Interferometría Bio-capa para Cinética de interacciones proteína-proteína y alostéricos Efectos ligando medición

Summary

Los protocolos siguientes describen ensayos cinéticos de las interacciones proteína-proteína con Interferometría Bio-capa. F-tipo ATP sintasa, que está implicado en el metabolismo de la energía celular, puede ser inhibida por su subunidad ε en bacterias. Hemos adaptado Interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones del complejo catalítico con el dominio del ε inhibidora C-terminal.

Abstract

Se describe el uso de la interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones inhibidoras de ε subunidad con el complejo catalítico de Escherichia coli ATP sintasa. Bacteriana de tipo F ATP sintasa es el objetivo de un nuevo antibiótico, aprobado por la FDA para combatir la tuberculosis resistente a los medicamentos. La comprensión de bacterias específicas auto-inhibición de la ATP sintasa por el dominio C-terminal de la subunidad ε podría proporcionar un nuevo medio para orientar la enzima para el descubrimiento de fármacos antibacterianos. El dominio C-terminal de ε sufre un cambio conformacional dramática cuando las transiciones de la enzima entre los estados activos e inactivos, y ligandos de sitio catalítico pueden influir en cuál de conformaciones de ε es predominante. El ensayo mide la cinética de unión / disociación de ε con el complejo catalítico, e indirectamente meaSures el cambio de ε unido a la enzima hacia y desde la conformación inhibidor aparentemente nondissociable. La señal de interferometría Bio-capa no es excesivamente sensible a la composición de la solución, por lo que también se puede utilizar para vigilar los efectos alostéricos de ligandos de sitio catalítico sobre los cambios conformacionales de ε.

Introduction

Interacciones proteína-proteína son importantes para muchos procesos biológicos, y los métodos ópticos de etiqueta libre como resonancia de plasmón superficial (SPR) se han utilizado in vitro para estudiar la cinética de la unión y la disociación ^1. La mayoría de los métodos de etiquetado libre inmovilizar una biomolécula en una superficie del sensor y el uso de una señal óptica para detectar una pareja de unión de la solución, ya que se asocia con la biomolécula inmovilizada ^1. Mientras SPR es un método altamente sensible, es propenso a la interferencia debido a los cambios en el índice de refracción de la solución que fluye sobre el sensor ^2. Aunque no es tan sensible como la SPR, Bio-capa de Interferometría (BLI) se ve menos afectada por cambios en la composición de la muestra ^1,3. BLI utiliza biosensores de fibra óptica que tienen un recubrimiento biocompatible patentada en la punta. El sistema utilizado aquí (Octeto-RED96) contiene ocho espectrofotómetros. La luz blanca se canaliza a una fila de sondas que se mueven en un brazo robótico. Los sensores de fibra óptica are recogido por las sondas y se trasladó a una placa de 96 pocillos que contenía las muestras. Una de las moléculas diana se inmoviliza sobre la superficie del biosensor. Entonces sensores se mueven a los pocillos que contienen la pareja de unión en solución. BLI supervisa asociación de la pareja de unión con la molécula inmovilizada y, a continuación, controla la disociación después de mover los sensores a la solución sin la pareja de unión. La unión de moléculas a la superficie del biosensor conduce a cambios en la interferencia óptica entre las ondas de luz que reflejan de nuevo a los espectrofotómetros de una superficie interna y desde la interfaz externa entre el sensor y la solución. Estos cambios en la interferencia pueden ser cuantificados y se utilizan para determinar las constantes de transferencia de la unión y la disociación, que se resumen en la animación de la figura 1.

