Summary
I protocolli che seguono descrivono saggi cinetici di interazioni proteina-proteina con Bio-strato Interferometria. F-tipo ATP sintasi, che è coinvolto nel metabolismo energetico cellulare, può essere inibita dalla sua subunità ε nei batteri. Abbiamo adattato Bio-strato interferometria per studiare le interazioni del complesso catalitico con il dominio C-terminale inibitorio di ε.
Abstract
Descriviamo l'uso di Bio-strato interferometria per studiare le interazioni inibitorie della subunità ε con il complesso catalitico di Escherichia coli ATP sintasi. Batterica di tipo F ATP sintasi è l'obiettivo di un nuovo antibiotico approvato dalla FDA per combattere la tubercolosi resistente ai farmaci. Capire specifici batteri-auto-inibizione della ATP sintasi dal dominio C-terminale della subunità ε potrebbe fornire un nuovo mezzo per indirizzare l'enzima per la scoperta di farmaci antibatterici. Il dominio C-terminale di ε subisce un drastico cambiamento conformazionale quando le transizioni tra gli stati di enzimi attivi e inattivi, e ligandi catalitica-portale possono influenzare quale delle conformazioni di ε è predominante. Le cinetiche di saggio misura di ε legante / dissociazione con il complesso catalitico, e indirettamente meaSures lo spostamento di ε enzima legato alla e dalla conformazione inibitorio apparentemente nondissociable. Il segnale interferometria Bio-strato non è eccessivamente sensibili composizione della soluzione, in modo che possa essere utilizzato anche per monitorare gli effetti dei ligandi allosterici catalitica-portale sulle variazioni conformazionali di ε.
Introduction
Interazioni proteina-proteina sono importanti per molti processi biologici e metodi ottici label-free come Surface Plasmon Resonance (SPR) sono stati utilizzati in vitro per studiare la cinetica di legame e di dissociazione 1. La maggior parte dei metodi di label-free immobilizzare uno biomolecole su una superficie del sensore e utilizzare un segnale ottico per rilevare un partner di legame dalla soluzione in quanto si associa con la biomolecola immobilizzata 1. Mentre SPR è un metodo altamente sensibile, è soggetta a interferenze dovute a variazioni dell'indice di rifrazione della soluzione scorre sopra il sensore 2. Anche se non è così sensibile come SPR, Bio-strato Interferometria (BLI) è meno influenzata dai cambiamenti nella composizione del campione 1,3. BLI utilizza biosensori in fibra ottica che hanno un rivestimento biocompatibile proprietaria alla punta. Il sistema utilizzato here (Octet-RED96) contiene otto spettrofotometri. La luce bianca viene convogliata ad una fila di sonde che si muovono su un braccio robotico. Sensori in fibra ottica are raccolto dalle sonde e spostata in una piastra a 96 pozzetti contenenti campioni. Una delle molecole bersaglio è immobilizzato sulla superficie del biosensore. Poi sensori vengono spostati pozzetti contenenti il partner di legame in soluzione. BLI monitora associazione del partner di legame con la molecola immobilizzata, quindi controlla dissociazione dopo aver spostato i sensori di soluzione senza il partner di legame. Il legame di molecole di superficie biosensore comportano modifiche interferenza ottica tra le onde luminose che riflettono indietro ai spettrofotometri da una superficie interna e dall'interfaccia esterna tra il sensore e la soluzione. Questi cambiamenti di interferenza possono essere quantificate e utilizzati per determinare i tassi cinetiche di legame e di dissociazione, come riassunto nell'animazione della figura 1.
