Био-слой интерферометрии для измерения кинетики белок-белковых взаимодействий и аллостерические лиганда Effects

Summary

Протоколы здесь описать кинетические анализы белок-белковых взаимодействий с Био-слоя интерферометрии. АТФ-синтаза F-Тип, который участвует в энергетическом обмене сотового, может быть запрещена по его ε-субъединицы у бактерий. Мы адаптировали Био-слоя интерферометрии для изучения взаимодействия каталитического комплекса с ингибиторной С-концевого домена ε в.

Abstract

Мы описали использование био-слоя интерферометрии для изучения ингибирующие взаимодействия субъединицы ε с каталитического комплекса кишечной палочки АТФ-синтазы. Бактериальный F-типа СПС синтазы является целью новой, FDA утвержденных антибиотика по борьбе с лекарственно-устойчивым туберкулезом. Понимание бактерии конкретные авто-ингибирование АТФ-синтазы в С-концевого домена субъединицы ε может обеспечить новые средства для целевой фермент для открытия антибактериальных препаратов. C-концевой домен ε претерпевает драматические конформационные изменения, когда фермент переходы между активными и неактивными государств, и лигандов каталитического-сайте может влиять, какие из конформации ε является преобладающим. В анализе измеряют кинетика связывания / диссоциации ε в с каталитического комплекса, так и косвенно измередавлениях сдвиг фермента с привязкой ε и из по-видимому, nondissociable тормозного конформации. Интерферометрии сигнал Био-слой не чрезмерно чувствительны к состава раствора, поэтому он также может быть использован для мониторинга аллостерические эффекты лигандов каталитического-сайте по конформационных изменений ε в.

Introduction

Белок-белковые взаимодействия важны для многих биологических процессах, и метка свободной оптические методы, такие как поверхностного плазмонного резонанса (SPR) были использованы в пробирке для исследования кинетики связывания и диссоциации ^1. Большинство этикеток без методы иммобилизации один биомолекулы на поверхности датчика и использовать оптический сигнал для обнаружения связывающего партнера из раствора, как это связывает с иммобилизованным биомолекулы ^1. В то время как SPR является высоко чувствительным методом, он склонен к помехам из-за изменений показателя преломления раствора, протекающего через датчик ^2. Хотя это и не так чувствительны, как SPR, Био-слоя интерферометрии (BLI) менее подвержен влиянию изменений в образец композиции ^1,3. BLI использует волоконно-оптические биосенсоры, которые имеют собственный биосовместимого покрытия на кончике. Система, используемая здесь (Октет-RED96) содержит восемь спектрофотометры. Белый свет подается по трубам к ряду зондов, которые перемещаются на робота-манипулятора. Оптоволоконные датчики арэ подхвачена зондов и переехал в 96-луночный планшет с образцами. Одна из молекул-мишеней иммобилизуют на поверхности биосенсора. Тогда датчики перемещаются в лунки, содержащие привязки партнера в растворе. BLI контролирует ассоциацию связывающим партнером с иммобилизованным молекулы, а затем контролирует диссоциации после переезда датчиков к решению без обязательного партнера. Связывание молекул на поверхность биосенсора приводит к изменению оптической интерференции между световыми волнами, которые отражают обратно в спектрофотометров от внутренней поверхности и от внешнего интерфейса между датчиком и раствора. Эти изменения в помех может быть количественно и используется для определения кинетические показатели связывания и диссоциации, как показано в анимации, показанной на фиг.1.