Hemos aplicado BLI para medir las interacciones entre el complejo catalítico de la ATP sintasa bacteriana y su subunidad ε, que puede auto-inhiben la enzima. Sy ATPnthase es un nanomotor rotatorio membrana embebido que cataliza la síntesis y la hidrólisis de ATP ^4. El complejo catalítico (F ₁₎ se puede aislar en una forma soluble que funciona como una ATPasa. Ε Subunidad tiene dos dominios: el dominio N-terminal (NTD) es necesario para el montaje correcto y el acoplamiento funcional de la enzima pero no interactuar directamente con las subunidades catalíticas, el dominio C-terminal (CTD) puede inhibir la enzima mediante la interacción con múltiples subunidades catalíticas ^5,6. Esta regulación ε-mediada es específico de ATP sintasas bacterianas y no se observa en el homólogo mitocondrial. ATP sintasa se ​​ha convertido en un objetivo para los fármacos antibacterianos, como lo demuestra la reciente aprobación de la FDA de bedaquiline para tratar la tuberculosis resistente a los medicamentos ^7. Por lo tanto, la orientación papel inhibidor de ε para el descubrimiento de fármacos podría producir antibacterianos que no inhiben la ATP sintasa mitocondrial. Con el complejo catalítico aislada (F _1), εse convierte en una subunidad disociable. Sin embargo, con ε unida a F _1, la εCTD puede sufrir un cambio conformacional dramática, parcialmente insertar en la cavidad central de la enzima y la formación de un estado de inhibición que es poco probable que se disocian directamente ^6,8. Utilizamos BLI para medir la cinética de F ₁ / ε de unión y de disociación, e indirectamente, para examinar los efectos alostéricos de sitio catalítico de ligandos sobre la conformación de ε.

En nuestro sistema, ε fue elegido para la inmovilización en la superficie del sensor ya que la señal de BLI (como SPR) es sensible a la masa de las moléculas de unión en la superficie. La subunidad ε es pequeño (~ 15 kDa) en relación con el principal complejo de F ₁ (~ 347 kDa). Por lo tanto, una señal de BLI más grande será el resultado de la unión de F ₁ a ε inmovilizada. Con el fin de supervisar F ₁ disociación, que puede ser muy lento, ε deben estar fuertemente inmovilizado. Por lo tanto se optó por biotinilar; E inmovilizarlo sobre biosensores recubiertas con estreptavidina. Las proteínas pueden ser biotinilados por (i) modificación aleatoria de lisinas superficiales ^9, (ii) reacción de una cisteína nativo o de ingeniería único con un reactivo de maleimida-biotina ¹⁰ o (iii) añadir genéticamente un péptido específico de biotina-aceptor que está biotinilado durante enzimáticamente la expresión in vivo de la proteína marcada ^11. En nuestro sistema, ε está biotinilado utilizando el método (iii) ^8. Una vez ε-biotina marcado se inmoviliza sobre sensores de estreptavidina, BLI puede medir la unión y la disociación de F ₁ que ha sido empobrecido de la subunidad ε (F ₁ (-ε)). Para los experimentos descritos aquí, los ensayos preliminares se han realizado para determinar una cantidad razonable de la proteína biotinilada para inmovilizar en los sensores. Esto puede variar, dependiendo del peso molecular de la proteína y su pareja de unión, pero el objetivo es determinar una cantidad mínima de proteína A inmovilizada tsombrero proporciona (i) aceptable señal-a-ruido para la cinética de unión con una baja concentración de la pareja de unión (por debajo de K _D) y (ii) una distorsión mínima de la cinética de unión con la concentración cerca de la saturación de la pareja de unión. También, estequiometría de biotinilación puede variar (pero evite> 1 mol biotina / mol de proteína), por lo que puede ser necesario algún ensayo inicial para cada nuevo lote de proteína biotinilada para confirmar que una señal de BLI consistente se puede lograr durante la inmovilización en el recubiertas con estreptavidina sensores.

Protocol

1. Programación del Instrumento de Ensayo BLI

Encienda el instrumento por lo menos una hora de antelación para que la lámpara se caliente, lo que es necesario para minimizar el ruido y la deriva de la señal óptica durante el experimento. Ajuste la temperatura deseada a través de la pestaña instrumento para precalentar el soporte de la placa de la muestra. Entonces pongo el diseño experimental en el software de adquisición de datos. Seleccione "Experimento Nueva Cinética" en la ficha Asistente Experimento. Esto presenta un menú con pestañas con todos los pasos que se deben definir.

1.1. Placa Definición

Definir las columnas para ser utilizado en la placa de muestra de 96 pocillos. Asignar columnas para contener tampón, proteína inmovilizada o pareja de unión. Para cada asociación bien, introduzca la concentración de la pareja de unión que se utilizará. Nota: la definición placa mostrada en la Figura 2 tiene opciones para ensayos distintos.

