Summary
Due fotoni di imaging, accoppiato ad nanodissection laser, sono strumenti utili per studiare processi degenerativi e rigenerativi nel sistema nervoso centrale con risoluzione subcellulare. Questo protocollo viene illustrato come etichetta, immagine e sezionare singole fibre di arrampicata nella corteccia cerebellare in vivo.
Introduction
Transezione assonale derivanti da lesioni meccaniche, insulto tossico o malattie neurodegenerative è di solito seguita da degenerazione della parte distale dell'assone che si stacca dal corpo cellulare 10-13. Con poche eccezioni 2,7,14,15, assoni mozzate nel sistema nervoso centrale degli animali adulti di solito sono in grado di attivare un programma di ricrescita 16.
Poco si sa circa le dinamiche in tempo reale di eventi degenerativi a livello cellulare e subcellulare. Lo sviluppo di nuove strategie per limitare il danno neuronale e promuovere la ricrescita neuronale richiede, come primo passo, chiarire il meccanismo con cui le cellule neuronali singolarmente feriti degenerano e rigenerano. Questo studio è più direttamente indirizzata monitorando le dinamiche di un singolo neurone in vivo. Mentre le tecniche di un fotone di imaging di fluorescenza sono limitati dalla intensa diffusione della luce visibile, eccitazione a due fotoni raggiunge profondi strati corticali in live mouse con subcellulare risoluzione di 3,4,17. Approfittando di topi transgenici in cui proteine fluorescenti sono selettivamente espressi in sottopopolazioni di neuroni 18-20, microscopia TPF è stato applicato alla esplorazione di plasticità sinaptica e allungamento assonale durante lo sviluppo in vivo 21,22. L a capacità di neuroni singolarmente danneggiate ricrescere dopo l'infortunio può essere indagata mediante accoppiamento nel monitoraggio vivo da due fotoni di imaging con un modello di danno specificamente mirato al assone di interesse. Assorbimento multi-fotone di impulsi a femtosecondi è stato usato per distruggere singoli dendriti o anche singole spine 5,23. Inoltre, questo paradigma lesioni permette di tagliare rami singoli assonale senza interrompere il dendrite contattando 6. Nel contesto di sezionare le caratteristiche che permettono specifica popolazione neuronale per rigenerare i loro assoni, le fibre di arrampicata cerebellari una volta danneggiati (CFS) sono un modello SI utilence conservano notevoli proprietà plastiche dopo l'infortunio anche negli animali adulti 24,25. Recentemente, imaging a lungo termine di CFS ha mostrato che questi assoni sono in grado di ricrescita nei giorni successivi assotomia laser 6.
Questo protocollo descrive come etichettare i neuroni olivocerebellar e il loro allungamento assonale attraverso anterograda tracing. Una volta che i neuroni di interesse sono fluorescente, possono essere monitorati ripetutamente in momenti arbitrari per settimane o mesi in una finestra del cranio. La procedura di sezionare singoli rami assonali da assotomia laser in vivo verrà illustrato.
Le tecniche qui presentate offrono nuove intuizioni nel meccanismo di rimodellamento assonale in vivo e possono aiutare lo sviluppo di strategie terapeutiche per limitare la degenerazione neuronale e promuovere la ricrescita assonale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etichettatura assonale
- Fibre rampicanti possono essere etichettati iniettando né coloranti organici coniugati con destrano ad alto peso molecolare o plasmidici / virus che inducono l'espressione di proteine fluorescenti 26-29. In questo protocollo, il colorante organico Alexa Fluor destrano 488 viene iniettato nel oliva inferiore per etichettare fibre rampicanti e visualizzarli nella corteccia cerebellare (Figura 1). Tutte le procedure descritte qui sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano.
- Preparare il tubo capillare di vetro tirandolo su un estrattore micropipetta. Tagliare la punta del tubo capillare di vetro con le forbici fino al diametro esterno è di circa 30 micron.
- Caricare il capillare con 1-2 ml di colorante destrano coniugato.
- Prima di iniziare, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave. Durante la procedura, ridurre i rischi di contaminazione utilizzando uno sterilizzatore perle di vetro.
- Anestetizzare il mouse (9-12settimane) mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (9 mg / kg). Assicurarsi che l'animale è completamente sedato con coda e / o pizzichi punta. Utilizzare veterinario unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Radersi i peli sopra il collo sia con una lama di rasoio o crema depilatoria. Disinfettare il sito chirurgico due volte con betadine, alternati con etanolo al 70%.
- Posizionare il mouse su un supporto stereotassico. Tenere il caldo animale con una piastra elettrica.