Abbiamo applicato BLI per misurare le interazioni tra il complesso catalitico di ATP sintasi batterica e la sua subunità ε, che può auto-inibire l'enzima. ATP synthase è un nanomotor rotativo membrana integrato che catalizza la sintesi e idrolisi di ATP 4. Il complesso catalitico (F 1) può essere isolato in forma solubile che funziona come un ATPasi. Subunità ε ha due domini: il dominio N-terminale (NTD) è necessaria per il corretto montaggio e l'accoppiamento funzionale dell'enzima, ma non interagire direttamente con le subunità catalitiche, il dominio C-terminale (CTD) in grado di inibire l'enzima interagendo con più subunità catalitiche 5,6. Questo regolamento ε-mediata è specifico per ATP sintasi batteriche e non è osservata nel omologo mitocondriale. ATP sintasi è emerso come un bersaglio per farmaci antibatterici, come dimostrato dalla recente approvazione della FDA di bedaquiline per il trattamento della tubercolosi farmaco-resistente 7. Così, il targeting ruolo inibitorio di ε per la scoperta della droga potrebbe produrre antibatterici che non inibiscono la mitocondriale ATP sintasi. Con l'isolato complesso catalitico (F 1), εdiventa una subunità dissociabile. Tuttavia, con ε vincolato a F 1, il εCTD può subire un drastico cambiamento conformazionale, parzialmente inserito nella cavità centrale dell'enzima e formando uno stato inibitorio che difficilmente dissociare direttamente 6,8. Usiamo BLI per misurare cinetica di F 1 / ε associazione e la dissociazione e, indirettamente, per esaminare gli effetti allosterici di catalizzatore sito ligandi sulla conformazione di ε.
Nel nostro sistema, ε è stato scelto per l'immobilizzazione sulla superficie del sensore dal segnale BLI (come SPR) è sensibile alla massa dei leganti in superficie molecole. La subunità ε è piccolo (~ 15 kDa) rispetto alla principale F 1 complesso (~ 347 kDa). Così, un segnale BLI più grande sarà il risultato di legame di F 1 a ε immobilizzato. Per monitorare F 1 dissociazione, che può essere molto lento, ε deve essere fortemente immobilizzato. Così abbiamo scelto di biotinylateE immobilizzarlo sul biosensori rivestite di streptavidina. Le proteine possono essere biotinilati (i) modifica casuale di lisine superficie 9, (ii) reazione di un unico cisteina nativa o attrezzata con biotina-maleimmide reagente 10 o (iii) geneticamente aggiungendo uno specifico peptide biotina-accettore che viene enzimaticamente biotinilato durante espressione in vivo della proteina marcata 11. Nel nostro sistema, ε è biotinilato utilizzando il metodo (iii) 8. Una volta ε biotina-tag è immobilizzato su sensori streptavidina, BLI può misurare l'associazione e dissociazione di F 1, che è stato impoverito di subunità ε (F 1 (-ε)). Per gli esperimenti qui descritti, saggi preliminari sono stati condotti per determinare ragionevole quantità di proteina biotinilato per immobilizzare sui sensori. Questo può variare, a seconda del peso molecolare della proteina e il suo partner di legame, ma l'obiettivo è quello di determinare una quantità minima di proteina immobilizzata tcappello prevede (i) accettabile segnale-rumore per il legame cinetica con una bassa concentrazione del partner di legame (di seguito K D) e (ii) una distorsione minima di cinetica di legame con concentrazione quasi saturazione del partner di legame. Inoltre, stechiometria biotinilazione può variare (ma evitare> 1 mol biotina / proteine mol), per cui alcuni dosaggio iniziale può essere necessario per ogni nuovo lotto di proteine biotinilato per confermare che un segnale coerente BLI può essere raggiunto durante l'immobilizzazione sulla streptavidina-rivestito sensori.
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Protocol
1. Programmare lo strumento per la BLI Assay
Accendere lo strumento almeno un'ora di anticipo per permettere alla lampada di riscaldarsi, questo è necessario per minimizzare il rumore e la deriva in segnale ottico durante l'esperimento. Impostare la temperatura desiderata tramite la scheda strumento per preriscaldare il supporto piastra del campione. Quindi impostare il disegno sperimentale nel software di acquisizione dati. Selezionare "Nuovo Kinetics Experiment" nella scheda Wizard Experiment. Questo presenta un menu a schede con tutti i passi che devono essere definiti.
1.1. Definizione Piatto
Definire le colonne da utilizzare sul piatto del campione a 96 pozzetti. Assegnare colonne per contenere tampone, proteina immobilizzata o partner di legame. Per ogni associazione bene, immettere la concentrazione di partner di legame da utilizzare. Nota: la definizione piastra mostrata nella figura 2 ha opzioni per saggi distinti.