1.2. Ensayo Definición

ONTENIDO "> Definir todos los pasos necesarios para el ensayo. Estos incluyen (i) Línea de base (varios), (ii) la carga, (iii) Asociación y (iv) La disociación de la pareja de unión. Entonces, tal como se describe a continuación, ligarse etapas de ensayo individuales con columnas de los pozos de la placa de la muestra mediante la selección de la etapa de ensayo y, a continuación, haga doble clic en la columna respectiva. Estos programas de los sensores que se mueven de una columna de pozos a otra durante el ensayo.

1. Base
   Comenzar con un paso de línea de base breve (≥ 60 seg), con sensores en tampón de ensayo (Figura 2, columna 1), para establecer señales iniciales BLI en la placa de 96 pocillos.
2. Cargando (inmovilización de la proteína biotinilada en los sensores)
   Asignar los sensores a los pozos que van a contener la proteína biotinilada (Figura 2, columna 2). Utilice la función de umbral para alcanzar un nivel predeterminado de unión (véase la Introducción). Establezca la opción de umbral de modo que todos los sensores estarán movimientoD a la siguiente columna de pozos cuando uno cualquiera de los sensores alcanza el umbral.
3. Base
   Incluir un paso de línea de base en tampón (Figura 2, columna 3; típicamente> 5 min) para lavar las proteínas biotiniladas no inmovilizado a partir de los sensores y establecer nuevos, señales de línea de base estable. Para los ensayos básicos de unión / de disociación sólo (como en la Figura 3), incluir un paso adicional de línea de base (60 seg) con sensores en nuevos pozos de tampón (Figura 2, columna 4) antes de la etapa de asociación.
4. Asociación (de la pareja de unión a la proteína inmovilizada)
   Para un ensayo básico de unión / disociación (como en la Figura 3), seleccionar un rango de concentraciones de pareja de unión que se utilizará para diferentes sensores / pozos (Figura 2, columna 5). Ajustar el tiempo de paso de manera que al menos una concentración de saturación de la pareja de unión debe enfoque de equilibrio señal de unión. Para unaensayo para probar los efectos alostéricos de pequeños ligandos sobre la disociación del complejo proteína-proteína (como en la Figura 5), seleccionar un único alta concentración de pareja de unión (~ 10 veces por encima de la estimación de K _D) para su uso en todos los pocillos de asociación.
5. Disociación (de la pareja de unión)
   Para un ensayo básico de unión / disociación sólo (como en la Figura 3), designar los sensores para volver a la columna 4 (figura 2), los mismos pozos tampón tal como se utiliza para la línea de base extra antes de Asociación. Para un ensayo para probar los efectos alostéricos de pequeños ligandos, en lugar designar sensores para mover a la columna 6 (Figura 2), donde cada pocillo puede contener tampón más diferentes ligandos alostéricos.

1.3. Asignación de sensor

Indique las ubicaciones en la bandeja de sensor que contendrá sensores prehumedecida para el ensayo. Identifique las posiciones vacías ya que el experimento será FAIl si hay sensores son recogidos.

1.4. Experimento Comentario

Visualice todas las medidas planificadas para verificar si hay errores y volver a corregirlos.

1.5. Ejecutar Experimento

Introduzca los datos necesarios, incluyendo la ubicación de los archivos de datos. Introduzca la temperatura deseada para el experimento. Si los sensores todavía requieren prehumectación, seleccione la opción de aplazar el inicio del experimento. Por último, una vez que toda la preparación de la muestra es completa (paso 2) y tanto la placa de la muestra y la bandeja de sensor se cargan en el instrumento, haga clic en el botón Continuar para realizar el ensayo.

