Summary
ここプロトコルは、バイオレイヤー干渉法によるタンパク質 - タンパク質相互作用のカイネティックアッセイを記載する。細胞のエネルギー代謝に関与するF型ATP合成酵素、細菌中のεサブユニットによって阻害することができる。私たちは、εの阻害C末端ドメインと触媒の複合体の相互作用を研究するバイオレイヤー干渉法を適応している。
Abstract
我々は、 大腸菌の ATP合成酵素の触媒複合体とサブユニットεの阻害相互作用を研究するバイオレイヤー干渉法の使用を記載している。細菌のF型ATP合成酵素 薬剤耐性結核と闘うための新しい、FDA承認の抗生物質のターゲットである。サブユニットεのC末端ドメインによりATP合成酵素の細菌特有の自己阻害を理解することは、抗菌薬の発見のための酵素を標的とする新しい手段を提供することができます。 εのC末端ドメインは、アクティブ状態と非アクティブ状態、および触媒部位リガンドとの間の酵素の遷移が支配的であるεのコンフォメーションのどの影響を与えることができる劇的な構造変化を起こす。 εの結合/触媒複合体の解離、および間接的にMEAのアッセイは、動態sures明らかnondissociable阻害コンフォメーションとの間での酵素結合εのシフト。バイオレイヤー干渉信号は、溶液組成物に過度に敏感ではないので、それはまた、εのコンフォメーション変化に触媒部位リガンドのアロステリック効果をモニターするために使用することができる。
Introduction
タンパク質-タンパク質相互作用は、多くの生物学的プロセスのために重要であり、表面プラズモン共鳴（SPR）のようなラベルフリー光学的方法1の結合及び解離の動態を研究するためにインビトロで使用されてきた。ほとんどのラベルフリーの方法は、センサ表面上の1生体分子を固定化し、それが固定化された生体分子1と会合するように溶液から結合パートナーを検出するための光信号を使用しています。 SPRは、高感度な方法であるが、それは、センサ2の上を流れる溶液の屈折率の変化による干渉を受けやすい。 SPRほど敏感ではないが、バイオレイヤー干渉法（BLI）が少ないサンプル組成1,3の変化に影響される。 BLIは、先端に独自の生体適合性コーティングを有する光ファイババイオセンサーを使用しています。 （オクテットRED96）ここで使用されるシステムは、8つの分光光度計が含まれています。白色光は、ロボットアームに移動したプローブの行にパイプされる。光ファイバセンサのアルeは、プローブによってピックアップされたサンプルを含む96ウェルプレートに移動した。標的分子の一つは、バイオセンサー表面上に固定化される。次いで、センサは、溶液中の結合パートナーを含むウェルに移動される。 BLIは固定化された分子と結合パートナーとの会合を監視してから、結合相手なしでソリューションにセンサーを移動した後に解離を監視します。バイオセンサー表面への分子の結合は、内面からとセンサと溶液との間の外部インタフェースからの分光光度計に戻って反映させる光波の間の光の干渉の変化につながる。干渉におけるこれらの変化を定量化し、 図1のアニメーションにまとめたように、結合および解離の速度論的速度を決定するために用いることができる。
私たちは、酵素を自動阻害することができる細菌のATP合成酵素とそのεサブユニットの触媒複合体の間の相互作用を測定するために、BLIを適用している。 ATP SYnthaseは、ATP 4の合成と加水分解を触媒膜に埋め込 まれた回転ナノモーターである。触媒複合体（F 1）は、ATPアーゼとして機能する可溶性の形で単離することができる。サブユニットεは二つのドメインを持っている：N末端ドメイン（NTD）は適切な組み立てと、酵素の機能的結合のために必要であるが、触媒サブユニットと直接相互作用しない。C末端ドメイン（CTD）がと相互作用することによって酵素を阻害することができる複数の触媒サブユニット5,6。このε媒介規制は細菌のATP合成酵素に特有のものであり、ミトコンドリアの相同体で観察されていません。薬剤耐性結核7を治療するbedaquilineの最近のFDAの承認で示すように、ATP合成酵素は、抗菌薬のターゲットとして浮上している。これにより、創薬のためのεの阻害的役割を標的とすることは、ミトコンドリアATP合成酵素を阻害しない抗菌剤を得ることができる。孤立した触媒錯体（F 1）、εと解離性サブユニットになる。しかし、F 1に結合しているεで、εCTDは部分的に酵素の中央空洞内に挿入し、直接6,8解離性は低い抑制状態を形成し、劇的な構造変化を受けることができる。我々は、触媒サイトがεのコンフォメーション上のリガンドのアロステリック効果を調べるために、間接的にFが1 /ε結合と解離の反応速度を測定し、するBLIを使用しています。