1.2. Assay Definizione
ONTENUTO "> Definisci tutti i passi necessari per il saggio., tra cui (i) Baseline (vari), (ii) Caricare, (iii) di associazione e (iv) dissociazione dei partner di legame. Poi, come descritto di seguito, collegare i singoli passaggi del test con colonne di pozzetti sulla piastra del campione selezionando la fase di test e quindi fare doppio clic sulla rispettiva colonna. Questo programma i sensori devono essere spostati da una colonna di pozzi a quella successiva durante il dosaggio.- Baseline
Iniziare con una breve fase basale (≥ 60 sec), con sensori in tampone di saggio (Figura 2, colonna 1), stabilire segnali BLI iniziali nella piastra a 96 pozzetti. - Loading (immobilizzare la proteina biotinilato sui sensori)
Assegnare sensori per pozzetti che conterranno la proteina biotinilato (Figura 2, colonna 2). Utilizzare la funzione di soglia per raggiungere un livello predeterminato di legame (vedi introduzione). Impostare l'opzione di soglia in modo che tutti i sensori saranno mossad alla colonna successiva di pozzi quando uno qualsiasi dei sensori raggiunge la soglia. - Baseline
Includere un altro passo basale in tampone (figura 2, colonna 3, in genere> 5 min) per lavare via le proteine biotinilate nonimmobilized dai sensori e stabilire nuovi segnali di base stabili,. Per base saggi di legame / dissociazione solo (come in figura 3), comprende un passaggio aggiuntivo basale (60 sec) con sensori a nuovi pozzi di tampone (Figura 2, colonna 4) prima della fase di associazione. - Association (del partner di legame alla proteina immobilizzata)
Per una dissociazione saggio base legante / (come in figura 3), selezionare un intervallo di concentrazioni di partner di legame da utilizzare per diversi sensori / pozzetti (Figura 2, colonna 5). Regolare il tempo di passaggio in modo che almeno una concentrazione di saturazione del partner di legame deve avvicinarsi segnale vincolante equilibrio. Per unsaggio per testare effetti allosterici di piccoli ligandi sulla dissociazione del complesso proteina-proteina (come in Figura 5), per selezionare una singola concentrazione di partner di legame (~ 10 volte superiori alle stime K D) per l'utilizzo in tutti i pozzetti di associazione. - Dissociazione (del partner di legame)
Per una dissociazione saggio di base legante / solo (come nella figura 3), designa i sensori per tornare alla colonna 4 (Figura 2), gli stessi pozzetti tampone quale usato per la linea di base supplementare prima Association. Per un saggio per testare effetti allosterici di piccoli ligandi, invece designare sensori per spostarsi colonna 6 (figura 2), in cui ciascun pozzetto può contenere tampone più diversi ligandi allosterici.
1.3. Assegnazione del sensore
Indicare le posizioni nel cassetto sensore che conterrà i sensori prewetted per il saggio. Identificare eventuali posizioni vuote in quanto l'esperimento FAIl se non sensori sono raccolti.
1.4. Recensione Experiment
Visualizza tutti i passi previsti per verificare gli errori e tornare a correggerli.
1.5. Eseguire Experiment
Inserire i dettagli necessari, compresa l'ubicazione dei file di dati. Immettere la temperatura desiderata per l'esperimento. Se sensori richiedono ancora prewetting, selezionare l'opzione di ritardare di iniziare l'esperimento. Infine, una volta tutta la preparazione del campione è completa (fase 2) e sia il piatto del campione e il vassoio del sensore vengono caricati nello strumento, fare clic sul pulsante Vai per eseguire il test.
2. Preparazione del campione
- Preparare un tampone appropriato. Buffer utilizzato per esperimenti mostrati nelle figure 3 e 5: MOPS 20 mm (3 - (N-morfolino) acido propanosulfonico), Tris (Tris (idrossimetil) ammino-metano) (aggiunti per aggiustare il pH a 8,0), 50 mM KCl. Includi BSA (albumina sierica bovina, acidi grassi liberi, 0.5mg / ml finale) nel tampone per tutte le fasi del test e per tutte le diluizioni della proteina biotinilato o partner di legame per minimizzare il legame non specifico di proteine ai sensori.
