Bio-lags interferometri for måling Kinetics av ​​Protein-protein interaksjoner og Allosterisk Ligand Effects

Summary

Protokollene her beskriver kinetiske analyser av protein-protein interaksjoner med Bio-lags interferometri. F-type ATP syntetase, som er involvert i cellulær energi-metabolisme, kan inhiberes ved sin ε subenheten i bakterier. Vi har tilpasset Bio-lags interferometri for å studere interaksjoner av det katalytiske kompleks med ε sin hemmende C-terminale domenet.

Abstract

Vi beskriver bruk av Bio-lags Interferometry å studere inhiberende interaksjoner av subenheten ε med det katalytiske kompleks av Escherichia coli ATP syntase. Bakteriell F-type ATP synthase er målet for en ny, FDA-godkjente antibiotika for å bekjempe multiresistent tuberkulose. Forstå bakterier-spesifikke auto-hemming av ATP syntase av C-terminal domenet av subenheten ε kunne gi en ny måte å målrette enzymet for oppdagelsen av antibakterielle legemidler. Det C-terminale domenet av ε undergår en dramatisk konformasjonsforandringer når enzym overganger mellom de aktive og inaktive tilstander, og katalytisk-site ligander kan påvirke hvilket ε er konformasjonen er dominerende. Den analysen måler kinetikken for ε sin binding / dissosiasjon med det katalytiske kompleks, og indirekte meaSures forskyvning av enzym-bundet ε til og fra tilsynelatende nondissociable hemmende konformasjon. The Bio-lags Interferometry signalet ikke er altfor følsomme for løsning sammensetning, slik at den også kan brukes til å overvåke allosteriske effekter av katalytisk-site ligander på ε største konformasjonsendringer.

Introduction

Protein-protein-interaksjoner er viktige for mange biologiske prosesser, og merke-fri optiske metoder som overflate-plasmonresonans (SPR) har blitt brukt in vitro for å studere kinetikken til bindings og dissosiasjon ^1.. De fleste etikettfrie metoder immobilisere en biomolekyl på en sensorflate og bruke et optisk signal for å påvise en bindingspartner fra oppløsning som den forbinder med den immobiliserte biomolekyl ^1.. Mens SPR er en meget følsom metode, er den utsatt for forstyrrelser på grunn av endringer i brytningsindeksen til oppløsningen strømmer over sensoren ^2.. Selv om ikke så følsom som SPR, Bio-lags interferometri (BLI) er mindre påvirket av endringer i utvalgssammensetningen ^1,3. BLI bruker fiberoptiske biosensorer som har en proprietær biocompatible belegg på spissen. Systemet brukes her (Oktett-RED96) inneholder åtte spektrofotometre. Hvitt lys transporteres i rørledning til en rad av sonder som beveger seg på en robotarm. Fiberoptiske sensorer are plukket opp av probene, og flyttet til en 96-brønners plate inneholdende prøver. En av målmolekylene er immobilisert på biosensor overflate. Da sensorene er flyttet til brønner inneholdende bindingspartneren i løsning. BLI overvåker sammenslutning av bindingen partner med immobilisert molekylet, og overvåker dissosiasjon etter flytting sensorene til løsning uten binding partner da. Binding av molekyler på biosensor overflate fører til endringer i optisk interferens mellom lysbølger som reflekterer tilbake til spek fra en innvendig overflate og fra den ytre grenseflaten mellom sensoren og løsning. Disse forandringene i interferens kan kvantifiseres og brukt til å bestemme kinetiske rater binding og dissosiasjon, som oppsummert i animasjonen på figur 1.