（SPR等）BLI信号が表面に結合する分子の質量に敏感であるので、我々のシステムにおいては、εは、センサ表面に固定化するために選択した。 εサブユニットは、メインF 1複合体（〜347 kDa）の、小さな（〜15 kDa）の相対的です。このように、より大きなBLI信号が固定化されたεに、F 1の結合からなります。非常に遅くなることが、F 1解離を、監視するために、εは強く固定化されている必要があります。したがって、私たちは、ビオチン化することにしました、およびストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサー上に固定。タンパク質は、表面リジン9の（I）のランダム変更、ビオチン-マレイミド試薬10または（iii）遺伝的に酵素的に中にビオチン化され、特定のビオチンアクセプターペプチドを付加した独自のネイティブまたはシステイン（II）の反応により、ビオチン化することができるタグ付けされた蛋白質11のin vivo発現における 。我々のシステムでは、εは法（III）8を使用してビオチン化する。ビオチンタグ化εストレプトアビジンセンサー上に固定化されると、BLI結合およびサブユニットε（F 1（-ε））を枯渇されたF 1の解離を測定することができる。ここに記載の実験のために、予備的アッセイは、センサー上に固定化するためにビオチン化タンパク質の合理的な量を決定することは行われていた。これは、タンパク質の分子量およびその結合パートナーに応じて、変えることができるが、目標は、固定化タンパク質tの最小量を決定することである帽子は、（i）許容信号対雑音（K D下）結合パートナーの濃度が低いと結合パートナーのほぼ飽和濃度との結合動態（II）の最小限の歪みで反応速度を結合するために用意されています。また、ビオチンの化学量論は一貫BLI信号は、ストレプトアビジン被覆上に固定化の間に達成することができることを確認するために変化する（ただし、> 1モルビオチン/モルタンパク質を避ける）ため、いくつかの初期のアッセイは、ビオチン化タンパク質のそれぞれ新しいロットのために必要とされてもよいセンサー。
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Protocol
1。 BLIアッセイのための測定器のプログラミング
ランプがウォームアップしますので、事前に測定器を少なくとも1時間の電源をオンにし、これは、ノイズを最小限に抑え、実験中に、光信号のドリフトすることが必要である。サンプルプレートホルダーを予熱し、器具のタブを経由して所望の温度を設定します。そして、データ収集ソフトウェアで実験計画を設定します。実験ウィザード]タブにある「新しい動力学実験」を選択します。これは定義されている必要があり、すべての手順でタブ付きのメニューを提示します。
1.1。プレートの定義
96ウェルサンプルプレート上で使用される列を定義する。バッファ、固定化タンパク質または結合パートナーを含むように列を割り当てます。よく各協会のために、使用される結合パートナーの濃度を入力します。注： 図2に示されているプレートの定義が明確なアッセイのためのオプションがあります。
1.2。検定の定義
ontent ">アッセイに必要なすべてのステップを定義します。これらは、（i）ベースライン（数）、（II）読み込み、（III）協会と結合パートナー（IV）の解離が含まれています。その後、後述するように、個々のアッセイ工程をリンクその後、アッセイ段階と、それぞれの列をダブルクリックを選択して、サンプルプレート上のウェルの列。このプログラムは、アッセイ中に次のウェルの1つの列から移動するセンサー。- ベースライン
96ウェルプレート中で、最初のBLIシグナルを確立するために、アッセイ緩衝液中のセンサ（ 図2、列1）を用いて、短い基線工程（≥60秒）で始まる。 - （センサー上のビオチン化タンパク質を固定化する） ロード
ビオチン化タンパク質（ 図2、列2）が含まれていますウェルにセンサーを割り当てます。 （概要を参照）の結合の所定のレベルを達成するために、しきい値関数を使用します。すべてのセンサーは、移動になるように、しきい値オプションを設定センサのいずれかが閾値に達したウェルの次の列にdを。 - ベースライン
センサーから離れて非固定化タンパク質を洗浄し、新しい、安定したベースライン信号を確立するために、バッファ内の別のベースラインのステップ（通常は> 5分、図2、列3）を挙げることができる。のみ（ 図3のように）基本的な結合/解離アッセイのために、会合工程前にバッファの新しいウェル内のセンサー（ 図2、列4）で余分なベースラインステップ（60秒）が含まれています。 - （固定化タンパク質への結合相手の） 協会