2. Preparación de la muestra

1. Preparar un tampón de ensayo adecuado. Tampón utilizado para los experimentos mostrados en las Figuras 3 y 5: 20 mM de MOPS (3 - (N-morfolino) propanosulfónico), Tris (Tris (hidroximetil) amino-metano) (añadido para ajustar el pH a 8,0), 50 mM de KCl. Incluya BSA (albúmina de suero bovino, libre de ácidos grasos, 0.5mg / ml final) en el tampón para todas las etapas del ensayo y para todas las diluciones de la proteína biotinilada o pareja de unión para minimizar la unión no específica de proteínas a los sensores.
2. Diluir la proteína biotinilada (ε) en tampón de ensayo a una concentración apropiada (véase la introducción).
3. Preparar diluciones de la pareja de unión (F ₁ (-ε)) en tampón de ensayo (véase la discusión para el rango de concentraciones para usar).
4. Prehumedecido los sensores recubiertas de estreptavidina durante al menos 10 minutos para eliminar el recubrimiento de sacarosa protector. Retire el bastidor que contiene el sensor-de la bandeja de sensor y insertar una placa de 96 pocillos en la parte inferior de la bandeja, deslizando una esquina de la placa en la muesca de orientación en la bandeja. Para la columna de sensores para ser utilizado, añadir 200 l de tampón de ensayo por pocillo en que la columna de la placa de 96 pocillos. Devuelva el estante de los sensores a la bandeja con la orientación correcta (con pestañas en las ranuras).
5. Como asignado durante la programación en el paso 1, llenar los pozos of la placa de muestra con tampón de ensayo o las diluciones de proteínas apropiadas, como en la Figura 2. Evitar la introducción de burbujas, ya que pueden causar ruido en la señal óptica. Incluir uno o más pocillos de referencia que omiten o bien (i) la proteína biotinilada o (ii) la pareja de unión.
6. Abra la puerta del aparato e inserte la bandeja de sensor en la etapa (a la izquierda), con las lengüetas de la bandeja se insertan en las ranuras de la etapa. Introduzca la placa de la muestra en el soporte de la placa (a la derecha), asegúrese de que la placa está sentado plana y en la orientación correcta, tal como se indica en el soporte de la placa. Cierre la puerta y comience el análisis del programa de adquisición de datos (paso 1.5).

3. Proceso de datos

1. Después de que el ensayo se ha ejecutado, abre el software de análisis de datos y la carga de la carpeta que contiene los datos. Haga clic en la pestaña de "elaboración", para ver un menú por pasos de procesamiento (a la izquierda) y los datos cinéticos primas, con cada sensor (AH) asignado un color diferente (verLa Figura 3).
2. Bajo "Selección de datos", haga clic en el botón "Selección del sensor". En el "Mapa Sample Plate", designar a los pozos para 1 o 2 sensores de control (G, H en el ensayo de la Figura 3) como pozos de referencia. En el menú Procesamiento, marque la casilla "Resta" y seleccione "Referencia Wells" para restar la señal de referencia (simple o promedio) de la señal de cualquier otro sensor.
3. Alinear todos los rastros que Y = 0 utilizando el paso "Alinear eje Y". Seleccione "Línea Base" como el paso de alineación (que es la última línea de base antes de la etapa de Asociación). Para el "Intervalo de tiempo", introduzca los últimos 10 seg de que la línea de base (es decir, 50 a 60 segundos para una línea de base de 60 segundos, como en la figura 3).
4. Marque la casilla "Inter-paso de corrección" para reducir al mínimo los cambios de señal entre los pasos de asociación y disociación. Seleccione alinear a línea de base o disociación.
5. Seleccionar la función de filtrado Savitzky-Golay en la mayoría de los casos y haga clic en "Proceso de datos!" para proceder. Inspeccione visualmentelos datos finales procesados ​​(panel inferior derecho). Con ensayos destinados para el análisis global de datos (como en la Figura 4), ​​si trazas de señal muestran un cambio significativo entre la Asociación y pasos de disociación, cambiar la selección de la disociación o de línea de base para la "Corrección Inter-paso" y volver a procesar los datos antes de proceder a los datos Análisis.

4. Análisis de Datos

Haga clic en la pestaña "Análisis" en el análisis de datos para comenzar. Nota: el ejemplo de los pasos a continuación son para el análisis global de múltiples curvas de unión / disociación (como en la Figura 3).