Мы применили BLI измерить взаимодействие между каталитического комплекса бактериальной АТФ-синтазы и его ε-субъединицы, которая может автоматически ингибируют фермент. АТФ сиnthase является мембрана встраиваемый поворотный наномотор, который катализирует синтез и гидролиз АТФ ^4. Каталитический комплекс (F ₁₎ может быть выделено в растворимой форме, который работает в качестве АТФазы. Субъединицы ε имеет два домена: N-концевой домен (NTD) необходим для правильного монтажа и функциональной соединение фермента, но не взаимодействует непосредственно с каталитическими подразделений; С-концевой домен (CTD) может ингибировать фермент, взаимодействуя с несколько каталитические субъединицы ^5,6. Эта норма ε-опосредованной специфичен для бактериальных АТФ-синтазы и не наблюдается в митохондриальной гомолога. АТФ-синтаза стала мишенью для антибактериальных препаратов, как показывает недавнее утверждение FDA из bedaquiline для лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза ^7. Таким образом, таргетинг тормозящее роль ε не соответствует лекарственных препаратов может дать антибактериальные, которые не угнетают митохондриальную АТФ-синтазы. С изолированной каталитического комплекса (F _1), εстановится разъединимый субъединицы. Тем не менее, с ε, связанного с F _1, εCTD может пройти значительное конформационные изменения, частично вставки в центральной полости фермента и формирование тормозное состояние, который вряд ли отделить непосредственно ^6,8. Мы используем BLI для измерения кинетики F ₁ / ε связывания и диссоциации, так и косвенно, изучить аллостерические эффекты каталитического сайт лигандов на конформации ε в.

В нашей системе ε была выбрана для иммобилизации на поверхности датчика с сигналом BLI (например, SPR) чувствителен к массе молекул связывания на поверхности. Ε-субъединица является малым (~ 15 кДа) относительно основного F ₁ комплекса (~ 347 кДа). Таким образом, большее сигнал BLI будет результатом связывания F ₁ с иммобилизованным ε. В целях мониторинга F ₁ диссоциации, которая может быть очень медленным, ε должны сильно обездвижен. Таким образом, мы приняли решение biotinylateИ иммобилизации его на покрытых стрептавидином биосенсоров. Белки могут быть биотинилированного по формуле (I) случайной модификации поверхностных лизина ^9, (II) реакции уникальной собственном или инженерии цистеина с биотин-малеимид реагента ¹⁰ или (III) генетически добавление определенного биотин-акцепторных пептид, который ферментативно биотинилированного в течение в естественных условиях экспрессии меченых белков ^11. В нашей системе ε биотинилируют методом (III) ^8. После того, как биотин-меченый ε обездвижен на датчики стрептавидином, BLI может измерить связывание и диссоциация F _1, который был обедненный субъединицы ε (F ₁ (-ε)). Для экспериментов, описанных здесь, предварительные анализы были сделаны, чтобы определить разумные объемы биотинилированной белка для иммобилизации на датчиках. Это может варьироваться в зависимости от молекулярной массы белка и его партнером по связыванию, но цель состоит в том, чтобы определить минимальное количество иммобилизованным белком тшапка обеспечивает (I) приемлемый сигнал-шум для связывания кинетики с низкой концентрацией партнером по связыванию (ниже K _D) и (II) минимальным искажением кинетику связывания с почти насыщение концентрации партнером по связыванию. Кроме того, стехиометрия биотинилирования могут различаться (но избежать> 1 моль биотин / моль белка), так что некоторые начальная анализа могут быть необходимы для каждого нового большого количества биотинилированного белка для подтверждения, что последовательный сигнал BLI может быть достигнуто в течение иммобилизации на покрытых стрептавидином датчики.

Protocol

1. Программирование прибора к Пробирной BLI

Включите инструмент, по крайней мере один час в заранее дайте лампе прогреться, это необходимо, чтобы минимизировать шум и дрейф в оптический сигнал во время эксперимента. Установите требуемую температуру через вкладку приборной prewarm образца держатель пластин. Затем установите опытно-конструкторских в программном обеспечении сбора данных. Выберите "Новый Kinetics эксперимент» в вкладке Мастер эксперимента. Это представляет вкладками меню со всеми шагами, которые должны быть определены.

1.1. Тарелка Определение

Определение столбцов, которые будут использоваться на образце 96-луночного планшета. Связать столбцов, содержащих буфер, иммобилизованного белка или связывающего партнера. Для каждой ассоциации также ввести концентрацию св зывающегос партнера, который будет использоваться. Примечание: определение пластины показано на рисунке 2 имеет опции для различных анализов.

