्पना करने के लिए, हम विशेष रूप से dsRNA पहचानता है कि एक एंटीबॉडी का उपयोग डबल असहाय (डीएस) HCV शाही सेना की उपस्थिति की जांच की. एचसीवी जीनोम प्रवर्धन के दौरान, भावना कतरा आरएनए सी हैविरोधी भावना जीनोम को opied, इस प्रकार डबल असहाय शाही सेना मध्यवर्ती संक्रमित कोशिका कोशिका द्रव्य में मौजूद हैं. NS5A प्रोटीन और dsRNA सक्रिय वायरल प्रतिकृति सुझाव गुम्मट ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के सेलुलर कोशिका द्रव्य (चित्रा 3 डी) में सह localizes. साथ में ले ली, गुम्मट वायरस ट्रांसफ़ेक्ट हं-7.5.1 कोशिकाओं में सक्रिय प्रतिकृति की स्थापना की.

एचसीवी अनुसंधान के क्षेत्र में प्रगति के कारण एक संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली की कमी के कारण सीमित कर दिया गया था. JFH -1 एचसीवी के तनाव और हमें वायरल प्रविष्टि, आरएनए अनुवाद, शाही सेना प्रतिकृति और संक्रामक वायरल संतान के गठन सहित सेल संस्कृति में पूरे HCV प्रतिकृति चक्र की जांच करने की अनुमति दी कैमेरिक प्रयोगशाला उपभेदों के बाद लक्षण वर्णन की खोज. एचसीवी अनुमापांक और डी नोवो संक्रामकता का आकलन करने के लिए, हम HCV शाही सेना कोशिकाओं से काटा सेल संस्कृति supernatants टीका. एचसीवी संक्रमण एचसीवी NS5A प्रोटीन का पता लगाने के द्वारा कल्पना और गणना की गईसंक्रामक foci (चित्रा 4) की गणना के द्वारा वायरल अनुमापांक. हम एक ही ध्यान केंद्रित के रूप में NS5A के लिए कोशिकाओं के अलग क्लस्टर (2 से अधिक कोशिकाओं) सकारात्मक माना जाता है. परिणाम गुम्मट वायरस संक्रामक है और संक्रामक कण की इकाइयों / मिलीलीटर के गठन 4 पर 10 foci कि उत्पादन संकेत दिया.

हम भी Renilla luciferase (Rluc) रिपोर्टर जीन (चित्रा 5A) को शरण देने के एक एचसीवी संवाददाता वायरस की स्थापना की. एक संवाददाता एचसीवी उच्च सामग्री स्क्रीनिंग assays के लिए और साथ ही उत्परिवर्ती वायरस की एक बड़ी संख्या के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ हम गुम्मट और पोल संवाददाता वायरस के विकास phenotypes का आकलन प्रस्तुत करते हैं. वायरल जीनोम replicates, तो luciferase गतिविधि ओवरटाइम पोस्ट अभिकर्मक बढ़ जाएगी. वृद्धि की जीनोम प्रतिकृति स्तर बढ़ा luciferase गतिविधि से deduced किया जा सकता है. इसलिए, luciferase गतिविधि परोक्ष रूप से जीनोम प्रतिकृति के स्तर की माप प्रदान करता है. गुम्मट या पोल छठी से काटा lysatesसंकेत समय बिंदुओं पर RAL शाही सेना कोशिकाओं luciferase गतिविधियों के लिए परीक्षण किया गया. 6 घंटा बाद अभिकर्मक में, गुम्मट और पोल वायरस दोनों (चित्रा 5 ब) अनुवाद किया गया था कि ट्रांसफ़ेक्ट शाही सेना के इसी तरह के इनपुट स्तर का संकेत है, इसी तरह luciferase गतिविधियों था. हालांकि 48 घंटे और 96 घंटे बाद अभिकर्मक पर, गुम्मट वायरस पोल वायरस की तुलना में जीनोम प्रतिकृति स्तर में वृद्धि हुई प्रदर्शन किया. पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण (चित्रा 5C) द्वारा सत्यापित इसके अलावा, गुम्मट वायरस वायरल NS3 प्रोटीन का उत्पादन किया. बाद में, हम 48 घंटे और 96 घंटे के बाद ट्रांसफ़ेक्ट सेल संस्कृतियों से एकत्र सेल मुक्त supernatants साथ भोले हं-7.5.1 कोशिकाओं inoculating द्वारा गुम्मट और पोल संवाददाता वायरस की संक्रामकता का परीक्षण किया. गुम्मट वायरस पोल संवाददाता वायरस (चित्रा 5D) की है कि प्रतिकृति के 2-3 प्रवेश उच्च स्तर पर था जबकि पोल वायरस, आधार स्तर luciferase गतिविधि थी. परिणाम हम एक मजबूत एचसीवी संक्रामक सेल cultu दिखाना है कि सिस्टम फिर से.