1. Por "paso a Analizar", elija asociación y disociación. Para el "Modelo", seleccione 1:01. Nota: Las demás opciones disponibles son limitados.
2. Para el "montaje", elija Global (Full). Para "Agrupar por" seleccione Color (como en el gráfico). Seleccione "R _max UNLINKED Por Sensor" para permitir la instalación independiente de R _max (respuesta de la señal máxima a saturar la unión del partner a la proteína inmovilizada). Nota: hacemos esto para la mayoría de los ensayos, como los sensores varían ligeramente en la cantidad de proteína inmovilizada (véase la Figura 3, cargando).
3. En la tabla que se muestra, asegúrese de que todos los rastros de los sensores para ser analizados tienen el mismo color, por lo que serán analizados como un conjunto global. Si es necesario, seleccione uno o más sensores traza omitir de ajuste mundial: en la columna "Incluir", haga clic en la posición del sensor deseado y seleccione "Excluir Wells".
4. Haga clic en "ajuste de curvas!" para iniciar el análisis de regresión no lineal. Examine los resultados apropiados, que incluyen (i) superposición de las curvas de regresión con los rastros de datos del sensor (como en la figura 4), ​​(ii) los gráficos de residuos de ajuste, y (iii) una tabla con valores de los parámetros determinados (constantes de velocidad, R _max, K _D) y la estadística (errores estándar de los parámetros, Chi-cuadrado, ^R2).
5. En la sección "Exportación de datos", guardar los resultados de ajuste haciendo clic en "Exportar tabla a. Csv Archivo". Para graphing o más análisis de datos / curvas ajustadas con otro software, haga clic en "Exportar resultados apropiados" para guardar los datos de cada sensor y curva ajustada en un archivo de texto.

Representative Results

De unión en tiempo real y la cinética de disociación BLI se muestra en la Figura 3. Este experimento se realizó con tampón de ensayo en asociación y disociación. Este experimento se inició con una etapa de línea de base 10 minutos ya que los sensores se han prehumedecido sólo brevemente. Siguiente, ε biotinilado se cargó en los sensores. No disociación detectable de ε se produjo a lo largo de todos los pasos restantes como se ve desde la curva de referencia (G), que no tenía pareja de unión agregó. Un segundo sensor de referencia (H) carecía de proteína inmovilizada y mostró baja unión no específica de la pareja de unión. Varias concentraciones de F ₁ (-ε) se utilizaron en el paso de asociación para los sensores AF para poder adaptarse a los resultados a nivel mundial y obtener los mejores valores para k _a, k _d, y _KD. Los resultados se procesaron como en el protocolo, dando los rastros de datos (azul) en la figura 4. En este caso, sensor de referencia de traza H se resta de la muestra TRases para corregir la unión no específica de la pareja y la señal del sistema de deriva vinculante. En la etapa de análisis de datos, todas las curvas eran globalmente ajuste con un modelo 1:1 (solo k _una sola k _d), el "Global (Full)" ajuste supone la disociación completa de la pareja de unión (señal volverá a cero al infinito tiempo) (Figura 4, rojo). Tenga en cuenta que, para las dos concentraciones más altas de F ₁ (-ε), hay pequeñas pero significativas desviaciones de los datos de la, modelo global 01:01. Se utilizan bajos niveles de ligando inmovilizado (biotinilado subunidad "ε"), y el ajuste no se mejoró mediante la inclusión de un factor de transporte de masa en el modelo (no mostrado). Sin embargo, F ₁ (- "ε") es un gran complejo (~ 350 kDa), y otros experimentos (no mostrados) sugieren que estas desviaciones se deben a la reducción de la accesibilidad de unión de una fracción de ligando inmovilizado, es decir, un F ₁ unido a uno "ε" puede estéricamente obstaculizar el acceso a otro con biotina"Ε" obligado en el mismo tetrámero de estreptavidina.