1.2. Анализ Определение

ontent "> Define все шаги, необходимые для анализа. ним относятся (I) Baseline (несколько), (II) Загрузка, (III) Ассоциации и (IV) диссоциация связывания партнера. Тогда, как описано ниже, ссылаются отдельные шаги анализа с колонны скважин на образец стекла выбрав шаг анализа, а затем двойным щелчком по соответствующей колонке. Это программы датчики должны быть перемещены из одной колонки скважин на следующий во время теста.

1. Базовая линия
   Начните с краткого базового стадии (≥ 60 сек), с датчиками в буфере для анализа (рис. 2, колонка 1), чтобы установить начальные сигналы BLI в 96-луночный планшет.
2. Загрузка (иммобилизации биотинилированного белка на датчиками)
   Связать датчики для скважин, которые будут содержать биотинилированного белка (рис. 2, столбец 2). Используйте пороговую функцию для достижения заданного уровня связывания (см. введение). Установите пороговое опцию, чтобы все датчики будут двигатьсяD к следующей колонке скважин, когда один из датчиков достигает порога.
3. Базовая линия
   Включите другой базовый шаг в буфере (рис. 2, столбец 3; обычно> 5 мин), чтобы смыть nonimmobilized биотинилированных белков от датчиков и установить новые, стабильные базовые сигналы. Для основных связывания / диссоциации анализов только (как на рисунке 3), включают в себя дополнительный базовый этап (60 сек) с датчиками в новых скважин буфера (рис. 2, столбец 4) перед стадией ассоциации.
4. Association (от партнера по связыванию с иммобилизованным белком)
   Для основного связывания / диссоциации анализа (как на рисунке 3), выбрать диапазон концентраций связывающего партнера, которые будут использоваться для различных датчиков / скважин (рис. 2, столбец 5). Отрегулируйте время шага, так что по крайней мере насыщающей концентрацией связывающим партнером должны подходить равновесия связывания сигнал. Дляанализ, чтобы проверить аллостерические эффекты малых лигандов на диссоциации белок-белкового комплекса (как на рисунке 5), выбрать один высокую концентрацию связывающего партнера (~ 10 раз выше расчетной K _D) для использования во всех ассоциации скважин.
5. Диссоциация (связывающего партнера)
   Для основного связывания / диссоциации анализа только (как на рисунке 3), обозначения датчиков, чтобы вернуться в колонке 4 (рис. 2), и тот же буфер скважин, которые использовались для дополнительного базового перед Ассоциацией. Для анализа, чтобы проверить аллостерические эффекты малых лигандов, вместо обозначения датчиков, чтобы перейти к колонке 6 (рис. 2), где каждую лунку может содержать буфер плюс различные аллостерические лигандов.

1.3. Датчик Назначение

Укажите расположение в лотке датчика, который будет содержать prewetted датчики для анализа. Определить пустые позиции, так как эксперимент будет FAIл, если нет датчики не взял.

1.4. Обзор Эксперимент

Представьте все запланированные действия, чтобы проверить на наличие ошибок и вернуться, чтобы исправить их.

1.5. Запустите эксперимент

Введите необходимые детали, в том числе расположение файлов данных. Введите желаемую температуру для эксперимента. Если датчики по-прежнему требуют предварительное увлажнение, выберите опцию задержать началом эксперимента. Наконец, когда все пробоподготовки завершена (шаг 2) и оба образца пластины и лоток датчик загружаются в прибор, нажмите кнопку Go, чтобы запустить анализ.

