हेपेटाइटिस सी वायरस नकल विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल
Summary
Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.
Abstract
हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) दुनिया की आबादी का 3% को प्रभावित करता है और जीर्ण हेपेटाइटिस, सिरोसिस, और hepatocellular कार्सिनोमा सहित गंभीर जिगर की बीमारियों का कारण बनता है. एचसीवी परिवार Flaviviridae से संबंधित एक छा आरएनए वायरस है. वर्तमान उपचार पूरी तरह से प्रभावी नहीं है और प्रतिकूल दुष्प्रभाव का कारण बनता है. उपलब्ध नहीं एचसीवी टीका नहीं है. इस प्रकार, निरंतर प्रयास एक टीका और बेहतर चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक है. एक HCV सेल संस्कृति प्रणाली वायरल प्रविष्टि, जीनोम प्रतिकृति, पैकेजिंग, और निकास सहित एचसीवी विकास के विभिन्न चरणों के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. प्रस्तुत मौजूदा प्रक्रिया में, हम एक जंगली प्रकार intragenotype 2A कैमेरिक वायरस, FNX-एचसीवी, और वायरस नकल का अध्ययन करने के लिए एक Renilla luciferase संवाददाता जीन ले एक पुनः संयोजक FNX-Rluc वायरस का इस्तेमाल किया. एक मानव hepatoma सेल लाइन (हं -7 आधारित) में इन विट्रो की अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया गया था एचसीवी जीनोमिक RNAs लिखित. सेल मुक्त संस्कृति supernatants, प्रोटीन lysates और टीotal आरएनए एचसीवी विकास का आकलन करने के बाद अभिकर्मक बताते विभिन्न समय पर काटा गया. एचसीवी जीनोम प्रतिकृति स्थिति मात्रात्मक RT-पीसीआर और एचसीवी की उपस्थिति visualizing डबल असहाय शाही सेना द्वारा मूल्यांकन किया गया था. एचसीवी प्रोटीन अभिव्यक्ति एचसीवी NS3 और NS5A प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी धब्बा और immunofluorescence assays के द्वारा सत्यापित किया गया था. संस्कृति सतह पर तैरनेवाला और वायरल अनुमापांक में संक्रामक कणों जारी किया HCV शाही सेना कोशिकाओं मापा गया था. Luciferase assays संवाददाता एचसीवी की प्रतिकृति स्तर और संक्रामकता का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया. अंत में, हम HCV प्रतिकृति चक्र के विभिन्न चरणों के लिए निस्र्पक विभिन्न विषाणुजनित assays प्रस्तुत करते हैं.
Introduction
हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) सिरोसिस और लीवर कैंसर का कारण बनता है. यह 350,000 लोगों को प्रतिवर्ष 1-3 मरने के साथ दुनिया भर में 170 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है. एचसीवी 9.6 केबी के एक जीनोम आकार के साथ एक सकारात्मक किनारा आरएनए वायरस है. एचसीवी जीनोम proteolytically 10 polypeptides में विभिन्न सेलुलर और वायरल proteases से cleaved है कि ~ 3000 अमीनो एसिड के अवशेष का एक भी polyprotein के रूप में अनुवाद किया है. एचसीवी जीनस Hepacivirus में प्रोटोटाइप वायरस है और परिवार Flaviviridae 4 के अंतर्गत आता है. जोखिम पर, एचसीवी व्यक्तियों के 80% में पुराने संक्रमण स्थापित करता है. संक्रमण निदान जिगर गिरावट को रोकने के लिए चिकित्सकीय हस्तक्षेप अनुमति दे सकते हैं ज्यादातर स्पर्शोन्मुख और समय पर है. वर्तमान उपचार suboptimal है और कोई टीका 5,6 उपलब्ध है.
हेपेटाइटिस सी के एटियलजि पहली बार 1989 7 में वर्णित किया गया था. HCV प्रतिकृति अध्ययन हेपेटाइटिस सी वैक्सीन और उपचार अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह किया गया थालंबे समय से एक कुशल वायरल संस्कृति प्रणाली की कमी आड़े आती. एचसीवी के एक आणविक क्लोन intrahepatic टीका 8 पर चिम्पांजी में संक्रामक होना दिखाया गया था. बाद में, एचसीवी उप जीनोमिक replicons एक सेल संस्कृति प्रणाली 9,10 में वायरल जीनोम प्रतिकृति चरण काटना करने की अनुमति दी है, जो वर्णन किया गया है. एक जीनोटाइप 2A एचसीवी की डिस्कवरी JFH -1 (जापानी एकाएक बढ़ानेवाला हैपेटाइटिस -1) को अलग सेल संस्कृति संक्रमित करने में सक्षम HCV प्रतिकृति अनुसंधान 11-13 के लिए नए रास्ते खोल दिया. जीनोटाइप 2A तनाव JFH -1 अंतर और इंट्रा genotypic कैमेरिक वायरस और जीनोटाइप 1 HCV आधारित आधारित संक्रामक संस्कृति सिस्टम के रूप में अच्छी तरह से 14-18 उपलब्ध हैं.
हम सफलतापूर्वक प्रोटीन डोमेन और सीआईएस से अभिनय आरएनए तत्वों 19,20 के उच्च संकल्प कार्यात्मक रूपरेखा नक्शा प्राप्त करने के लिए JFH -1 तनाव और एचसीवी intragenotype 2A कैमेरिक वायरस का इस्तेमाल किया है. इस के अनुसार, यहां हम अनुमति देता है कि नियमित रूप से इस्तेमाल के लिए एक प्रभावी संस्कृति प्रणाली का वर्णनHCV प्रतिकृति चक्र और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के विभिन्न चरणों का अध्ययन. हम वायरल जीनोम प्रतिकृति और intragenotype 2A एचसीवी और एक Renilla luciferase आधारित रिपोर्टर एचसीवी की नए सिरे से संक्रामकता का आकलन करने के लिए विषाणुजनित assays प्रस्तुत करते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह उदाहरण हेपेटाइटिस सी वायरस प्रतिकृति चक्र विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. एचसीवी एक मानव रोगज़नक़ है और निर्धारित जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन करना होगा. संक्रामक एचसीवी स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Non essential amino acid | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red | Life Technologies | 11058-021 | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center | |
| Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null) | Cedars-Sinai Medical Center | The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides. | |
| XbaI | New England Biolabs Inc. | R0145S | |
| Mung Bean Nuclease | New England Biolabs Inc. | M0250S | |
| T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Electroporation Cuvette (4 mm) | Bioexpress | E-5010-4 | |
| Gene Pulser Xcell Total System | Bio-Rad | 165-2660 | |
| mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 | |
| PVDF membrane package | Bio-Rad | 162-0263 | |
| Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 170-6531XTU | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2] | Abcam | ab65407 | |
| Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23] | Abcam | ab13830 | |
| Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-035-003 | |
| Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents | GE Healthcare Life Sciences | RPN2236 | |
| SUPERSCRIPT III RT | Life Technologies | 18080085 | |
| SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX | Life Technologies | 11744500 | |
| ViiA 7 real-time PCR system | Life Technologies | NA | |
| Renilla Luciferase Assay System kit | Promega | E2810 | |
| RNase-Free DNase | Promega | M6101 | |
| GloMax-Multi Detection System (Luminometer) | Promega |
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