चित्रा 1
चित्रा 1. HCV प्रतिकृति विश्लेषण कार्यप्रवाह के सामान्य रूपरेखा. इन विट्रो प्रतिलेखन के अधीन T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रमोटर (T7p) युक्त एचसीवी प्लाज्मिड निर्माण linearized. शुद्ध किया एचसीवी आरएनए जीनोम हं-7.5.1 कोशिकाओं में electroporated और बोतल और 48 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया जाता है. 4 घंटा, 48 घंटा, 96 घंटा बाद अभिकर्मक में, सेलुलर शाही सेना और संस्कृति supernatants बोतल से काटा जाता है. 48 अच्छी तरह से थाली से कोशिकाओं कटाई प्रोटीन lysate के लिए उपयोग किया जाता है और immunofluorescence परख के लिए तय कर रहे हैं. RT-qPCR द्वारा जीनोम प्रतिलिपि संख्या विश्लेषण, पश्चिमी सोख्ता और मापने वायरल अनुमापांक HCV प्रतिकृति का आकलन करने के लिए किया जाता है.

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निर्माण प्लाज्मिड DNAs के इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा एचसीवी जीनोमिक RNAs के चित्रा 2. उत्पादन. J6CF/JFH-1 intragenotype 2A कैमेरिक वायरस, FNX-एचसीवी और FNX-एचसीवी पोल बातिल की ए) जीनोमिक संगठन. J6CF तनाव क्षेत्र (NS2 के हिस्से को 5'NTR) डार्क ग्रे और JFH -1 तनाव क्षेत्र (3'NTR को NS2 का हिस्सा) में दिखाया गया है हल्के भूरे रंग में प्रदर्शित किया जाता है. NS5B पोलीमर्स उत्प्रेरक डोमेन उत्परिवर्तन (GDD आग को) एक तारांकित. बी) linearized एचसीवी प्लाज्मिड पैदा करने में शामिल कदम के साथ संकेत दिया है. जेल तस्वीर में इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए तैयार Xba मैं और मूंग nuclease पाचन द्वारा उत्पादित linearized, कुंद एंडेड प्लाज्मिड DNAs को दिखाती है. 0.8% agarose जेल डीएनए को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. सी) जेल तस्वीर T7 शाही सेना पोलीमरेज़ प्रणाली का उपयोग इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा उत्पादित एचसीवी जीनोमिक RNAs दर्शाया गया है. गुम्मट: जंगली प्रकार; पीओएल-: पोलीमरेज़ बातिल; एम:मार्कर.