2. Подготовка образцов

1. Подготовка соответствующего буфера для анализа. Буфер используется для экспериментов, представленных на рисунках 3 и 5: 20 мМ MOPS (3 - (N-морфолино) пропансульфокислота), Трис (трис (гидроксиметил)-амино-метана) (для доведения рН до 8,0), 50 мМ KCl. Включите BSA (бычий сывороточный альбумин, жирных кислот бесплатно, 0,5мг / мл окончательный) в буфере для анализа всех этапах и во всех разведений биотинилированного белка или партнером по связыванию для минимизации неспецифического связывания белков с датчиками.
2. Развести биотинилированный белок (ε) в буфере для анализа до соответствующей концентрации (см. введение).
3. Приготовить разведения связывающим партнером (F ₁ (-ε)) в буфере для анализа (см. Обсуждение для диапазона концентраций для использования).
4. Предварительно смочите Стрептавидин покрытием датчики для по крайней мере 10 минут для удаления их защитной сахарозы покрытие. Снимите датчик содержащих стойку из лотка датчика и вставить 96-луночный планшет с в нижней части лотка, раздвижные один угол пластины в ориентировочной выемкой на подносе. Для столбец датчиков, которые будут использоваться, добавьте 200 мкл буфера для анализа на лунку в этом столбце 96-луночный планшет. Вернуться стойку датчиков к лотку в правильной ориентации (с вкладками в слотах).
5. По поручению во время программирования в шаге 1, заполнить скважин ое образец пластина с буфером для анализа или соответствующих разведений белка, как показано на рисунке 2. Избегайте введения пузыри, так как они могут вызвать шум в оптический сигнал. Включают один или более опорных скважин, которые не задавать (I) биотинилированного белка или (II) св зывающегос партнера.
6. Откройте дверцу прибора и вставьте лоток датчика на сцену (слева), с вкладками в лотке, вставленных в пазы сцене. Вставьте образец пластины в держателе (справа); убедитесь, что пластины сидит плоской и в правильной ориентации, как указано на держателе. Закройте дверь и начали проводить анализ из программы сбора данных (шаг 1.5).

3. Обработка данных

1. После анализа побежал, откройте программное обеспечение анализа данных и загрузите папку, содержащую данные. Перейдите на вкладку "Обработка", чтобы увидеть поэтапного меню обработки (слева) и необработанные кинетические данные, с каждого датчика (АГ) назначен другой цвет (см.Рисунок 3).
2. В разделе "Выбор данных", нажмите кнопку "Выбор датчика". На "Образец плиты карты», обозначения лунок для 1 или 2 датчиков контроля (G, H в анализе рисунке 3) как опорных скважин. В меню обработки, установите флажок "вычитание" и выберите "Reference Уэллс" вычесть опорного сигнала (одно-или усредненную) от сигнала любой другой датчика.
3. Совместите все следы, чтобы Y = 0, используя шаг "Выровнять Ось Y". Выберите "Базовая линия" в качестве шага выравнивания (проведение этой последней базовой перед стадией Association). Для "Time Range", введите последний 10 сек этого исследования (т.е. 50-60 сек для 60-сек базовой линии, как показано на рисунке 3).
4. Установите флажок "Интер-шаг Коррекция", чтобы минимизировать сигнала сдвиги между шагов ассоциации и диссоциации. Выберите выровнять по базовой линии или диссоциации.
5. Выберите функцию фильтрации Савицкого-Голея в большинстве случаев и нажмите "обрабатывать данные!" , чтобы продолжить. Осмотритеокончательные обработанные данные (нижняя правая панель). С анализов, предназначенных для глобального анализа данных (как на рисунке 4), если сигнал следы показывают значительный сдвиг между Ассоциацией и шаги диссоциации, изменить выбор диссоциации или базовый уровень для "Интер-ступенчатой ​​коррекции" и перерабатывать данные, прежде чем приступить к данным Анализ.

4. Анализ данных

Перейдите на вкладку "Анализ" в анализе данных, чтобы начать. Примечание: пример шаги ниже для глобального анализа множества кривых связывания / диссоциации (как показано на рисунке 3).