- Diluire la proteina biotinilato (ε) in tampone a una concentrazione adeguata (vedi introduzione).
- Preparare diluizioni del partner di legame (F 1 (-ε)) in tampone di saggio (vedi Consigli per il range di concentrazioni da utilizzare).
- Prewet sensori rivestite di streptavidina per almeno 10 minuti per rimuovere il loro rivestimento protettivo saccarosio. Rimuovere il rack sensore contenente dal vassoio sensore e inserire una piastra a 96 pozzetti a fondo del cassetto, scorrevole un angolo del piatto nella tacca di orientamento sul vassoio. Da utilizzare per la colonna di sensori, aggiungere 200 ml di tampone di saggio per pozzetto in quella colonna della piastra a 96 pozzetti. Ritorno il rack di sensori per il vassoio con l'orientamento corretto (con le schede negli slot).
- Come assegnato durante la programmazione nella Fase 1, riempire pozzi of piatto del campione con tampone di saggio o le diluizioni appropriate proteine, come in Figura 2. Evitare l'introduzione di bolle, in quanto possono causare rumore nel segnale ottico. Includere uno o più pozzi di riferimento che omettono (i) di proteine biotinilato o (ii) partner di legame.
- Aprire lo sportello dello strumento e inserire il vassoio sensore sul palco (a sinistra), con le schede del vassoio inseriti nelle fessure del palcoscenico. Inserire la piastra del campione nel supporto piastra (a destra), fare in modo che la piastra è seduto piatta e con l'orientamento corretto, come indicato sul porta targa. Chiudere la porta e avviare il test dal programma di acquisizione dati (fase 1.5).
3. Elaborazione dati
- Dopo che il test è stato eseguito, aprire il software di analisi dei dati e caricare la cartella contenente i dati. Fare clic sulla scheda "Processing" per visualizzare un menu graduale Processing (a sinistra) e dati cinetici prime, con ogni sensore (AH) assegnato un colore diverso (vediFigura 3).
- In "Selezione dati", fare clic sul pulsante "Selezione sensore". Sul "Map Sample Piatto", designa i pozzetti per 1 o 2 sensori di controllo (G, H in analisi della figura 3) come pozzi di riferimento. Dal menu Processing, selezionare la casella "sottrazione" e selezionare "Reference Wells" per sottrarre segnale di riferimento (singolo o media) dal segnale di ogni altro sensore.
- Allineare tutte le tracce di Y = 0 tramite il passo "Allinea asse Y". Selezionare "Baseline", come il passo di allineamento (questa è l'ultima linea di base prima della fase Association). Per "Intervallo di tempo", inserire gli ultimi 10 secondi di quella basale (cioè 50-60 sec per 60 sec di base, come nella figura 3).
- Seleziona la casella "Inter-step di correzione" per ridurre al minimo i turni di segnale tra le fasi associazione e dissociazione. Selezionare adeguamento alla Baseline o dissociazione.
- Selezionare la funzione di filtraggio Savitzky-Golay nella maggior parte dei casi e fare clic su "dati di processo!" per procedere. Ispezionarei dati definitivi elaborati (in basso pannello di destra). Con saggi destinati ad analisi di dati globale (come in figura 4), se le tracce di segnale mostrano un significativo spostamento tra associazione e di dissociazione passi, modificare la selezione di dissociazione o Baseline per la "correzione Inter-passo" e rielaborare i dati prima di procedere al Data Analisi.
4. Analisi dei dati
Fare clic sulla scheda "Analisi" in Analisi dei dati per iniziare. Nota: l'esempio di seguito sono i passaggi per l'analisi globale di molteplici curve di legame / dissociazione (come nella figura 3).
- Per "Passo a Analizza", scegli associazione e dissociazione. Per il "Modello", selezionare 1:1. Nota: sono disponibili altre opzioni limitate.
- Per il "Lato", scegli Globale (Full). Per il "Raggruppamento", selezionare colore (come sul grafico). Selezionare "R max disgiunta da sensore" per consentire il montaggio indipendente di R max (risposta del segnale massimo su saturando vincolante della partner alla proteina immobilizzata). Nota: lo facciamo per la maggior parte dei saggi, come sensori variano leggermente la quantità di proteina immobilizzata (vedi figura 3, Loading).