चित्रा 3
चित्रा 3. एचसीवी निर्माणों के विकास phenotypes का आकलन. ए) जंगली प्रकार (WT) और पोलीमर्स बातिल (पीओएल-) वायरस के जीनोम प्रतिकृति कैनेटीक्स का मूल्यांकन. RT-qPCR द्वारा मूल्यांकन भावना शाही सेना किनारा के जीनोम प्रतिलिपि संख्या बार ग्राफ में प्रस्तुत कर रहे हैं. पोल वायरस के वायरल जीनोम प्रतियां) प्रतिकृति कमी फेनोटाइप. बी संकेत है समय की अवधि में गिरावट आई जंगली प्रकार एचसीवी के सापेक्ष जीनोम प्रतिकृति स्तर पोल वायरस एचसीवी प्रोटीन अभिव्यक्ति की. सी) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण की तुलना में है. एचसीवी प्रोटीन NS3 का पता चला है और बीटा actin एक सेलुलर नियंत्रण. डी) वायरल प्रतिकृति की जांच के लिए immunofluorescence परख के रूप में प्रयोग किया जाता है. 96 घंटा बाद electroporation में कोशिकाओं तय किया गया है और आई एम एम के अधीनएचसीवी NS5A प्रोटीन और डबल असहाय शाही सेना (डी एस आरएनए), एचसीवी आरएनए प्रतिकृति मध्यवर्ती के लिए एक मार्कर के लिए unostaining. नाभिक Hoechst दाग (स्केल बार 50 माइक्रोन) के साथ कल्पना थे. एचपीटी:. घंटे बाद अभिकर्मक इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. जंगली प्रकार एचसीवी की संक्रामकता जांच और वायरस टिटर मापने. ए) भोले हं-7.5.1 कोशिकाओं को संक्रमण के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया. HCV शाही सेना की 48 और 96 घंटे बाद अभिकर्मक (एचपीटी) में एकत्र सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने के अधीन और तीन प्रतियों में एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को जोड़ा गया. 72 घंटा बाद संक्रमण, कोशिकाओं तय की और एचसीवी NS5A प्रोटीन के लिए immunostained गया. एन के साथ कोशिकाओंS5A सकारात्मक धुंधला हो जाना (लाल) वायरस से संक्रमित हैं. Foci बनाने यूनिट (FFU) का आकलन करने के लिए, उच्चतम कमजोर पड़ने पर सकारात्मक foci गिना रहे थे. छवियों के प्रतिनिधि पैनलों (स्केल बार 100 मीटर). बी) मिली लीटर प्रति FFU में मीन मूल्यों और वायरल अनुमापांक के मानक विचलन ग्राफ में दिखाया गया है दिखाए जाते हैं. पोलीमर्स अशक्त उत्परिवर्ती संक्रामक कणों का उत्पादन नहीं किया. गुम्मट: जंगली प्रकार; पीओएल-:. पोलीमरेज़ अशक्त इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. जीनोम प्रतिकृति और पत्रकार एचसीवी की संक्रामकता का मूल्यांकन. ए) intragenotype 2A कैमेरिक संवाददाता वायरस का एक कार्टून में प्रस्तुत किया है. Renilla luciferase जीन डाला infram है5'NTR और कोर. बी) जंगली प्रकार और सूचित समय पर पोल उत्परिवर्ती संवाददाता वायरस के जीनोम प्रतिकृति कैनेटीक्स बाद अभिकर्मक अंक के बीच ई ग्राफ में दिखाया गया है. प्रोटीन lysates 6 घंटा, 48 घंटा और Renilla luciferase enzymatic गतिविधि को मापने के लिए 96 घंटे का समय बिंदुओं पर काटा गया. मतलब है और प्रत्येक वायरस के लिए तीन प्रतियों Renilla luciferase मूल्यों (RLV) से गणना मानक विचलन ग्राफ. सी) पश्चिमी सोख्ता पैनल एचसीवी NS3 प्रोटीन अभिव्यक्ति से पता चलता है में प्रस्तुत कर रहे हैं. NS3 प्राथमिक एंटीबॉडी से पता चला एक गैर विशिष्ट प्रतिजन एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. जंगली प्रकार (WT) संवाददाता वायरस NS3 प्रोटीन का उच्च स्तर पैदा करता है. डी) वायरस संक्रामकता का विश्लेषण. भोले हं-7.5.1 कोशिकाओं 48 घंटा और 96 घंटा समय बिंदुओं पर ट्रांसफ़ेक्ट संस्कृति से प्राप्त सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला साथ inoculated थे. संक्रमित कोशिकाओं की Renilla luciferase गतिविधियों 48 घंटे के बाद संक्रमण में मापा गया.मानक विचलन के साथ मतलब मूल्यों ग्राफ में दिखाया गया. गुम्मट संवाददाता वायरस संक्रामकता के उच्च स्तर का प्रदर्शन किया है, जबकि पोल संवाददाता वायरस, कोशिकाओं luciferase गतिविधि की ही पृष्ठभूमि के स्तर पर था संक्रमित.