1. Для "Шаг к Анализ", выберите ассоциации и диссоциации. Для "Модели" выберите 1:1. Примечание: другие ограниченные варианты.
2. Для "Место", выберите Глобальная (Full). Для "Группировка по" выберите цвет (как на графике). Выберите "R _макс несвязанных по датчику", чтобы позволить независимую установку R _макс (максимальная ответный сигнал на насыщая связывания наравнеtner с иммобилизованным белком). Примечание: мы делаем это для большинства анализов, а датчики незначительно отличаться в размере белка, иммобилизованного (см. рисунок 3, загрузка).
3. На столе, показанной, убедитесь, что все следы датчик для анализа имеют тот же цвет, так что они будут проанализированы в качестве глобального набора. При необходимости выберите один или несколько датчиков отслеживает, чтобы исключить из глобального фитинга: в столбце "Включить", щелкните правой кнопкой мыши на нужную позицию датчика и выберите "Исключить Уэллс".
4. Нажмите кнопку "Fit Curves!" чтобы начать нелинейного регрессионного анализа. Изучите подходящие результаты, которые включают (I) наложение кривых регрессии со следами данных датчиков (как на рисунке 4), (II) земельные фитинговых остатков и (III) таблицу с определенными значениями параметров (констант скоростей, R _{Макс, KD)} и статистика (стандартные ошибки для параметров, ^{хи-квадрат,} R2).
5. В разделе "Data Export", сохранить подходящие результаты, нажав кнопку "Экспорт таблицы в. CSV-файла". Для GRAPХин или дальнейший анализ данных / оснащенных кривых с другим программным обеспечением, нажмите кнопку "Экспорт Подгонка результаты", чтобы сохранить данные каждого сенсора и оборудованы кривую в текстовом файле.

Representative Results

Связывания в режиме реального времени и диссоциация BLI кинетика показано на рисунке 3. Этот эксперимент был проведен с буфером для анализа в ассоциации и диссоциации. Этот эксперимент был начат с базовым шагом 10 мин, так как датчики были Предварительно смочите лишь вкратце. Далее, биотинилированный ε наносили на датчиками. Нет обнаруживается диссоциация ε не произошло на протяжении всех оставшихся шагов, как видно из эталонной кривой (G), который имел не связывающий партнер не добавлено. Второй эталонный датчик (H) была лишена иммобилизованным белком и показал низкий неспецифическое связывание связывающего партнера. Различные концентрации F ₁ (-ε) были использованы на стадии ассоциации для датчиков АФ, чтобы соответствовать результаты на глобальном уровне и получить лучшие значения для K _A, K _D и K _D. Результаты были обработаны как в протоколе, уступая следы данных (синие) на рисунке 4. В этом случае эталонный датчик след H вычитали из образца тртузы для коррекции неспецифического связывания связывающего партнеров и сигнала система дрейфа. На стадии анализа данных, все кривые были глобально подходят с моделью 1:1 (один к _с, один _Уб); "Глобальная (Полный)" подходят предполагает полной диссоциации связывающим партнером (сигнал вернется к нулю на бесконечно времени) (рис. 4, красный). Заметим, что для двух высоких концентраций F ₁ (-ε), есть небольшие, но существенные отклонения данных от глобальной, 1:1 модели. Были использованы Низкие уровни иммобилизованным лигандом (биотинилированный "ε" субъединицы), а также соответствие не было улучшено в том числе массового коэффициента переноса в модели (не показан). Тем не менее, F ₁ (- "ε") представляет собой большой комплекс (~ 350 кДа), и другие эксперименты (не показаны) показывают, что эти отклонения за счет уменьшения связывания доступности фракции иммобилизованного лиганда, т.е. F ₁ связан с один "ε" может пространственно препятствовать доступу к другим Биотинилированные"Ε" связаны на одной стрептавидин тетрамере.