- Sul tavolo dimostrato, assicurarsi che tutte le tracce di sensori da analizzare hanno lo stesso colore, in modo che saranno analizzati come un insieme globale. Se necessario, selezionare uno o più sensori tracce di omettere dal raccordo globale: sotto la colonna "Include", fare clic destro sulla posizione del sensore desiderata e selezionare "Escludi Wells".
- Fare clic su "Curve Fit!" per avviare l'analisi di regressione non lineare. Esaminare i risultati di montaggio, tra cui (i) sovrapposizione delle curve di regressione con dati tracce dei sensori (come in figura 4), (ii) appezzamenti di residui di montaggio, e (iii) una tabella con i valori dei parametri determinati (costanti di velocità, R max, K D) e le statistiche (errori standard per i parametri, Chi-quadrato, R 2).
- In "Esporta dati", salvare i risultati montaggio facendo clic su "Esporta tabella di. Csv File". Per grapHing o ulteriori analisi dei dati / curve a muro con altri software, fare clic su "Esporta Montaggio risultati" per salvare i dati di ogni sensore e la curva montato in un file di testo.
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Representative Results
Vincolante in tempo reale e la cinetica di dissociazione BLI sono mostrato in Figura 3. Questo esperimento è stato fatto con tampone di saggio in associazione e di dissociazione. Questo esperimento è stato avviato con una fase basale 10 min poiché i sensori sono stati prewet solo brevemente. Successivamente, ε biotinilato è stato caricato sui sensori. Nessuna dissociazione rilevabile di ε si è verificato in tutti i passaggi rimanenti come si è visto dalla curva di riferimento (G) che non aveva partner di legame aggiunto. Un secondo sensore di riferimento (H) era privo di proteina immobilizzata e ha mostrato bassa legame non specifico del partner di legame. Varie concentrazioni di F 1 (-ε) sono stati utilizzati nella fase associazione per i sensori AF per adattarsi risultati a livello globale e ottenere i migliori valori di k A, K d e K D. I risultati sono stati elaborati come nel protocollo, cedendo le tracce di dati (blu) in Figura 4. In questo caso, sensore di riferimento traccia H è stato sottratto da campione trassi per correggere il legame non specifico del partner e il segnale del sistema deriva vincolante. Nella fase di analisi dei dati, tutte le curve erano globalmente forma con un modello a 1:1 (k un singolo, unico k d); "Global (Figura)" fit assume completa dissociazione del partner di legame (segnale di ritorno a zero a infinito tempo) (Figura 4, rosso). Si noti che, per le due più alte concentrazioni di F 1 (-ε), ci sono piccoli ma significativi scostamenti dei dati dal 1:1 modello globale. Bassi livelli di ligando immobilizzato (biotinilato subunità "ε") sono stati utilizzati, e la misura non è stata migliorata includendo un fattore trasporto di massa nel modello (non mostrato). Tuttavia, F 1 (- "ε") è un grande complesso (~ 350 kDa), e altri esperimenti (non mostrati) suggeriscono che queste deviazioni sono dovute alla ridotta accessibilità vincolante di una frazione del ligando immobilizzato, cioè un F 1 legato a uno "ε" può stericamente ostacolare l'accesso ad un altro biotinilato"Ε" vincolato sullo stesso tetramero streptavidina.