Vi har søkt BLI å måle interaksjonen mellom det katalytiske kompleks av bakteriell ATP syntase og dens ε subenhet, noe som kan auto-hemme enzymet. ATP synthase er et membran-forankret roterende nanomotor som katalyserer syntese og hydrolyse av ATP ^4.. Det katalytiske kompleks (F ₁₎ kan isoleres i en oppløselig form som virker som en ATPase. Subenheten ε har to domener: N-terminal domene (NTD) er nødvendig for riktig montering og funksjonell kopling av enzymet, men ikke kommuniserer direkte med de katalytiske underenhetene, den C-terminale domene (CTD) kan hemme enzymet ved å samhandle med flere katalytiske subenheter ^5,6. Dette ε-mediert regulering er spesifikke for bakterielle ATP synthases og er ikke observert i det mitokondrielle homologue. ATP syntase har dukket opp som et mål for antibakterielle legemidler, som vist ved siste FDA godkjenning av bedaquiline å behandle multiresistent tuberkulose ^7. Dermed rettet ε er hemmende rolle for medisiner kan gi antibakterielle midler som ikke hemmer mitokondrie ATP syntase. Med den isolerte katalytiske kompleks (F _1), εblir en dissosierbare subenhet. Men med ε bundet til F _1, kan εCTD gjennomgå en dramatisk konformasjonsforandringer, delvis settes inn i enzymet sentrale hulrom og som danner en hemmende tilstand som er lite sannsynlig å dissosiere direkte ^6,8. Vi bruker BLI for å måle kinetikken F ₁ / ε binding og dissosiasjon, og indirekte, for å undersøke allosteriske effekter av katalytisk stedet ligander på ε sin konformasjon.

I vårt system, ε ble valgt for immobilisering på følerens overflate, siden BLI signal (som SPR) er følsom overfor massen til molekylene som bindes på overflaten. Den ε subenheten er små (~ 15 kD) i forhold til hoved F ₁ kompleks (~ 347 kDa). Således vil en større BLI signal skyldes binding av _F-1 til immobilisert ε. For å overvåke F ₁ dissosiasjon, noe som kan være svært langsom, må ε være sterkt immobilisert. Derfor valgte vi å biotinylere; Og immobilisere den på streptavidin-belagt biosensorer. Proteiner kan bli biotinylert ved å (i) tilfeldig modifisering av overflate lysines ^9, (ii) omsetning av en unik opprinnelig konstruert eller cystein med en biotin-maleimid reagens ¹⁰ eller (iii) å legge en genetisk bestemt biotin-akseptor peptid som er enzymatisk biotinylert løpet in vivo-ekspresjon av den kodede protein ^11. I vårt system, er ε bitinylert bruker metoden (iii) ^8. Når biotin-merket ε immobiliseres på streptavidin-sensorer, kan BLI måle binding og dissosiasjon av F ₁ som har blitt tømt for subenheten ε (F ₁ (-ε)). For de eksperimenter som er beskrevet her, har foreløpige tester blitt utført for å bestemme rimelige mengder av det biotinylerte protein for å immobilisere på sensorene. Dette kan variere avhengig av molekylvekten av proteinet og dets bindingspartner, men målet er å bestemme en minimal mengde av immobilisert protein that gir (i) akseptabelt signal-til-støy-for bindingskinetikker med en lav konsentrasjon av bindingspartner (nedenfor K _D) og (ii) minimal forvrengning av bindingskinetikker med nær metning konsentrasjon av bindingspartneren. Også støkiometri av biotinylering kan variere (men unngå> 1 mol biotin / mol protein), slik at noen innledende analysen kan være nødvendig for hvert nytt parti av biotinylert protein for å bekrefte at en konsistent BLI signal kan bli oppnådd ved immobilisering på streptavidin-belagte sensorer.

Protocol

En. Programmere Instrument for BLI analysen

Slå på instrumentet i minst en time på forhånd for å tillate lampen å varmes opp, og dette er nødvendig for å redusere støy og drift i optiske signalet i løpet av eksperimentet. Still inn ønsket temperatur via fanen instrument å prewarm prøven plate holder. Deretter setter du opp eksperimentell design i Data Acquisition programvare. Velg "New Kinetics Experiment" i kategorien Veiviser Experiment. Dette utgjør et fanebasert meny med alle trinnene som må defineres.

1.1. Plate Definition

Definer hvilke kolonner som skal brukes på 96-vel prøveskilt. Tilordne kolonner å inneholde buffer, immobilisert protein eller bindende partner. For hver krets godt, angir konsentrasjonen av bindingspartner til å bli brukt. Merk: plate definisjonen er vist i figur 2 har muligheter for forskjellige analyser.

1.2. Analyse Definition

ontent "> Definer alle trinn som er nødvendig for analysen. Dette omfatter (i) Grunnlinje (flere), (ii) lastes, (iii) Association og (iv) Dissosiering av bindingspartner. Deretter, som beskrevet nedenfor, link individuelle analysefremgangsmåten med kolonner av brønner på prøveskilt ved å velge analysen trinn og dobbeltklikke på den aktuelle kolonnen. Denne programmer sensorene som skal flyttes fra én kolonne av brønner til neste under analysen.