5 показан другой эксперимент, в котором фермент, связанный с датчиком с иммобилизованным ε в присутствии 1 мМ АТФ / ЭДТА; это предрасполагает большинство F ₁ / "ε" комплексы предположить noninhibitory конформацию, который диссоциирует легко ^8. Датчики были тогда перемещены в диссоциации лунки, содержащие аналитического буфера с разными лигандами. Это демонстрирует влияние различных лигандов на конформации ε. Например, воздействие MgADP / Pi резко замедлился чистый диссоциации, указывая, что ε смещается конформацию в плотно связанного, тормозное состояние. Сложные кинетика диссоциации наблюдались, так как различные лиганды вызвало разные смены во фракции F _1. Ε комплексы с ε в активных (диссоциирующие) или ингибирующих (nondissociable) конформации. Кроме того, возможно, что существенные конформационные изменения связанные белкинепосредственно способствовать изменениям в сигнале BLI но, в наших исследованиях, это, кажется, ничтожно мала по сравнению с сигналом, связывающего / диссоциации большого F ₁ комплекса (см. Шах и др. ^8, Фигурное 5D;. переход к кривыми 3 и 6, показывают, очень похоже поведение, хотя их условия способствуют различные конформации связанного F _1). Программное обеспечение Анализ данных не был предназначен для таких сложных кинетики диссоциации. Таким образом, мы экспортировали данные в текстовые файлы для нелинейного регрессионного анализа с другим программным обеспечением.

Рисунок 1. Принципы Био-слоя интерферометрии. Анимация суммирует основные физику для обнаружения биомолекулярной взаимодействие по BLI. Свет, проходящий через зондов отражается обратно к спектрофотометров (I) от внутренней поверхности датчика и (II) от внешнего всетевой интерфейсной датчика с раствором образца. Это приводит к интерференционной картины. Связывание молекул на поверхности датчика изменяет интерференционную картину. Это может быть представлено как нанометровом сдвига относительной интенсивности зависимости от длины волны. Мониторинг эту нанометровой сдвиг во времени предоставляет обязательные и кинетику диссоциации. Графика приспособлены с разрешения FortéBio ^12.

Рисунок 2. Схема расположения образцов в образце 96-луночного планшета. Датчики будут перемещены параллельно между столбцами и могут быть перемещены влево или вправо, как это определено в конкретном протоколе анализа. Скважины с серого цвета представляют аналитического буфера в то время как красный, синий и зеленый представляют иммобилизованного белка, связывание партнера, ЛигуNDS, соответственно.

Рисунок 3. Скриншот, показывающий необработанные данные из BLI анализа. Вертикальные красные линии обозначают движение датчиков между шагами анализа протокола. Типы Шаг обозначаются на изображении. Местоположения буфера и образцов, как показано на рисунке 2. Как отмечалось числами вдоль верхней части графика, датчики покрытых стрептавидином были перемещены между различными колонкам образец стекла в следующем порядке: 123454. Легенда ниже графика показывает цвет для трассы данных каждого датчика. В шаге нагружения, каждый датчик исключением Н инкубировали с 50 нМ биотинилировали "ε" субъединиц. На стадии ассоциации, датчики инкубировали с концентрациями нМ "ε" обедненный F _1: 30 (А, Н), 20 (В), 15 (С), 10 (D), 5 (Е), 2,5 (F), 0 нМ (G). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4. Экран захвата анализируемых данных от BLI анализа на фиг.3. Данные были обработаны и установлены так, как описано в тексте. В нескольких шагах ассоциации и диссоциации показаны, разделен вертикальной красной линии. Обработанные кривые данных являются синий; нелинейного регрессионного подходит от 1:01 глобального анализа показаны красным цветом. Глобальные монтажу результатов ^8: K = 2 × 10 ⁵ м ^-1 с ^-1 (± 0,1%), к _г = 4,8 х 10 ^-5 с ^-1 ("±" 0,1%), уступая K _D = 0,24 нМ. Степень согласия: R² = 0,999054. Максимальная связывания параметров (R _макс) был пригоден отдельно для каждого датчика, со средним значением = 0,813 нм ("±" 0,0803). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 5. Результаты от BLI анализа показывая аллостерические эффекты лигандов на конформацию ε в. F ₁ (-ε) был связан с датчиком иммобилизованными ε в присутствии 1 мМ АТФ / ЭДТА. В конце фазы ассоциации и часть фазы диссоциации показаны. Во время стадии диссоциации, различные лиганды для F ₁ каталитических центров (перечисленных для каждой трассы) были включены наблюдать за их аллостерические воздействие на диссоциации F ₁