La Figura 5 muestra un experimento diferente en el que la enzima se unió al sensor-ε inmovilizada en presencia de 1 mM de ATP / EDTA; este predispone la mayoría de los complejos de F ₁ / "ε" para asumir la conformación no inhibidor, que se disocia fácilmente ^8. Los sensores fueron luego se trasladó a la disociación pocillos que contenían tampón de ensayo con diferentes ligandos. Esto demuestra los efectos de diferentes ligandos en la conformación de ε. Por ejemplo, la exposición a MgADP / Pi desaceleró drásticamente disociación neta, lo que indica que ε se desplazó a la conformación, estado de inhibición herméticamente atado. Se observaron cinética de disociación complejos desde diferentes ligandos causaron diferentes turnos en la fracción de la F _1. Complejos ε con ε en los disociables () o inhibidoras conformaciones (nondissociable) activos. También es posible que los cambios conformacionales considerables de proteínas unidascontribuir directamente a los cambios en la señal de BLI pero, en nuestros estudios, esto parece ser insignificante en comparación con la señal para la unión / disociación del complejo F grande ₁ (véase Shah et al ^8, la Figura 5D;. transición a las curvas 3 y 6 muestran comportamiento muy similar, aunque sus condiciones favorecen conformaciones distintas de F cota _1). El software de análisis de datos no fue diseñado para este tipo de cinética de disociación complejos. Por lo tanto, hemos exportado los datos en archivos de texto para el análisis de regresión no lineal con otro software.

Figura 1. Principios de Interferometría Bio-capa. Animación resume la física subyacente para la detección de la interacción biomolecular por BLI. La luz que pasa a través de las sondas se refleja de nuevo a los espectrofotómetros (i) de la superficie interna del sensor y (ii) desde el exterior eninterfaz del sensor con la solución de muestra. Esto da lugar a un patrón de interferencia. La unión de moléculas a la superficie del sensor cambia el patrón de interferencia. Esto se puede trazar como un cambio de intensidad relativa nanómetros de longitud de onda vs. La supervisión de este cambio de nanómetros en el tiempo proporciona cinética de unión y disociación. Los gráficos se adaptaron con el permiso de ForteBio ^12.

Figura 2. Disposición esquemática de las muestras en la placa de muestras de 96 pozos. Los sensores se pueden mover en paralelo de columna en columna y se pueden mover a la izquierda oa la derecha según se define en el protocolo de ensayo particular. Wells con color gris representan tampón de ensayo, mientras que rojo, azul y verde representan proteína inmovilizada, socio y liga de uniónNDS, respectivamente.

Figura 3. Captura de pantalla que muestra los datos en bruto de un ensayo de BLI. Líneas rojas verticales indican el movimiento de los sensores entre los pasos del ensayo del protocolo. Tipos de pasos se indican en la imagen. Ubicaciones de tampón y las muestras son como se muestra en la Figura 2. Como se ha indicado por los números a lo largo de la parte superior del gráfico, se trasladaron sensores recubiertas con estreptavidina entre las diferentes columnas de la placa de la muestra en el siguiente orden: 123454. La leyenda debajo de la gráfica indica el color de trazo los datos de cada sensor. En la etapa de carga, cada sensor excepto H se incubó con 50 nM biotina subunidad "ε". En la etapa de la Asociación, los sensores se incubaron con concentraciones nM de "ε" empobrecido F _1: 30 (A, H), 20 (B), 15 (C), 10 (D), 5 (E), 2.5 (F), 0 nM (G). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 4. Captura de pantalla de los datos analizados de la prueba de BLI de la figura 3. Los datos se procesaron y equipado como se describe en el texto. A pocos pasos de asociación y disociación se muestran, dividido por una línea roja vertical. Las curvas de datos procesados ​​son de color azul, la regresión no lineal se ajusta de 1:1 análisis global se muestran en rojo. Resultados globales de ajuste: ⁸ k _a = 2 x 10 ⁵ m ^-1 s ^-1 (± 0,1%), k _d = 4,8 x 10 ^-5 s ^-1 ("±" 0,1%), dando _KD = 0,24 nM. Bondad de ajuste: R² = 0,999054. El parámetro de unión máxima _(Rmax) estaba en condiciones por separado para cada sensor, con valor medio = 0,813 nm ("±" 0,0803). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 5. Los resultados de un ensayo de BLI que muestra efectos alostéricos de ligandos sobre la conformación de ε. F ₁ (-ε) fue obligado a ε sensor-inmovilizada en presencia de 1 mM de ATP / EDTA. El final de la fase de asociación y una porción de la fase de disociación se muestran. Durante la etapa de disociación, se incluyeron ligandos diferentes para F ₁ páginas catalíticos (enumerados para cada traza) para observar sus efectos alostéricos en la disociación de la F ₁