- Spingere delicatamente le earbars osso accanto alle orecchie in modo che la testa è tenuto saldamente. Ruotare la testa a formare un angolo di 140 ° con il corpo. L'orientamento desiderato può essere ottenuta modificando leggermente l'altezza dell'asta titolare naso sul supporto stereotassica.
- Applicare alcune gocce di lidocaina sulla pelle tra le orecchie. Usare pinze o una lama di rasoio per effettuare una incisione verticale di circa 1 cm sulla pelle sotto all'occipite.
- Separare delicatamente il tessuto sottocutaneo e muscoli pinzetta smussatas sotto il microscopio di dissezione. Spingere verso il basso il fascio muscolare orizzontale e tenere a parte i due muscoli verticali fascicoli al fine di esporre la dura sopra il forame magno.
- Usare estrema cautela, sezionare la dura con un ago da siringa o pinze molto affilati per esporre il tronco encefalico. Una piccola quantità di liquido cerebro-spinale potrebbe fuoriuscire quando la dura è stato tagliato.
- Sulla micromanipolatore stereotassica, ruotare il titolare del capillare 45 ° rispetto alla verticale. Posizionare il capillare nella linea mediana, nel punto mediano tra il bordo caudale della corteccia cerebellare e la prima vertebra cervicale. Inserire la pipetta ad una profondità di 2 mm dalla superficie.
- Fornire un volume di 0,5-1,5 ml di tintura su 10-15 min. Un sistema di erogazione microiniezione consente l'erogazione controllata pressione del liquido nel capillare (pressione Pulse = 20 psi; durata dell'impulso = 3-4 msec; frequenza di impulsi consegna = 12 Hz).
- Lasciare il capillare in vigore per 15 minuti, poi slowly (in 2-3 min) rimuoverlo. Delicatamente riallineare i muscoli e suturare la pelle sopra. Tenere i muscoli ben idratata applicando alcune salina durante l'intera procedura.
- Per evitare la disidratazione, iniettare per via sottocutanea 0,5 ml di NaCl allo 0,9%. Tenere l'animale in una gabbia riscaldata fino al pieno recupero dall'anestesia.
- Sottocutanea amministrare Carprofen (5 mg / kg) al giorno per 2-3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
2. Finestra ottica sulla cerebellare Cortex
NOTA: Il colorante viene trasportato in 2 settimane a partire dal olivary nucleo inferiore fino alla corteccia cerebellare ai terminali CFS (vedere Figura 1). CFS scarsamente etichettati possono essere visualizzati sotto la finestra cranica permanente che può essere eseguita come segue:
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici.
- Anestetizzare il mouse come descritto sopra. Utilizzare pizzichi punta per controllare l'animale è completamente sedato.
- Radersi i capelli sopra la testa, pulire la skcon alternanza di colpi di 70% di alcol e betadine e applicare pomate oftalmiche. Posizionare il mouse in un frame stereotassico e posizionare le barre di orecchio in modo da tenere saldamente la testa.
- Sottocutanea somministrare desametasone (0,2 mg / kg) e Carprofene (5 mg / kg) per prevenire il gonfiore del cervello e possibili infiammazioni al sito finestra cranica.
- Applicare una goccia di lidocaina sulla pelle sopra il cranio e tagliare un lembo, da tra le orecchie sopra gli occhi. Applicare una soluzione di lidocaina nuovamente sul periostio prima raschiando con un bisturi.
- Utilizzare il trapano dentistico per assottigliare una zona semicircolare del teschio di sopra del cervelletto. La finestra è di solito posto centrale e verso la sutura posteriore, in modo che la profondità cranio è pressoché costante per tutto il perimetro del semicerchio. Posizionando la finestra troppo vicino alla sutura lambda e foratura ripetitivo in questa regione molto spessa può causare il surriscaldamento del cervello e formazione di edemi.
- Applicare emostaticospugna sul cranio in caso di sanguinamento.
- Tagliare il coprioggetti in due metà con l'aiuto di una lama di rasoio e pinzette. Controllare che il coprioggetti è leggermente più grande della isola di osso ed ha una forma simile prima di rimuovere il lembo di osso con la pinzetta; se non, rimodellare il coverglass o scegliere un altro. Non toccare la dura madre con le pinzette mentre si disegna l'osso. Adagiare il coverglass sulla dura. NOTA: L'aderenza di tutta la superficie del vetro dalla durata è predicendo di lunghe finestre cranici durata.
- Rimuovere le bolle d'aria sotto la lente ripetutamente risciacquo con soluzione salina e asciugatura con bastoncini di cotone. Questo aiuterà anche a rimuovere alcuni residui di sangue che può riversarsi fuori dai piccoli capillari dopo il posizionamento del vetro. Sigillare la finestra con una miscela di colla acrilica e cemento dentale 30.