Discussion

Имеющиеся в настоящее время приборы для BLI позволит существенно пропускную способность и гибкость в анализах на биомолекулярных взаимодействий. Различные образца раствора, распределяют в лунки черного микротитрационного планшета, а также набор параллельных датчиков BLI запрограммированы двигаться вперед и назад между колоннами скважин на тарелке. Образцы перемешивали при орбитальном перемешивании в течение всего теста. Система, используемая здесь имеет восемь датчиков и использует образец 96-луночного планшета, но другая система использует датчики 16 и образец пластину 384-луночный. Таким образом, взаимодействие между датчиком-иммобилизованных биомолекул и его партнером по связыванию в растворе могут быть проверены в различных условиях с нескольких датчиков параллельно. Например, в первом тесте, представленной здесь с иммобилизованным ингибирующей ε-субъединицы, взаимодействия были измерены с шестью различными концентрациями фермента (партнером по связыванию) параллельно (фиг.3 и 4). Это позволило глобальный анализ, чтобы определительпе одна пара констант скоростей _(K A, K _D) для обвязывания и диссоциации, и, таким образом константа равновесия диссоциации _(KD = к _D / K), что хорошо согласуется с ингибиторной постоянной (K _I) определяется из решение анализы ингибирования ферментов по ε ^8. Второй тип эксперимента (рис. 5) показали, что BLI может также контролировать аллостерические воздействия малых лигандов на взаимодействии между двумя белками; эффекты различных лигандов были сравнены параллельно. Существуют ограничения для обнаружения воздействия аллостерических лигандов, так как сигнал BLI зависит от массы связывающей молекулы, и может непосредственно обнаружить связывание мелких соединений в оптимальных условиях ^13. Однако, в анализе на фиг.5, св зывающегос партнера, F _1, был большой белковый комплекс (~ 347 кДа), так что BLI сигнал для его связывания / диссоциации существенно не влияет на рекламуФОР связывание малых лигандов, таких как АТФ (~ 500 Da) в комплекс F _1. Это было подтверждено с анализов, в которых эти лиганды не влияют на BLI сигнал для F _1, связанного с усеченной форме ε хватает тормозящее СТД ^8. Таким образом, анализы аллостерических эффектов необходимо учитывать массу аллостерический лиганда по отношению к массам взаимодействующих белков, и предпочтительно включают средства управления для тестирования возможностей прямого ответа BLI к связыванию лиганда.

Обратите внимание, что определенные шаги и модификации в протоколе может иметь решающее значение для достижения лучших результатов и более точный анализ. Например, как и в методике, описанной здесь (см. шаги 1.2.3, 1.2.5), анализ предназначен для глобального анализа связывания и константы скорости диссоциации должна включать дополнительный базовый шаг (см. шаг 1.2.3) в новом столбце буферных скважин (рис. 2, столбец 4) до того, как шаг Ассоциация, и датчики должны быть тeturned в том же столбце буферных скважин для шага диссоциации (см. шаг 1.2.5). Имея каждый датчик в той же скважине (с теми же оптическими свойствами) до и после стадии ассоциации может улучшить между шаг коррекции (шаг 3.4) для шагов Ассоциация / диссоциации, и это облегчает глобальную кинетическую установку нескольких трасс данных (как в рис. 4). Кроме того, для анализов, которые являются более предварительный чем показано здесь, программа имеет возможность сократить или продлить время любого шага во время анализа (в то время это активный шаг). Это полезно, например, если оптимальная загрузка сигнал не уже известно, или если требуется больше времени чтобы обеспечить достаточное для достижения диссоциации хорошо подходит для скорости диссоциации.