（ 図3のように）基本的な結合/解離アッセイのために、異なるセンサ/ウェル（ 図2、カラム5）に使用される結合パートナーの濃度範囲を選択する。結合パートナーの少なくとも飽和濃度が信号を結合平衡に近づく必要がありますように、ステップ時間を調整します。のために（ 図5のように）タンパク質-タンパク質複合体の解離の小さなリガンドのアロステリック効果を試験するためのアッセイは、すべてのアソシエーションウェルにおける使用のための結合パートナー（〜10倍推定K Dを超える）単一の高濃度を選択する。 - （結合相手の） 解離
のみ（ 図3のように）基本的な結合/解離アッセイのために、第4欄（ 図2）、アソシエーションの前に余分なベースラインのために用いたのと同じ緩衝液をウェルに戻すためのセンサを指定する。小さ なリガンドのアロステリック効果を試験するためのアッセイのために、代わりに列6だけでなく、それぞれがバッファプラス異なるアロステリックリガンドを含むことができます（ 図2）に移動するようにセンサーを指定します。
1.3。センサ割り当て
アッセイのための予備湿潤センサーが含まれますセンサートレイ内の位置を示している。実験はFAIになるので空の位置を同定Lないセンサーがピックアップされていない場合。
1.4。レビュー実験
間違いをチェックし、それらを修正する戻って、すべての計画された手順を視覚化する。
1.5。走行実験
データファイルの場所など、必要な詳細を入力します。実験のために所望の温度を入力します。センサーは、まだプレウェッティングが必要な場合は、実験開始を遅らせるためのオプションを選択します。最終的には、一度にすべてのサンプル調製は、（ステップ2）が完了し、サンプルプレートとセンサートレイの両方は、機器にロードされ、分析を実行するために[Go]ボタンをクリックします。
2。試料調製
- 適切なアッセイ緩衝液を準備します。 （pHを8.0に調整するために添加） - （（N-モルホリノ）プロパンスルホン酸3）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノ-メタン）、50mMのKCl、20mMのMOPS：バッファは、 図3および図5に示す実験に使用した。 BSA（ウシ血清アルブミン、遊離脂肪酸、0.5を含むすべてのアッセイ工程のためのビオチン化タンパク質または結合パートナーのすべての希釈は、センサーへのタンパク質の非特異的な結合を最小限にするためのバッファでの）mg / mlの最終的な。
- （概要を参照）適切な濃度にアッセイ緩衝液中でビオチン化タンパク質（ε）を希釈します。
- アッセイ緩衝液中の結合パートナー（F 1（-ε））（、使用する濃度の範囲のための議論を参照のこと）の希釈液を準備します。
- それらの保護スクロースコーティングを除去するために、少なくとも10分間、ストレプトアビジンでコーティングしたセンサーを予め湿ら。センサートレイからセンサ内蔵ラックを取り外し、トレイの底に96ウェルプレートを挿入し、トレイ上の配向ノッチにプレートの一角をスライドさせる。センサの列が使用されるためには、96ウェルプレートのカラムにウェルあたりのアッセイ緩衝液200μlを加える。 （スロットのタブ付き）正しい方向にトレイにセンサーのラックを返します。
- ステップ1でのプログラミング時に割り当てられたとして、O井戸を埋める図2のようにアッセイ緩衝液又は適当なタンパク質希釈物fのサンプルプレート。彼らは、光信号のノイズの原因となりますので、気泡を導入することは避けてください。 （I）ビオチン化タンパク質または（ii）結合パートナーのいずれかを省略した1以上の基準井戸があります。
- ステージのスロットに挿入され、トレイのタブで、（左）機器のドアを開き、ステージにセンサートレイを挿入します。プレートホルダー（右）にサンプルプレートを挿入し、プレートホルダーに示されるように、プレートは、平らで正しい向きに装着されていることを確認してください。ドアを閉じ、データ収集プログラム（ステップ1.5）からアッセイを開始する。
3。データ処理
- 分析の実行後、データ解析ソフトウェアを起動し、データを格納しているフォルダをロードします。各センサで、（左の）段階的な処理メニューと生動態データを見るために「処理」タブをクリックします（A〜H）の異なる色が割り当てられます（図3）。