Discussion

Instrumentos disponibles en la actualidad para BLI permiten el rendimiento y una flexibilidad significativa en los ensayos para las interacciones biomoleculares. Varias muestras de solución se dispensan en los pocillos de una placa de microtitulación de negro, y un conjunto de sensores de BLI paralelas están programadas para moverse adelante y atrás entre las columnas de pozos en la placa. Las muestras se agitan por agitación orbital durante todo el ensayo. El sistema utilizado aquí tiene 8 sensores y utiliza una placa de muestra de 96 pocillos, pero otro sistema utiliza sensores 16 y una placa de muestra de 384 pocillos. Por lo tanto, la interacción entre una biomolécula sensor inmovilizado y su pareja de unión en solución puede ser probado en diferentes condiciones con múltiples sensores en paralelo. Por ejemplo, en el primer ensayo que aquí se presenta con la subunidad ε inhibidor inmovilizado, se midieron las interacciones con seis diferentes concentraciones de la enzima (pareja de unión) en paralelas (Figuras 3 y 4). Esto permitió un análisis global de determinaciónne un solo par de constantes de velocidad (k _{A, K D)} para la red de unión y de disociación, y por lo tanto una constante de equilibrio de disociación _(KD = _Kd / K _a), lo que concuerda estrechamente con la constante de inhibición _(Ki) determina a partir de Los ensayos de soluciones de inhibición de la enzima por ε ^8. Un segundo tipo de experimento (Figura 5) demostró que BLI también puede vigilar los efectos alostéricos de pequeños ligandos sobre las interacciones entre dos proteínas; los efectos de diferentes ligandos se compararon en paralelo. Hay limitaciones para efectos de ligandos alostéricos detectar, ya que la señal de BLI depende de la masa de la molécula de unión, y puede detectar directamente la unión de compuestos pequeños en condiciones optimizadas ^13. Sin embargo, en el ensayo de la Figura 5, la pareja de unión, F _1, era un complejo de proteína grande (~ 347 kDa), por lo que la señal de BLI para su unión / disociación no se vio afectada significativamente por el anuncioadicionales de unión de pequeños ligandos tales como ATP (~ 500 Da) para el complejo de F _1. Esto fue confirmado con ensayos en los que estos ligandos no afectan a la señal de BLI para F ₁ unida a una forma truncada de ε que carecen de la inhibitoria CTD ^8. Por lo tanto, los ensayos de los efectos alostéricos deben tener en cuenta la masa del ligando alostérico en relación con las masas de las proteínas que interactúan, y preferiblemente incluir controles a probar para la respuesta directa BLI a la unión del ligando.

Tenga en cuenta que ciertas medidas y modificaciones en el protocolo experimental pueden ser fundamentales para el logro de mejores resultados y un análisis más preciso. Por ejemplo, como en el protocolo descrito aquí (ver pasos 1.2.3, 1.2.5), un ensayo destinado para el análisis global de la unión y constantes de velocidad de disociación debe incluir una etapa adicional de línea de base (consulte el paso 1.2.3) en una nueva columna de pozos de amortiguación (Figura 2, columna 4) antes de la etapa de asociación, y los sensores deben ser returned a la misma columna de pocillos de amortiguamiento para la etapa de disociación (ver paso 1.2.5). Tener cada sensor en el mismo pocillo (con las mismas propiedades ópticas) antes y después de la etapa de asociación puede mejorar la corrección de entre-etapa (etapa 3.4) para los pasos de Asociación / disociación, y esto facilita el montaje cinética global de múltiples trazas de datos (como en la Figura 4). También, para los ensayos que son más preliminar que se muestra aquí, el programa tiene una opción para acortar o alargar el tiempo de cualquiera de los pasos durante el ensayo (si bien es el planteamiento activo). Esto es útil, por ejemplo, si la señal de carga óptima no es ya conocido, o si se necesita más tiempo para permitir la disociación suficiente para lograr un buen ajuste para la tasa de disociación.