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Discussion

यह उदाहरण हेपेटाइटिस सी वायरस प्रतिकृति चक्र विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. एचसीवी एक मानव रोगज़नक़ है और निर्धारित जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन करना होगा. संक्रामक एचसीवी सेल संस्कृति सिस्टम पहले से 11-13,16,17 वर्णित किया गया है. सचित्र प्रोटोकॉल के बाद जब हम लागू कुछ महत्वपूर्ण बातें हैं. सबसे पहले, यह नीचे की ओर पढ़ाई के लिए बरकरार पूर्ण लंबाई वायरल जीनोमिक शाही सेना की अच्छी गुणवत्ता के लिए उच्च महत्व का है. वायरल सीडीएनए ले जाने इनपुट प्लाज्मिड linearized और ध्यान से पा लिया जाना है. Xba मैं अधिकता को कुंद करने के लिए नियोजित मूंग बीन nuclease एक गैर विशिष्ट nuclease है और लंबे समय तक ऊष्मायन वायरल जीनोम के 3 'अंत की क्षति या गिरावट में परिणाम होगा. nuclease फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण या आयनों विनिमय स्तंभ शुद्धि द्वारा निर्दिष्ट 30 मिनट ऊष्मायन के बाद तुरंत हटाया जाना है. डीएनए इलाज nuclease की जेल निकालना के रूप में सिफारिश नहीं की जा सकती हैएंजाइम जेल वैद्युतकणसंचलन प्रक्रिया के दौरान सक्रिय है.

इन विट्रो आरएनए प्रतिलेखन चरणों में बाद के लिए, आम तौर पर, एक भी (RNase) संदूषण ribonuclease को न्यूनतम करने के लिए व्यापक स्पेक्ट्रम सावधानियों ले जाएगा. उपयोग किए गए सभी अभिकर्मकों और सामग्री मुफ्त RNase किया जाना चाहिए. न्यूनतम शाही सेना किनारा टूट के साथ उच्च गुणवत्ता वाले जीनोमिक शाही सेना उत्पन्न करने के लिए, शाही सेना शुद्धि और नीचे की ओर से निपटने के कदमों के दौरान कठोर vortexing और दोहराया pipetting से बचने के द्वारा कम शारीरिक तनाव के अधीन करने की जरूरत है. आरएनए प्रतिलेखन के पूरा होने के बाद, इनपुट प्लास्मिड डीएनए टेम्पलेट्स DNase (RNase मुक्त) उपचार द्वारा लिखित आरएनए मिश्रण से हटाया जाना है. अधूरी हटाने ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में डीएनए प्लाज्मिड का भार में परिणाम और दोहराया वायरल शाही सेना के पूर्ण जीनोम प्रतिलिपि संख्या की मात्रा का ठहराव को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए 1 डीएनए के माइक्रोग्राम प्रति यूनिट और भी 37 पर DNase ऊष्मायन के अतिरिक्त 15 मिनट होने के एक एकाग्रता में DNase एंजाइम का उपयोग º से कर सकते हैंमदद. लिखित आरएनए फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण या आयनों विनिमय स्तंभ या तो द्वारा शुद्ध किया जा सकता है. केयर साइटोटोक्सिक और आणविक assays के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो शुद्ध शाही सेना के नमूने, को फिनोल या अन्य अभिकर्मकों के carryover से बचने के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए.