- Tenere l'animale su una piastra elettrica in una camera di recupero fino alla completa guarigione dall'anestesia. Non riutilizzaregirare topi in gabbia a casa fino alla completa guarigione; non lasciarli incustoditi fino a quando ripresero conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
- Sottocutanea amministrare Carprofen (5 mg / kg) al giorno per 2-3 giorni dopo l'intervento chirurgico.
3. In Vivo multi-fotone laser assotomia
- Aspettare 2-7 giorni da un intervento chirurgico prima di eseguire la prima sessione di imaging. L'personalizzato costruito microscopio a due fotoni usato qui è fornito di un Ti: zaffiro sorgente laser (120 fs di larghezza, 90 MHz frequenza di ripetizione) che viene prima acquisito da una coppia di specchi galvanometrici quindi focalizzato sul campione da una immersione in acqua 20X Obiettivo (NA 0.95, WD 2 mm). Una fase piezoelettrico a circuito chiuso esegue spostamenti assiali fino a 400 micron dell'obiettivo. Tubi fotomoltiplicatori raccolgono il segnale di fluorescenza.
- Anestetizzare l'animale, poi posizionare la testina nel supporto stereotassica modo che la finestra cranica pone parallelo al obiettive piano focale.
- Esplorare con TPF di imaging corteccia sotto la finestra cranica. Scegliere l'assone di essere danneggiati tra quelli più brillanti.
- Acquisire una Z-stack (solitamente il campo visivo è di 100 x 100 micron 2, a 512 x 512 pixel, 2 micron passo asse z) per ottenere un 3D-ricostruzioni del assone mirato. All'interno del volume illustrato, scegliere il sito della lesione assonale su un ramo che si trova principalmente parallelo al piano focale. Questo orientamento consente di segnare rapidamente cambiamenti morfologici, che sono predittivi di una dissezione di successo.
- Irradiare con un'alta dose di energia nel punto selezionato una porzione distale di un CF. Questo viene fatto attraverso il software Labview: aumentare la potenza del laser 5-10x potenza superiore a quella utilizzata per l'imaging (≈ 300 mW, misurata dopo la lente obiettivo), impostare la posizione degli specchi galvanometrici per fare una scansione linea (~ 4 - 10 micron) sul sito della lesione e aprire l'otturatore laser per 400-600 msec. Orientare la linea di scansioneperpendicolare al piano CF transezione completamente l'assone. Irradiando macchie luminose (ad es., Varici), di solito aiuta a sezionare l'assone. La lunghezza d'onda per assotomia laser è la stessa utilizzata per l'imaging (920 nm).
- Solitamente la fluorescenza dell'assone nella zona irradiata riduce transitoriamente causa photobleaching. Acquisire una pila di stessa regione pochi minuti dopo l'irradiazione di garantire l'ablazione è stata ben eseguita. Se la regione ha iniziato il gonfiore e l'assone formata strutture branello-like, il neurone è stato sezionato con successo. In questo caso, in poche ore (da poche decine di minuti a 24 ore) la porzione distale dell'assone degenerare e scomparire completamente.
- Purtroppo la dose di energia necessaria per produrre una assotomia completo non è sempre prevedibile. Se l'unico risultato dell'irraggiamento è Fotodecolorazione, la fluorescenza deve essere rapidamente recuperate grazie per tingere diffusione, e l'irradiazione deve essere ripetuto nuovamente efficacely sezionare l'assone. Inoltre, in caso segni di gonfiore non compaiono entro 5 - 20 minuti, o il gonfiore è seguito da recupero (. Analogamente a quanto descritto per dendrotomy laser, vedere Allegra Mascaro et al 23) Prova di nuovo con nuove scansioni aumentando la tempo di permanenza e / o la potenza del laser.
- Controllare l'eventuale rimodellamento dell'assone nei giorni seguenti al assotomia laser con due fotoni imaging in vivo (figure 2 e 3). Il pattern vascolare è utilizzato come modello di riferimento per recuperare l'assone sezionato nei giorni successivi.
- Sottocutanea amministrare Carprofen (5 mg / kg) ogni sessione di imaging per tutta la durata dell'esperimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo protocollo descritto come eseguire etichettatura assonale, imaging in vivo e assotomia laser su singoli neuroni. La linea temporale dell'esperimento è mostrato in Figura 1.
Un esempio di CF marcati con Alexa Fluor 488 destrano e visualizzati sotto la finestra cranica in vivo microscopia a due fotoni è riportato in Figura 2. Come precedentemente riportato 6,27, i rami ascendenti mostrano una elevata stabilità durante il periodo di osservazione di diversi giorni .