De unión de la pareja de unión a la superficie del sensor no específica puede ser un problema para los métodos de la etiqueta libre tales como SPR y BLI. En nuestros ensayos, este se minimiza de forma efectiva mediante la inclusión de BSA en el tampón de ensayo. Como en inmunoblotprotocolos ting, proteínas distintas de BSA se podrían utilizar, y bajas concentraciones de detergentes también pueden minimizar la unión (Tween 20 se utiliza en la cinética de búfer del proveedor) no específica. Incluso con una mínima unión no específica, la mayoría de los ensayos deben incluir al menos un sensor de control sin proteína inmovilizada pero con la mayor concentración de pareja de unión en el paso de asociación (véase la Figura 3, el sensor H); sustracción de la unión no específica residual (y su desintegración durante la etapa de disociación) puede mejorar significativamente los análisis cinético para la unión / disociación específica objeto de estudio. Por otro lado, los ensayos de una vez iniciales confirman que la proteína biotinilada permanece unido de forma estable después de la etapa de carga (véase la figura 3, sensor de G), que el control se puede omitir y que el sensor se puede utilizar para una condición de muestra.

Para la determinación sólida de asociación y disociación constantes de velocidad utilizando BLI, múltiples concentraciones de bCompañero ncontrar debe ser utilizada y todos los rastros de datos debe caber por el análisis global, si es posible (como en las Figuras 3 y 4). Idealmente, el intervalo de concentraciones debe abarcar ~ 10 veces por encima y por debajo de la K _D estimado. En nuestro caso, con una interacción de alta afinidad _(KD = 0,25 nM), el ruido de la señal-a-era pobre para la cinética de unión con concentraciones sub-K _D. Por lo tanto, se utilizaron concentraciones de pareja de unión por encima de la K _D de tal manera que se obtuvieron cambios significativos en las tasas observadas y los niveles de unión (véase la Figura 3). Además, se utilizó una etapa de disociación larga para mejorar la confianza en la adaptación de la tasa de disociación lenta. Con interacciones de alta afinidad, también es posible que la disociación lenta es exagerada por reconsolidación durante la etapa de disociación, ya que los ensayos de BLI se realizan en una muestra se agitó en lugar de flujo continuo sobre el sensor, como por SPR. Este potencial artefacto puede ser probado con comodice en el que el tampón de disociación contiene un "sumidero" de exceso de proteína competitiva que se une pareja de unión disociado y evita que se reconsolidación a la proteína del ^sensor-14 inmovilizada. En nuestro sistema, esto se hizo mediante la comparación de los resultados con y sin no biotinilado (> 10 veces por encima de K _D) en la disociación bien, y que confirmó que reconsolidación no era un problema significativo ^8. Por último, si los conjuntos de resultados cinéticos no se ajustan bien mediante el análisis global (1:01 o 2:01 modelos disponibles), hay otras opciones de análisis para la solución de problemas. Por ejemplo, en lugar de elegir "Global (Full)" (en el paso 4.2), "Local" se puede elegir para adaptarse a cada curva del sensor de forma independiente. Si la unión sigue un modelo simple de 01:01, el trazado de las tasas de unión observadas _(Kobs) vs las concentraciones de pareja de unión debe mostrar una dependencia lineal, con la pendiente igual a la de segundo orden, la tasa de unión intrínseca. La ficha de análisis del software tiene un "XYgráfico de ventana "que permite una rápida visualización de esta relación.

Una de las limitaciones del instrumento que utilizamos es el rango de temperatura disponibles. Con un alcance de 2 ° C por encima de la temperatura ambiente hasta 40 º C, sólo las moléculas que son estables en ese rango, pueden ser utilizados. Por otra parte, el análisis termodinámico está limitada por el estrecho intervalo de temperatura. Otra limitación general es que el tiempo máximo de ensayo es de ~ 4 h, después de esto, los artefactos se desarrollan debido a la evaporación de las muestras de la placa de microtitulación abierta.

BLI implica una disposición relativamente simple en comparación con SPR. Los sensores se mueven entre las columnas de pozos con volúmenes fijos, en lugar de un flujo constante de muestra sobre el sensor. Aunque no es tan sensible como la SPR, BLI se ve menos afectada por los cambios en el índice de refracción debido a cambios en la composición de la muestra. En general, con esta relativa facilidad de uso y la flexibilidad del instrumento en el cambio entre las condiciones de ensayo, BLI proporcionarsa herramienta versátil para ensayos in vitro de las interacciones biomoleculares.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available