La Figura 5 mostra un diverso esperimento in cui l'enzima è stato legato al sensore-ε immobilizzato in presenza di 1 mM ATP / EDTA; questo predispone maggior F 1 / complessi "ε" per assumere la conformazione noninhibitory, che dissocia rapidamente 8. I sensori sono stati poi trasferiti alla dissociazione pozzetti contenenti tampone con differenti ligandi. Ciò dimostra gli effetti di diversi ligandi sulla conformazione di ε. Ad esempio, l'esposizione a MgADP / Pi rallentato drasticamente dissociazione netta, indicando che ε spostato conformazione al strettamente legato, lo stato di inibizione. Cinetica di dissociazione complesse sono state osservate in quanto differenti ligandi causato diversi turni nella frazione di F 1. Complessi ε, con ε nella (separabili) o inibitori (nondissociable) conformazioni attive. E 'anche possibile che i cambiamenti conformazionali sostanziali di proteine legatecontribuiscono direttamente alle variazioni del segnale BLI ma, nei nostri studi, questo sembra essere trascurabile rispetto al segnale per il legame / dissociazione del grande complesso F 1 (vedi Shah et al 8, Figura 5D;. transizione alle curve 3 e 6 mostrano comportamento molto simile, anche se le loro condizioni favoriscono conformazioni distinte di F legato 1). Il software di analisi dei dati non è stato progettato per tali cinetica di dissociazione complessi. Così, abbiamo esportato i dati in file di testo per l'analisi di regressione lineare con altri software.
Figura 1. Principi di Bio-strato Interferometria. Animation riassume la fisica di base per la rilevazione di interazione biomolecolare da BLI. La luce che passa attraverso le sonde viene riflessa verso spettrofotometri (i) dalla superficie interna del sensore e (ii) dall'esterno ininterfaccia del sensore con la soluzione campione. Ciò si traduce in uno schema di interferenza. Il legame di molecole sulla superficie del sensore cambia il modello di interferenza. Questo può essere tracciato come uno spostamento nanometri di relativa intensità vs lunghezza d'onda. Il monitoraggio di questo cambiamento nanometri nel corso del tempo fornisce una cinetica di associazione e di dissociazione. La grafica è adattato con il permesso di FortéBio 12.
Figura 2. Schematica di campioni nella piastra a 96 pozzetti campione. I sensori vengono spostati in parallelo da colonna a colonna e può essere spostato a destra oa sinistra, come definito in un particolare protocollo di dosaggio. Wells con colore grigio rappresentano tampone mentre il rosso, blu e verde rappresentano proteina immobilizzata, socio e liga vincolantends, rispettivamente.
Figura 3. Cattura dello schermo che mostra i dati grezzi da un test BLI. Linee rosse verticali indicano il movimento di sensori tra i passaggi del test del protocollo. Tipi di step sono indicati sull'immagine. Località di tampone e campioni ottenuti sono riportati nella Figura 2. Come notato da numeri lungo la parte superiore del grafico, sensori rivestite di streptavidina sono stati spostati tra le diverse colonne della piastra del campione nel seguente ordine: 123.454. La legenda sotto il grafico indica il colore traccia dati di ciascun sensore. Nella fase di caricamento, ogni sensore eccetto H è stato incubato con 50 nM biotinilato subunità "ε". Nella fase di associazione, i sensori sono stati incubati con concentrazioni nM di "ε" impoverito F-1: 30 (A, H), 20 (B), 15 (C), 10 (D), 5 (E), 2.5 (F), 0 nM (G). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 4. Cattura dello schermo dei dati analizzati dal test BLI di figura 3. I dati sono stati elaborati e munito come descritto nel testo. A pochi passi di associazione e la dissociazione sono indicate, divise da una linea verticale rossa. Le curve di dati trattati sono di colore blu, la regressione lineare si adatta da 1:1 analisi globale sono mostrati in rosso. Risultati adatti Global 8: K A = 2 x 10 5 m -1 s -1 (± 0,1%), K d = 4,8 x 10 -5 s -1 ("±" 0,1%), ottenendo K D = 0,24 nM. Bontà di adattamento: R2 = 0,999,054 mila. Il parametro vincolante massimo (R max) era adatta separatamente per ciascun sensore, con valore medio = 0,813 nm ("±" 0,0803). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 5. Risultati di un test BLI che mostra gli effetti allosterici dei ligandi sulla conformazione di ε. F 1 (-ε) è stato destinato a ε sensore immobilizzato in presenza di 1 mM ATP / EDTA. Sono presenti alla fine della fase di associazione e una porzione della fase di dissociazione. Durante la fase di dissociazione, ligandi distinti per F 1 siti catalitici (elencati per ogni traccia) sono stati inclusi per osservare i loro effetti allosterici sulla dissociazione di F 1