1. Baseline
   Begynn med en kort utgangstrinn (≥ 60 sek), og sensorer i analysebuffer (figur 2, kolonne 1), for å etablere de første BLI signaler i 96-brønns plate.
2. Loading (immobiliserer biotinylated protein på sensorene)
   Tildel sensorer til brønner som inneholder biotinylert protein (figur 2, kolonne 2). Bruk terskelfunksjon for å oppnå en forutbestemt grad av binding (se innledningen). Sett terskelen alternativet slik at alle sensorer vil være trekkd til den neste kolonne av brønnene når hvilken som helst av sensorene når frem til terskelen.
3. Baseline
   Inkludere en annen referanse trinn i buffer (figur 2, kolonne 3, typisk> 5 min) for å vaske bort nonimmobilized biotinylerte proteiner fra sensorene og etablere nye, stabile utgangssignaler. For grunnleggende binding / dissosiasjon assays bare (som i Figur 3), omfatter en ekstra utgangstrinn (60 sek) med følere i nye brønner i buffer (fig. 2, kolonne 4) før foreningen trinn.
4. Association (av bindingspartneren til det immobiliserte protein)
   For en enkel binding / dissosiasjon assay (som i figur 3) ved å velge et område av konsentrasjoner av bindingspartner som skal brukes til forskjellige sensorer / brønner (fig. 2, kolonne 5). Juster trinnet tid, slik at i det minste en matnings-konsentrasjon av bindingspartneren bør nærme seg likevektsbindingssignal. For enanalyse for å teste allosteriske effekter av små ligander for dissosiasjon av protein-protein-kompleks (som i figur 5) ved å velge en enkelt høy konsentrasjon av bindingspartner (~ 10 ganger over den beregnede K _D) for bruk i alle tilknytnings brønner.
5. Dissosiasjon (av bindingen partner)
   For en enkel binding / dissosiasjon assay bare (som i Figur 3), angir sensorer for å gå tilbake til kolonne 4 (fig. 2), den samme buffer brønner som er benyttet for den ekstra basislinjen før foreningen. For en analyse for å teste allosteriske effekter av små ligander, i stedet utpeke sensorer til å bevege seg til kolonne 6 (figur 2), hvor hver brønn kan inneholde buffer pluss forskjellige allosteriske ligander.

1.3. Sensor Assignment

Angi hvilke steder i sensor skuffen som vil inneholde prefuktede sensorer for analysen. Identifisere eventuelle tomme posisjoner siden forsøket vil Fail hvis ingen sensorer er plukket opp.

1.4. Gjennomgang Experiment

Visualisere alle planlagte tiltak for å se etter feil og gå tilbake for å rette dem.

1.5. Kjør eksperiment

Oppgi nødvendige detaljer, inkludert plassering av datafiler. Tast inn ønsket temperatur for eksperimentet. Hvis sensorene fortsatt krever prewetting, velg alternativet for å forsinke starter eksperimentet. Til slutt, er når alle prøveopparbeidelse komplett (trinn 2) og både prøveskilt og sensor skuffen er lagt i instrumentet, klikk på Start-knappen for å kjøre analysen.

2. Prøvepreparering

1. Forbered et passende analysebuffer. Buffer brukt til eksperimenter som er vist i figurene 3 og 5: 20 mM MOPS (3 - (N-morfolino) propansulfonsyre), Tris (Tris (hydroksymetyl) amino-metan) (tilsatt for å justere pH til 8,0), 50 mM KCl. Inkludere BSA (bovint serumalbumin, fettsyrefritt, 0.5mg / ml endelig) i bufferen for alle analysefremgangsmåten, og for alle fortynninger av biotinylert protein eller bindingspartner for å minimere ikke-spesifikk binding av proteiner til sensorene.
2. Fortynn biotinylert protein (ε) i analysebuffer til en passende konsentrasjon (se innledningen).
3. Forbered fortynninger av bindingspartner (F ₁ (-ε)) i forsøksbuffer (se Diskusjon for konsentrasjonsområde som skal brukes).
4. Prewet streptavidin-belagt sensorer i minst 10 min for å fjerne sin beskyttende sukrose belegg. Fjern sensoren holdige stativet fra sensoren skuffen og en 96-brønns plate i bunnen av skuffen, glir den ene kanten av platen inn i orienterings hakk på skuffen. For kolonnen med sensorer som skal brukes, tilsett 200 pl av analysebuffer per brønn i kolonnen av 96-brønns plate. Returner rack av sensorer til skuffen i riktig retning (med faner i sporene).
5. Som tildelt under programmering i trinn 1, fyll brønner of prøveplate med analysebuffer eller de aktuelle protein fortynninger, som i figur 2.. Unngå å innføre bobler, da de kan føre til støy i det optiske signal. Omfatte en eller flere referansebrønner som utelater enten (i) biotinylert protein, eller (ii) bindingspartner.
6. Åpne døren på instrumentet og sett sensoren skuffen på scenen (til venstre), med Magasinets faner settes inn i sporene på scenen. Sett prøven plate inn i plateholderen (til høyre), sørg for at platen sitter flatt og i riktig retning, som angitt på platen holderen. Lukk døren og starte analysen fra datainnsamlingsprogram (trinn 1,5).