- 「データの選択」の下に、「センサーの選択」ボタンをクリックしてください。 「サンプルプレートマップ」上で、参考井戸として1または2制御センサ（G、 図3の測定ではH）のための井戸を指定します。 Processingメニューの「引き算」チェックボックスをオンにし、他のすべてのセンサの信号から（シングルまたは平均した）基準信号を減算する「リファレンス·ウェルズ」を選択します。
- 「整列Y軸」の手順を使用して、Y = 0にすべてのトレースの位置を合わせます。アライメント工程（これは会合工程前の最後のベースラインである）などの「ベースライン」を選択します。 「時間範囲」については、そのベースライン（ 図3のように、60秒のベースラインのすなわち 、50〜60秒）の最後の10秒を入力します。
- 会合および解離のステップとの間の信号シフトを最小限に抑えるために「インターステップ補正」チェックボックスをオンにします。ベースラインまたは解離合わせる]を選択します。
- ほとんどの場合、サビツキー·ゴーレイフィルタ機能を選択し、クリックして "プロセスデータを！"続行します。視覚的に検査最終処理されたデータ（右下のパネル）。信号トレースは、結合と解離ステップの間には有意な変化を示している場合（ 図4のように）グローバルデータ解析のために意図されたアッセイと、「インターステップ補正」の解離またはベースラインの選択を変更し、データへ進む前に、データを再処理する分析。
4。データ解析
開始するにはデータ解析の「分析」タブをクリックします。注：以下の例の手順は、（ 図3のように）複数の結合/解離曲線のグローバル分析のためのものです。
- 「分析するステップ」の場合は、会合および解離を選択します。 「モデル」については、午前1時01分]を選択します。注：その他の制限されたオプションが使用可能です。
- 「フィッティング」については、（フル）グローバル]を選択します。 」とは、基」の（グラフのように）色を選択します。 （R maxの独立したフィッティングを可能にするために「センサーによってリンクされていないのR マックス 」 を選択してPARの結合を飽和させる時に最大信号応答固定化タンパク質へtner）。注：センサーが固定されたタンパク質の量が多少異なるように、我々は（ 図3、ロードしています）、ほとんどのアッセイのためにこれを行う。
- 示すテーブルに、分析しようとするすべてのセンサーのトレースが同じ色を持っているので、彼らはグローバルセットとして分析されることを確認してください。必要に応じて、1つ以上のセンサーがグローバルフィッティングから省略するためのトレースを選択します。「含む」列の下に、所望のセンサの位置を右クリックし、「ウェルズの除外」を選択します。
- 「フィットカーブを！」をクリック非線形回帰分析を開始します。 、決定されたパラメータ値（速度定数、R マックスでは、（i）（ 図4のように）センサデータのトレースで回帰曲線を重ね、フィッティング残差の（II）のプロット、及び（iii）表が含まフィッティング結果を調べるK D）と統計パラメータについて（標準誤差、カイ二乗、R 2）。
- 「データのエクスポート」の下で、「CSVファイルへのエクスポート表」をクリックして、フィッティング結果を保存します。 grapを用興または他のソフトウェアとのデータ/装着曲線の更なる分析は、テキストファイル内の各センサーのデータと近似曲線を保存する「エクスポートフィッティング結果」をクリックしてください。
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Representative Results
リアルタイム結合および解離動態BLIを図3に示す。この実験は、会合および解離アッセイ緩衝液で行った。センサーは短時間だけを予め湿らされていたので、この実験は、10分のベースラインのステップを開始した。次に、ビオチン化εは、センサにロードした。 εの検出可能な解離は結合パートナーが追加されていなかった基準曲線（G）から見て、残りのすべての工程を通して発生していません。第二の基準センサ（H）は、固定化されたタンパク質を欠いていたと結合パートナーとの低い非特異的結合を示した。 F 1（-ε）種々の濃度の結果をグローバルにフィット及びk A、K dおよびK Dのための最高の値を取得するために、AFセンサのアソシエーション工程で使用した。その結果を図4に、データトレース（青）を得プロトコルと同様に処理した。この場合、基準センサトレースHは、サンプルのtrから差し引いた結合パートナーおよびシステム信号ドリフトの非特異的結合を補正するのエース。データ解析工程では、全ての曲線は、1:1モデル（シングルK Aを、単一のK d）が持つ世界的に適合した、「地球は（フル）」適合は結合相手の完全な分離を前提として（信号は無限でゼロに戻ります時間）（ 図4、赤）。なお、F 1（-ε）の2つの最高の濃度について、世界的な1:1モデルからのデータの小さいが重要な偏差があります。固定化リガンドの低レベル（ビオチン化「ε」サブユニット）を使用した、フィットは、モデル（図示せず）での質量輸送因子を含むことによって改善されなかった。ただし、F 1（ - 「ε」）は、大規模で複雑 な（〜350 kDa）のであり、図示しない他の実験は、これらの偏差は、固定化リガンドの画分の減少した結合アクセシビリティによるものであることを示唆している、すなわち F 1に結合した1「εは「立体的に別のビオチン化へのアクセスを妨げる可能性が同じストレプトアビジン四量体に結合された「ε」。