Electroporation के प्रयोजनों के लिए, शुद्ध आरएनए RNase मुक्त बाँझ पानी में भंग हो गया है. शाही सेना गोली 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूना हीटिंग, भंग करने के लिए मुश्किल है, तो मदद मिलेगी. प्रतिलेखन के पूरा होने पर, यह -80 डिग्री सेल्सियस पर RNase मुफ्त पानी में किए गए काम कर aliquots की 10 ग्राम में तुरंत शाही सेना स्टोर करने के लिए महत्वपूर्ण है aliquots के उद्देश्य दोहराया फ्रीज / पिघलना मध्यस्थता आरएनए गिरावट को रोकने के लिए है. लगातार प्रयोगात्मक परिणामों के लिए, यह एक ही समय में सभी नमूनों और नियंत्रण नक़ल करने की सिफारिश की है. उच्च गुणवत्ता शाही सेना एक उच्च वायरल अनुमापांक उपज के लिए सिफारिश की है. अभिकर्मक एजेंटों बी भी आधारित एचसीवी जीनोमिक शाही सेना, पॉलिमर और लिपिड सकते transfecting के लिएई 21,22 इस्तेमाल किया.

वायरल और मेजबान कारकों बहुत एचसीवी उपभेदों के विकास कैनेटीक्स प्रभावित करते हैं. मानव hepatoma सेल लाइन (हं-7) डेरिवेटिव हं 7.5, हं-7.5.1 और Huh7-Lunet सेल लाइनों आमतौर पर वायरल विकास 11-13,15 के मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जाता है. हं-7.5.1 कोशिकाओं में यह 21 दिनों के बाद अभिकर्मक 13,15 पर है जबकि Huh7-Lunet कोशिकाओं में JFH -1 तनाव के चरम वायरल उत्पादन, 3-4 दिनों के बाद अभिकर्मक पर है. intragenotype 2A कैमेरिक वायरस FNX-एचसीवी JFH -1 तनाव से गैर संरचनात्मक जीन होने हं-7.5.1 कोशिकाओं 19,20 में 4 दिन बाद अभिकर्मक में चोटी अनुमापांक है. इन विट्रो लिखित शाही सेना में से वायरल उत्पादन के लिए, जल्दी पारित होने के मानव hepatoma सेल लाइन पसंद किया जाता है. बीतने संख्या 20 से अधिक है ना-7.5.1 कोशिकाओं का उपयोग करते समय वायरल उत्पादन काफी कम है. Electroporation के बाद बढ़ सेल बचे रहने को सुनिश्चित करने के लिए, हुह-7.5.1 कोशिकाओं एक प्रयोग और माई के संचालन से पहले एक दो सप्ताह की अवधि के सुधार की अनुमति है thawed12% -15% FBS में ntained. इस कसौटी के साथ साथ, तुरंत electroporation के बाद 15% FBS युक्त विकास मीडिया में कोशिकाओं का मेजबान बेहतर वायरल उत्पादन के लिए अनुमति सेल अस्तित्व बढ़ जाती है. पहले 8 घंटा समय बिंदु के बाद, कोशिकाओं को फिर से 10% FBS युक्त मीडिया के लिए बंद कर रहे हैं. सेलुलर मलबे पर ले जाने के लिए कम से कम करने के लिए, वायरल संस्कृति पर तैरनेवाला 4 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से centrifugation और छानने के अधीन है. unconcentrated या केंद्रित वायरल supernatants -80 में aliquoted और जमा हो जाती है डिग्री सेल्सियस इन विट्रो और इन विवो प्रयोगों में आगे के लिए. इन सावधानियों और सुझाव सफलतापूर्वक HCV प्रतिकृति चक्र का विश्लेषण करने के लिए शोधकर्ताओं कर सकते हैं.

जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और Gaussia luciferase (gluc) की एक स्रावित फार्म के रूप में एक मार्कर जीन कि बंदरगाहों संवाददाता एचसीवी की एक और बदलाव एचसीवी अनुसंधान 18,23,24 के लिए वर्णित हैं. शोधकर्ताओं एचसीवी की जांच पर ध्यान केंद्रित के लिएजीनोम प्रतिकृति, (NS2 के लिए जीन कोर कमी) एचसीवी उप जीनोमिक replicon एक महत्वपूर्ण उपकरण 9,10 है. एचसीवी Replicons इस प्रकार कम जैव सुरक्षा नियमों और संक्रामक सेल संस्कृति एचसीवी और चिकित्सीय आइसोलेट्स की तुलना में साथ काम करने के लिए आसान की आवश्यकता होती है, गैर संक्रामक हैं. NS5B पोलीमर्स गतिविधि में कमी एचसीवी HCV प्रतिकृति चक्र 11,12 के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है. एचसीवी लिफाफा glycoproteins (Delta E1E2) की कमी, या P7-NS2 गतिविधि एचसीवी प्रविष्टि, virion morphogenesis और निकास 12,19,25-27 शामिल अध्ययन के लिए उपयोगी नियंत्रण किया जा सकता है.

सीमाओं के बारे में, वर्तमान में संक्रामक सेल संस्कृति प्रणाली केवल HCV जीनोटाइप 1 और 2 के लिए उपलब्ध है. प्रामाणिक वायरल उपभेदों की पहचान होना अभी बाकी सेल संस्कृति में कुशलता से बढ़ रही करने में सक्षम हैं कि 3-6 जीनोटाइप के हैं. Intergenotypic पुनः संयोजक वायरस विभिन्न जीनोटाइप की प्रतिकृति चक्र के अध्ययन के लिए उपयोगी विकल्प हैं. प्रतिकृति सक्षम कैमेरिक वायरस harboriजीनोटाइप 1-7 और JFH -1 जीनोटाइप 2A जीनोम से अनुक्रम के बाकी 15,18 में वर्णित किया गया से NS2 क्षेत्र के लिए एनजी कोर. एक और सीमा JFH -1 और उसके व्युत्पन्न कैमेरिक उपभेदों के वायरल उपज पोलियो और इन्फ्लूएंजा के रूप में अन्य आरएनए वायरस की तुलना में अपेक्षाकृत कम है जो 3 अक्टूबर - 6 अक्टूबर प्रति मिलीलीटर की रेंज में है. मजबूत विकास के साथ एचसीवी तनाव विकसित किए जाने की जरूरत है. भविष्य जांच शक्तिशाली antivirals की पहचान और एचसीवी संक्रमण को रोकने के लिए वैक्सीन उम्मीदवारों के विकास पर ध्यान केंद्रित करने के लिए उच्च throughput पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए संवाददाता एचसीवी का उपयोग भी शामिल है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Fisher Scientific 10-017-CV
Non essential amino acid Fisher Scientific MT25025CI
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red Life Technologies 11058-021
Huh-7.5.1 The Scripps Research Institute The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center
Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)  Cedars-Sinai Medical Center The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. 
XbaI New England Biolabs Inc. R0145S
Mung Bean Nuclease New England Biolabs Inc. M0250S
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System Promega P1320
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
Electroporation Cuvette (4 mm) Bioexpress E-5010-4
Gene Pulser Xcell Total System Bio-Rad 165-2660
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A11008
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
PVDF membrane package Bio-Rad 162-0263
Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk Bio-Rad 170-6404XTU
Tween-20 Bio-Rad 170-6531XTU
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] Abcam ab65407
Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] Abcam ab13830
Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)  Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. 115-035-003
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents  GE Healthcare Life Sciences RPN2236
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
ViiA 7 real-time PCR system Life Technologies NA
Renilla Luciferase Assay System kit Promega E2810
RNase-Free DNase Promega M6101
GloMax-Multi Detection System (Luminometer) Promega

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References

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Ren, S., Contreras, D., Arumugaswami, V. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (88), e51362, doi:10.3791/51362 (2014).

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