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Discussion
Strumenti attualmente disponibili per BLI permettono di throughput e di flessibilità nella saggi per interazioni biomolecolari. Vari campioni di soluzione vengono dispensati in pozzetti della micropiastra nero, e una serie di sensori BLI parallele sono programmati per muoversi avanti e indietro tra colonne di pozzetti sulla piastra. I campioni vengono mescolati agitando orbitale durante tutta la seduta. Il sistema utilizzato qui ha 8 sensori e utilizza una piastra campione di 96-bene, ma un altro sistema utilizza 16 sensori e una piastra campione 384-bene. Così, l'interazione tra un sensore biomolecola immobilizzata e il suo partner di legame in soluzione può essere testato in diverse condizioni con sensori multipli in parallelo. Per esempio, nel primo saggio qui presentato con la subunità inibitoria ε immobilizzato, interazioni sono state misurate con sei differenti concentrazioni di enzima (partner di legame) in parallelo (figure 3 e 4). Questo ha permesso un'analisi globale per determinabilene una singola coppia di costanti di velocità (k a, k d) per netto vincolante e dissociazione, e quindi una costante di equilibrio di dissociazione (K D = k d / k a), che concorda strettamente con la costante di inibizione (Ki) determinato dal saggi soluzione di inibizione dell'enzima da ε 8. Un secondo tipo di esperimento (Figura 5) ha dimostrato che BLI può anche monitorare gli effetti allosterici di piccoli ligandi sulle interazioni tra due proteine, gli effetti di diversi ligandi sono stati confrontati in parallelo. Esistono limitazioni per gli effetti dei ligandi allosterici rilevare, poiché segnale BLI dipende dalla massa della molecola legante, e può rilevare direttamente vincolante di piccoli composti in condizioni ottimizzate 13. Tuttavia, nel saggio di figura 5, il partner di legame, F 1, era un grande complesso proteico (~ 347 kDa), quindi il segnale BLI per la sua / dissociazione di legame non ha influito significativamente annunciodizionale legame di piccoli ligandi quali ATP (~ 500 Da) al complesso F 1. Ciò è stato confermato con saggi in cui questi ligandi non influenzano il segnale BLI per F 1 legato ad una forma troncata della ε manca la inibitorio CTD 8. Così, saggi di effetti allosterici deve considerare la massa del ligando allosterico relativa alle masse delle proteine interagenti, e preferibilmente includere controlli a prova di risposta diretta BLI al legame del ligando.
Si noti che alcuni passaggi e modifiche del protocollo sperimentale può essere fondamentale per ottenere risultati migliori e più accurata analisi. Per esempio, come nel protocollo qui descritto (vedere i passi 1.2.3, 1.2.5), un saggio destinato all'analisi globale di legare e costanti di velocità di dissociazione dovrebbe includere una fase basale aggiuntivo (vedere il punto 1.2.3) in una nuova colonna di pozzi tampone (Figura 2, colonna 4) prima della fase di associazione, ed i sensori devono essere returned alla stessa colonna di pozzi tampone per la fase di dissociazione (vedere la fase 1.2.5). Avendo ciascun sensore nella stessa ben (con le stesse proprietà ottiche) prima e dopo la fase di associazione può migliorare la correzione inter-passo (step 3.4) per passi di associazione / dissociazione, e questo facilita il montaggio cinetica globale di tracce multiple di dati (come in Figura 4). Inoltre, per le analisi che sono più anticipato rispetto a quanto mostrato qui, il programma ha la possibilità di accorciare o prolungare il tempo di ogni passo durante il saggio (mentre è la fase attiva). Ciò è utile, ad esempio, se il segnale di carico ottimale non è già noto, o se è necessario più tempo per consentire la dissociazione sufficiente per ottenere una buona misura per il tasso di dissociazione.