図5は、酵素を1mmのATP / EDTAの存在下でεセンサーに固定化するためにバインドされた様々な実験を示し、これは、ほとんどのF 1 / "ε"複合体は容易に8解離する非阻害性コンホメーションを、仮定の素因となる。センサは、異なるリガンドでアッセイ緩衝液を含むウェルを解離するために移動させた。これはεの構造上の異なるリガンドの効果を実証している。たとえば、MgADP / PIへの露出が劇的にεが密結合した抑制性状態へのコンフォメーションをシフトしていることを示す、正味の解離を遅らせた。異なるリガンドは、F 1の割合で異なるシフトを引き起こしたため、複雑な解離動態が観察された。アクティブ（解離性）または阻害（nondissociable）の立体配座でのεとε複合体を。これは、結合したタンパク質の実質的なコンホメーション変化することも可能である。BLI信号の変化に直接寄与しますが、我々の研究では、これは（シャーら 8、図5Dを参照してください大のF 1複合体の結合/解離のための信号に比べて無視できるように表示されます。曲線3及び図6への移行非常に類似した挙動、それらの条件は、結合したF 1の明確な配座を好むが）。データ解析ソフトウェアは、このような複雑な解離速度のために設計されていませんでした。従って、我々は他のソフトウェアとの非線形回帰分析のためのテキストファイルにデータをエクスポートしました。
図1。バイオレイヤー干渉法の原則。アニメーションは、BLIによる生体分子の相互作用を検出するための基礎となる物理学をまとめたものです。プローブを通過した光センサの内部表面から、および（ii）は、外部からバック光度計（i）方向に反射される試料溶液とセンサのterface。これは、干渉パターンをもたらす。センサ表面への分子の結合は、干渉パターンを変化させる。これは、 対波長の相対強度のナノシフトとしてプロットすることができる。時間をかけて、このナノシフトを監視することは、結合·解離反応速度を提供します。グラフィックスはFortéBio12の許可を得て適応される。
図2の96ウェルサンプルプレート中のサンプルの概略構成は 、センサをカラムにカラムから平行移動され、特定のアッセイプロトコルで定義されるように、左または右に移動させることができる。赤、青、緑が固定化タンパク質、結合パートナーとリーガを表すのに対し、グレー色のウェルは、アッセイバッファーを表すそれぞれNDS、。
図3。BLIアッセイからの生データを示すスクリーンショット。縦の赤い線は、プロトコルのアッセイ工程の間にセンサーの動きを示している。ステップタイプは、画像上に示されている。 図2に示すように、緩衝液及び試料の位置である。グラフの上部にある番号で述べたように、ストレプトアビジンでコーティングされたセンサーは、移動されました 123454：次の順序でサンプルプレートの異なる列の間。グラフの下の凡例には、各センサのデータトレースの色を示している。ローディング工程においては、H以外の各センサは、50nMのビオチン化「ε」サブユニットと共にインキュベートした。 （30：アソシエーション工程において、センサは、「ε」枯渇F 1 nMの濃度でインキュベートした。、H）、20（B）、15（C）、10（D）、5（E）、2.5（F）、0であった（G）。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。図3のBLIアッセイからの分析されたデータのスクリーンショット。テキストで説明したようにデータを処理して取り付けた。唯一の結合と解離のステップは赤い縦線によって分けられ、示されている。処理されたデータ曲線は青で、非線形回帰を1:1グローバル分析からフィットは赤で表示されます。グローバルフィッティング結果8：K = 2×10 5 M -1 s -1の（±0.1％）、KのD = 4.8×10 -5 S -1 K D = 0.24 nMのをもたらす（「±」0.1％）、。適合度：R2 = 0.999054。最大結合パラメータ（R max）は 、平均値= 0.813 nmの（ "±" 0.0803）で、各センサごとに個別に適合させた。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図5。εのコンフォメーションのリガンドのアロステリック効果を示すBLIアッセイの結果、F 1（-ε）1 mMのATP / EDTAの存在下でεセンサー固定化に結合させた。会合相および解離相の一部の端部が示されている。解離工程の間に、（各トレースにリストされている）、F 1の触媒部位のための明確なリガンドは、F 1の解離に自分のアロステリック効果を観察するために含まれていた