Tre. Behandling av data

1. Etter analysen har kjørt, åpne dataanalyse programvare og laste den mappen som inneholder data. Klikk på "Processing" for å se en trinnvis Processing menyen (til venstre) og den rå kinetiske data, med hver sensor (AH) tildelt en annen farge (seFigur 3).
2. Under "Data Selection", klikk på "Sensor Selection"-knappen. På "Sample Plate Map", angir de brønner for en eller to styrefølere (G, H i analysen i figur 3) som referansebrønner. På Processing menyen, sjekk "subtraksjon" boksen og velg "Reference Wells" å trekke referanse signal (singel eller i gjennomsnitt) fra alle andre sensorens signal.
3. Juster alle spor til Y = 0 ved å bruke "Align Y-akse" trinn. Velg "Baseline" som justerings trinn (dette er den siste opprinnelige før Foreningen trinn). For "Time Range", skriv inn de siste 10 sekundene av at baseline (dvs. 50-60 sek for en 60-sek baseline, som i figur 3).
4. Sjekk "Inter-trinns Correction" boksen for å minimere signal skifter mellom foreningen og dissosiasjon trinn. Velg justere til Baseline eller Dissosiasjon.
5. Velg Savitzky-Golay filtrering funksjon i de fleste tilfeller, og klikk "Process Data!" å fortsette. Inspiser visueltde endelige bearbeidede data (nederst til høyre panel). Med analyser beregnet for globale dataanalyse (som i figur 4), dersom signal spor viser en betydelig endring mellom foreningen og dissosiasjon trinn, endre valget av Dissosiasjon eller Baseline for "Inter-trinns Correction" og reprosessere data før du fortsetter til data Analyse.

4. Data Analysis

Klikk på "Analyse"-fanen i dataanalyse for å begynne. Merk: eksempelet trinn nedenfor er for global analyse av multiple binding / dissosiasjon kurvene (som i Figur 3).

1. For "skritt å analysere", velg Association og dissosiasjon. For "modell", velg 01:01. Merk: andre begrensede alternativer er tilgjengelige.
2. For "tilpasning", velger Utland (Full). For "Grupper etter" velg farge (som på grafen). Velg "R _maks oppheve tilknytningen Av Sensor" å tillate uavhengig montering av R _max (maksimal signalrespons på mette binding av pålydendetner til det immobiliserte protein). Merk: Vi gjør dette for de fleste analyser, som sensorer variere litt i mengden av protein immobilisert (se figur 3, Loading).
3. På bordet vist, sørge for at alle sensor spor som skal analyseres har samme farge, slik at de vil bli analysert som et globalt sett. Hvis det er nødvendig, velger du ett eller flere sensor spor å utelate fra global montering: under "Inkluder"-kolonnen, høyreklikk på den sensoren posisjon og velg "Ekskluder Wells".
4. Klikk på "Fit Curves!" å starte ikke-lineær regresjonsanalyse. Undersøke monterings resultater, som inkluderer (i) overlapping av regresjonskurver med sensordata spor (som i figur 4), (ii) plott av montering rester, og (iii) et bord med målbevisste parameterverdier (hastighetskonstanter, R _max, K _D) og statistikk (standardfeil for parametere, Chi-kvadrat, R ^2).
5. Under "Data Export", lagre sittende resultatene ved å klikke på "Eksporter tabell til. Csv-fil". For graphengsle eller videre analyse av data / montert kurver med annen programvare, klikker du på "Export Montering Resultater" for å lagre hver sensor data og montert kurve i en tekstfil.