Неспецифическое связывание связывающего партнера к поверхности датчика может быть проблемой для этикеток без методов, таких как SPR и BLI. В наших тестах, это было эффективно свести к минимуму, в том числе BSA в буфере для анализа. Как и в иммуноблотепротоколы тин, кроме BSA белки могут быть использованы и низкие концентрации моющего средства может также минимизировать неспецифическое связывание (Tween20 используется в кинетики буфера от поставщика). Даже с минимальным неспецифическое связывание, большинство анализы должны включать, по крайней мере, один датчик контроля без иммобилизованного белка, но с высокой концентрацией связывающего партнера на стадии ассоциации (см. Рисунок 3, датчик H); вычитание остаточной неспецифического связывания (и его распад в течение шаг диссоциация) может значительно улучшить кинетическая анализы для специфического связывания / диссоциации изучается. С другой стороны, как только начальные анализы подтверждают, что биотинилированный белок остается устойчиво связанной После загрузки этапе (см. фиг.3, датчик г), что управление может быть опущен, и что датчик может быть использован для состояния образца.

Для надежной определения ассоциации и диссоциации констант скоростей с использованием BLI, нескольких концентраций бinding партнер должен быть использован, и все следы данных должны соответствовать по глобального анализа, если это возможно (как на фиг.3 и 4). В идеале, диапазон концентраций должны охватывать ~ 10 раз выше и ниже расчетной K _D. В нашем случае, с высоким сродством взаимодействия (К _D = 0,25 нМ), шум сигнал-был беден для связывания кинетики с концентрациями _суб-Уб. Таким образом, концентрация связывания партнера над K _D были использованы таким образом, чтобы были получены значительные изменения в наблюдаемых темпов и уровней связывания (см. Рисунок 3). Кроме того, большой шаг диссоциации был использован для улучшения уверенность в установке медленную скорость диссоциации. При высоких взаимодействий сродства, также возможно, что медленное диссоциации преувеличены перепривязки во время стадии диссоциации, так как BLI анализы выполнены в образце перемешиваемому, а не непрерывного потока над датчиком, как и для SPR. Этот потенциал артефакт может быть проверена с какговорит, в которой буфер диссоциации содержит «раковина» избыточного конкурентной белка, который связывается диссоциировано связывающего партнера и предотвращает его от перепривязки к датчику с иммобилизованным белком ^14. В нашей системе это было сделано путем сравнения результатов с учетом и без nonbiotinylated (> 10 раз выше _KD) при диссоциации хорошо, и мы подтвердили, что повторная привязка не является серьезной проблемой ^8. Наконец, если наборы кинетических результатов не вписываются в глобальный анализ (1:01 или 2:01 моделей доступны), есть и другие варианты анализа для устранения неполадок. Например, вместо выбора "Global (Full)" (на шаге 4.2), «Местные» можно выбрать, чтобы соответствовать каждый след датчика самостоятельно. Если привязки следует простой 1:01 модель, построение наблюдаемые обязательные цену (к _OB) против концентрации связывающий партнер должен показать линейную зависимость, с наклоном, равным второго порядка, внутренняя связь скорости. Вкладка Анализ программного обеспечения имеет "XYокно графика ", что позволяет быстро визуализировать эти отношения.

Одно ограничение инструмента, который мы использовали, доступный диапазон температур. При диапазоне от 2 ° С выше температуры окружающей среды до 40 ° С, только молекулы, которые являются стабильными в этом диапазоне может быть использован. Кроме того, термодинамический анализ ограничен узком температурном интервале. Еще одно общее ограничение в том, что максимальное время анализа составляет ~ 4 ч, после этого, артефакты разрабатывать из-за испарения образцов из открытого планшета для микротитрования.

BLI включает в себя относительно простое устройство по сравнению с SPR. Датчики перемещаются между колоннами скважин с фиксированных объемов, а не постоянным потоком образца на датчик. Хотя это и не так чувствительны, как SPR, BLI менее подвержен влиянию изменений показателя преломления в связи с изменением образца композиции. В целом, с этой относительной простоты использования и гибкости инструмента в переход между условиях анализа, BLI обеспечитьса универсальный инструмент для анализов в пробирке биомолекулярных взаимодействий.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available