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Discussion
BLIのための現在利用可能な機器は、生体分子の相互作用のためのアッセイにおいて有意なスループットと柔軟性を可能にします。種々の溶液試料は黒色マイクロタイタープレートのウェルに分配され、平行BLIセンサのセットは、プレート上のウェルの列の間を前後に移動するようにプログラムされる。サンプルは、アッセイを通じて軌道振とうにより撹拌する。ここで使用されるシステムは、センサ8を有し、96ウェルサンプルプレートを使用するが、別のシステムは、センサー16および384ウェルサンプルプレートを使用する。したがって、センサ固定化生体分子と溶液中でその結合パートナーの間の相互作用は、並列に複数のセンサを有する、異なる条件下で試験することができる。例えば、固定化された阻害εサブユニットとここに提示第一のアッセイにおいて、相互作用が並行して酵素（結合パートナー）6つの異なる濃度で測定された（ 図3及び図4）した。これは世界的な解析がdetermiを許可正味の結合および解離速度定数（K dを K）、およびから決定阻害定数（K I）と密接に一致しているこのように平衡解離定数（K D = K D / K A）の北東単一の対ε8による酵素阻害の溶液アッセイ。実験の第二のタイプ（ 図5）は、BLIは、2つのタンパク質間の相互作用の小さなリガンドのアロステリック効果を監視することができることを実証し、異なるリガンドの効果は、並行して比較した。 BLI信号は結合分子の質量に依存し、直接最適化された条件の下で13小化合物の結合を検出することができるので、アロステリックリガンドの効果を検出するための制限が存在する。しかし、 図5のアッセイで、結合相手、F 1は 、大規模なタンパク質複合体（〜347 kDa）のだったので、その結合/解離のためのBLI信号が大きく、広告の影響を受けなかったditionalは、F 1の複合体をATPなど（〜500 Da）でのような小さなリガンドの結合。これは、これらのリガンドは、阻害CTD 8を欠いεの切断型にバインドされたF 1のためのBLI信号に影響を与えなかっれるアッセイにより確認した。このように、アロステリック効果のアッセイは、相互作用するタンパク質の質量にアロステリックリガンドの質量を考慮する必要があり、好ましくはリガンドの結合に直接BLIの応答をテストするためのコントロールが含まれています。
実験プロトコルの特定の手順および修正がより良い結果、より正確な分析を実現するために重要であることに注意してください。例えば、ここに記載されているプロトコルのように、結合および解離速度定数のグローバル分析を目的とし、アッセイが新しい列に余分なベースラインステップ（ステップ1.2.3を参照）を含める必要があります（1.2.3は、1.2.5の手順を参照してください）バッファ·アソシエーション·ステップの前にウェル（ 図2、カラム4）、およびセンサをrであるべきであるの解離工程のためのバッファウェルと同じ列（ステップ1.2.5を参照）eturned。アソシエーション工程の前と後の（同じ光学特性を有する）は、同じウェル内の各センサを有するアソシエーション/解離工程のための工程間補正（ステップ3.4）を改善し、これは同様に（複数のデータ·トレースのグローバル運動嵌合を容易にすることができ図4）。また、ここに示されているよりも多くの予備的なものでアッセイのために、プログラムが（それはアクティブなステップである間）アッセイ中の任意の工程の時間を短縮または延長するためのオプションがあります。より多くの時間が解離速度のための良好な適合を達成するのに十分な解離を可能にするために必要とされる場合に、最適なロード信号が既知で、またはされていない場合、これは、例えば、有用である。