La Figura 3 mostra un esempio di tranciamento assonale con laser assotomia di un singolo ramo di un CF. Come precedentemente descritto, il danno è stato eseguito irradiando un ramo distale (~ 30 micron sotto la pia) di un CF con una dose elevata energia di luce infrarossa. Come mostrato nel secondo pannello di figura 3, 15 min dopo irradiazione laser porzione distale dell'assone iniziato gonfiore e degenevalutazione. Il giorno dopo, la porzione distale dell'assone al sito della lesione scomparve completamente (figura 3, D17). La porzione degenerato è evidenziato dalle frecce rosse nel corso del tempo. Le ultime due pannelli mostrano anche la progressiva formazione di un nuovo ramo trasversale (freccia verde) dal assone feriti (maggiori dettagli sulla germinazione di nuove filiali dopo assotomia laser in vivo possono essere trovati in 6).
Figura 1. Temporale dell'esperimento nanochirurgia laser. Dopo l'iniezione nel olivary nucleo inferiore, due settimane di recupero consentirà la anterograda destrano coniugato colorante per etichettare le fibre rampicanti. La corteccia cerebellare è quindi esposto eseguendo una finestra del cranio permanente. Dal 2-7 in seguito, CFS etichettati possono essere esposte sotto il MICR due fotonioscope in vivo ad intervalli di tempo arbitrari. Il nanochirurgia laser sulle assoni etichettati può essere eseguita in qualsiasi momento dopo la finestra del cranio è stato impiantato.
Etichettatura fibre rampicanti Figura 2.. Il pannello di sinistra mostra un esempio di una CF marcato con Alexa Fluor 488 destrano e visualizzati in vivo mediante microscopia TPF. Pannelli a destra visualizzano immagini time-lapse della stessa CF dal giorno 16 (d16) per D18. Barra della scala, 10 micron.
Figura 3. Assotomia laser su un singolo ramo di una fibra di arrampicata. Il neurone è stato irradiato in cui la freccia rossa sulla d16. Frecce rosse highlight la scomparsa della porzione distale dell'assone dopo laser assotomia (D18). Un ramo trasversale, di recente formazione è sottolineato dalla freccia verde. Barra della scala, 10 micron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo mostra come etichettare neuroni dell'oliva inferiore con un colorante fluorescente. Successivamente, il metodo per eseguire una finestra del cranio sulla corteccia cerebellare è descritto. Questa tecnica fornisce accesso ottico alla porzione terminale dei neuroni olivocerebellar, le fibre rampicanti. Purtroppo, il risultato sia di etichettatura e chirurgia craniotomia è piuttosto basso anche nelle mani di operatori specializzati (di solito 1 su 3 topi è etichettato, e 1 su 3 finestre cranici resta chiaro dopo 1-2 settimane).
La procedura per eseguire assotomia laser in topi vivi viene quindi presentato. Questo metodo permette di sezionare i neuroni fluorescenti siti mirati. Mentre paradigmi lesioni comunemente utilizzati, sia per rottura meccanica o l'uso di sostanze chimiche, causano enormi disagi del tessuto cerebrale, il punto di forza di questo modello è l'alta confinamento spaziale e specificità. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che singole spine possono essere ablazione risparmiando tegli integrità strutturale del dendrite genitore 5; inoltre, singole succursali assonale possono essere disturbate evitando la formazione di una cicatrice gliale persistente 6. Il processo di degenerazione può essere poi seguito in tempo reale, nonché eventuale rimodellamento del neurone feriti. Questo metodo è quindi un potente strumento per studiare il meccanismo di base della assonale plasticità strutturale in vivo.
La possibilità di sezionare strutture selezionate dipende in prima approssimazione della profondità della struttura e della sua intensità di emissione di fluorescenza. Sebbene microscopia a due fotoni permette neuroni di imaging fino a 600-800 micron profondo, abbiamo trovato che la nanochirurgia è limitata ai primi strati della corteccia (fino a 300 mm).
In questo laser assotomia protocollo era destinata alle fibre arrampicata cerebellari, ma può essere utilizzato per analizzare qualsiasi fluorescente struttura in cervello vivo. Irradiazione laser è stato utilizzato per sezionare singolo ce neuronalell enti, rami dendritici, assoni o singoli spine di GFP-etichettata neuroni piramidali della corteccia di topi transgenici 5,8,9,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fsec width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, hemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
References
- Strata, P., Rossi, F.
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P.
- Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 Forthcoming.
- Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Luo, L., O'Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
- Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
- Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
- Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
- Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F.
- Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P.
- Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
- Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
- Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
- Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).