Legame non specifico del partner di legame alla superficie del sensore può essere un problema per i metodi label-free come SPR e BLI. Nei nostri test, questa è stata inibita efficacemente includendo BSA in tampone di saggio. Come in immunoblotprotocolli di presa, è stato possibile utilizzare proteine diverse da BSA, e basse concentrazioni di detersivo può anche ridurre il legame non specifico (Tween20 è utilizzato in tampone cinetica dal fornitore). Anche con il minimo legame non specifico, la maggior parte dei saggi dovrebbero comprendere almeno un sensore di controllo senza proteina immobilizzata ma con la più alta concentrazione di partner di legame nella fase di associazione (vedere Figura 3, sensore H); sottrazione del legame non specifico residuo (e il suo decadimento durante la fase di dissociazione) può migliorare significativamente le analisi cinetica per il legame specifico / dissociazione in fase di studio. D'altra parte, una volta saggi iniziali confermano che la proteina biotinilato rimane stabilmente vincolata dopo la fase di carico (vedi Figura 3, sensore G), tale controllo può essere omessa e tale sensore può essere utilizzato per una condizione campione.
Per robusta determinazione della associazione e dissociazione costanti di velocità utilizzando BLI, più concentrazioni di bPartner inding dovrebbe essere utilizzato e tutte le tracce di dati deve essere in forma da un'analisi globale, se possibile (come nelle figure 3 e 4). Idealmente, la gamma di concentrazioni deve estendersi ~ 10 volte sopra e sotto il K stimato D. Nel nostro caso, con una interazione ad alta affinità (K D = 0,25 nM), il rapporto segnale-rumore-era scadente per il legame cinetica con concentrazioni sub-K D. Così, le concentrazioni di partner di legame sopra la K D sono stati usati in modo tale che sono stati ottenuti variazioni significative nei tassi e livelli di legame osservati (vedi Figura 3). Inoltre, una lunga fase di dissociazione è stato usato per migliorare la fiducia nel montaggio del tasso di dissociazione lento. Con interazioni ad alta affinità, è possibile anche che lenta dissociazione esagera riassociazione durante la fase di dissociazione, poiché saggi BLI sono fatte in un campione agitata anziché flusso continuo sul sensore, come per SPR. Questo potenziale artefatto può essere testato con comedice che il buffer di dissociazione contiene un 'sink' di proteina competitiva eccesso che lega dissociato partner di legame e impedisce di riassociazione alla proteina immobilizzata sensore-14. Nel nostro sistema, questo è stato fatto confrontando i risultati con e senza nonbiotinylated (> 10 volte sopra K D) nel dissociazione bene, e ci ha confermato che la rilegatura non è stato un problema significativo 8. Infine, se insiemi di risultati cinetici non sono adatti bene da un'analisi globale (01:01 o 02:01 modelli disponibili), ci sono altre opzioni di analisi per la risoluzione dei problemi. Ad esempio, invece di scegliere "Global (Full)" (in fase 4.2), "locale" possono essere scelti per soddisfare ogni traccia sensore indipendente. Se vincolante segue un semplice modello di 1:01, riportando le tariffe vincolanti osservati (k OB) contro le concentrazioni di rilegatura partner dovrebbe mostrare una dipendenza lineare, con la pendenza uguale al secondo ordine, il tasso di legame intrinseco. La scheda Analisi del software ha un "XYfinestra del grafico ", che permette una rapida visualizzazione di questo rapporto.
Una limitazione dello strumento che abbiamo usato è l'intervallo di temperatura disponibili. Con un intervallo di 2 ° C sopra la temperatura ambiente a 40 ° C, solo le molecole che sono stabili in tale intervallo possono essere usate. Inoltre, l'analisi termodinamica è limitata dalla ristretta gamma di temperatura. Un'altra limitazione generale è che il tempo massimo saggio è ~ 4 ore, dopo questo, artefatti sviluppano a causa dell'evaporazione dei campioni da micropiastra aperto.
BLI comporta una disposizione relativamente semplice rispetto al SPR. I sensori vengono spostati tra colonne di pozzetti con volumi fissi, piuttosto che un flusso costante di campione sul sensore. Anche se non è così sensibile come SPR, BLI è meno influenzato da variazioni di indice di rifrazione a causa di cambiamenti nella composizione del campione. Nel complesso, con questa relativa facilità d'uso e flessibilità dello strumento a spostare tra condizioni di saggio, BLI fornireSA strumento versatile per test in vitro delle interazioni biomolecolari.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo FortéBio per fornire grafica utilizzata in Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere GM083088 a TMD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
References
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