センサ表面への結合パートナーの非特異的結合など、SPRおよびBLIとしてラベルフリーメソッドの問題になる可能性があります。我々のアッセイでは、これは効果的にアッセイ緩衝液中でBSAを含むことによって最小化された。イムノブロットのようにティンプロトコル、BSA以外のタンパク質を使用することができ、界面活性剤の低濃度はまた、（ツイーン20がサプライヤからの動力学バッファに使用されている）非特異的結合を最小限に抑えることができる。結合残留非特異の減算（およびその崩壊時に、あっても最小限の非特異的結合を、ほとんどのアッセイは、固定化タンパク質を含まないが、会合工程における結合パートナーの最高濃度（ 図3、センサーHを参照）少なくとも一つの制御センサーを含める必要があります解離工程）が有意に運動を向上させることができます検討されて特異的結合/解離のために分析します。一方、一旦初期アッセイは、ビオチン化タンパク質（ 図3、センサーGを参照）を安定読み込み工程の後に結合したままであることを確認し、その制御を省略することができ、そのセンサは、サンプル条件のために使用することができる。
BLI、Bの複数の濃度を使用して結合および解離速度定数の決定のための強固なindingパートナーを使用する必要があり、可能な場合、すべてのデータトレースは、（ 図3及び図4のように）、グローバル分析によりフィットされるべきである。理想的には、濃度の範囲は、〜10倍以上の、推定K d は下にまたがる必要があります。この例では、高親和性相互作用（K D = 0.25 nM）を用いて、信号対雑音サブK D濃度で速度論を結合するため不良であった。このように、K D上記結合パートナーの濃度は、（ 図3を参照）、観察されたレートと結合のレベルの有意な変化が得られたことなどに使用された。また、長い解離工程は、遅い解離速度をフィッティングの信頼性を向上させるために使用した。高親和性相互作用により、BLIアッセイはむしろSPRのようなセンサーに流れ続け、より攪拌試料で行われるので、遅い解離は、解離工程中に再バインドすることによって誇張されることも可能である。この潜在的なアーティファクトは、使用してテストすることができます解離緩衝解離結合パートナーに結合し、センサー固定化タンパク質14に再結合するのを防止過剰競争力のあるタンパク質の「シンク'が含まれていると言います。我々のシステムでは、これは、当解離（> 10倍のK Dを超える）非ビオチンとない場合の結果を比較することによって行われ、我々は、再結合が重大な問題8はなかったことが確認された。運動の結果セットが（1:1または2:1のモデル使用可能）グローバル分析によりうまく適合していない場合、最終的に、トラブルシューティングのための他の分析オプションがあります。たとえば、代わりに（ステップ4.2）」（フル）グローバル」を選択する代わりに、「ローカル」とは、独立して、各センサトレースに合わせて選択することができます。結合は、単純な1時01モデルに従っている場合、結合相手の濃度対観察された結合率（k個のOBS）をプロットすると、二次、固有の結合速度に等しい勾配で、線形依存性を示すべきである。ソフトウェアの分析]タブには、「XYを持つこの関係の迅速な可視化を可能にするグラフ」ウィンドウ。
我々が使用器具の1つの制限は、利用可能な温度範囲である。 40℃の周囲温度より2℃の範囲で、その範囲内に安定している分子のみを使用することができる。また、熱力学的な解析は、狭い温度範囲によって制限されます。他の一般的な制限は、最大アッセイ時間が約4時間であることであり、この後に、成果物はオープンマイクロタイタープレートからのサンプルの蒸発による開発。
BLIは、SPRに比べて、比較的簡単な構成を必要とする。センサーは、固定ボリュームではなく、センサーの上の試料の一定流量でウェルの列の間を移動している。 SPRほど敏感ではないが、BLIは少ないため、サンプル構成の変化による屈折率の変化に影響される。全体的に、アッセイ条件の間でのシフトでの使用や機器の柔軟性のこの比較的容易に、BLIは提供SA生体分子の相互作用のin vitroアッセイのための多目的ツール。
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Disclosures
著者らは、利害の衝突を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は、図1で使用されるグラフィックスを提供するためFortéBioに感謝します。この作品は、TMDにNIHの助成金GM083088によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
References
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