Representative Results

Sanntids bindings og dissosiasjon BLI kinetikken er vist i figur 3.. Dette forsøk ble gjort med forsøksbuffer sammen og dissosiasjon. Dette forsøk ble startet med en 10 min baseline trinn siden sensorene hadde blitt prewet kun i kort tid. Deretter ble bitinylert ε lastet på sensorene. Ingen påvisbar dissosiasjon av ε oppstod gjennom alle de gjenværende trinn sett fra referansekurven (G), som ikke hadde noen bindende partner tilsatt. Et andre referansesensor (H) var blottet for immobilisert protein og viste lav ikke-spesifikk binding av bindingspartneren. Ulike konsentrasjoner av F ₁ (-ε) ble brukt i foreningen skritt for sensorer AF for å passe resultater globalt og få de beste verdiene for k _a, k _d, og K _D. Resultatene ble behandlet som i protokollen, hvilket ga de datatraser (blått) i figur 4. I dette tilfellet, ble referansesensor spor H subtrahert fra prøven tress for å korrigere for ikke-spesifikk binding av bindingspartneren og system signal drift. I dataanalysen trinn, alle kurvene var globalt passform med en 1:01 modell (singel k _en, enkelt k _d); "Global (Full)" fit foruts fullstendig dissosiasjon av bindende partner (signalet vil gå tilbake til null ved uendelig tid) (figur 4, rød). Legg merke til at for de to høyeste konsentrasjonene av F ₁ (-ε), er det små, men vesentlige avvik i dataene fra den globale, 01:01 modell. Lave nivåer av immobilisert ligand (biotinylert "ε"-underenhet) ble anvendt, og den passer ikke ble forbedret ved å inkludere en massetransport faktor i modellen (ikke vist). Imidlertid F ₁ (- "ε") er et stort kompleks (~ 350 kDa), og andre eksperimenter (ikke vist) indikerer at disse avvikene skyldes redusert binding tilgjengelighet av en brøkdel av immobilisert ligand, det vil si en _F-1 bundet til en "ε" kan sterisk hindre tilgang til en annen biotinylerte"Ε" bundet på samme streptavidin tetramer.

Figur 5 viser et annet eksperiment hvor enzymet er bundet til sensor-immobiliserte ε i nærvær av 1 mM ATP / EDTA, og dette predisponerer de fleste F ₁ / "ε" komplekser til å anta den noninhibitory konformasjon, som dissosierer lett ^8.. Sensorer ble deretter flyttet til dissosiasjon brønner som inneholder analysebuffer med forskjellige ligander. Dette viser virkningen av forskjellige ligander på konformasjon av ε. For eksempel, eksponering for MgADP / Pi dramatisk redusert netto dissosiasjon, noe som indikerer at ε skiftet konformasjon til tett bundet, hemmende tilstand. Komplekse dissosiasjon kinetikk ble observert siden ulike ligander forårsaket ulike skift i brøkdel av F _1. Ε komplekser med ε i de aktive (dissosierbare) eller hemmende (nondissociable) konformasjoner. Det er også mulig at vesentlige konformasjonsendringer av bundne proteinerbidra direkte til endringer i BLI signal, men i våre studier synes dette å være ubetydelig i forhold til signalet for binding / dissosiasjon av den store F ₁ kompleks (se Shah et al ^8, figur 5D,. overgang til kurvene 3 og 6 viser svært lik oppførsel, selv om deres forhold ligger til rette distinkte konformasjonen av bundet F _1). Dataanalyse programvare var ikke designet for slike komplekse dissosiasjon kinetikk. Dermed vi eksporterte data til tekstfiler for ikke-lineær regresjonsanalyse med annen programvare.

Figur 1. Prinsipper for Bio-lags interferometri. Animasjon oppsummerer den underliggende fysikken for å oppdage biomolekylære interaksjoner av BLI. Lys som passerer gjennom sondene blir reflektert tilbake til spek (i) fra den indre overflate av føleren, og (ii) fra det ytre igrensesnittet av sensoren med prøveløsningen. Dette resulterer i et interferensmønster. Binding av molekyler til sensoroverflaten endres interferensmønster. Dette kan plottes som et nanometer forskyvning av relativ intensitet vs bølgelengde. Overvåking dette nanometer skiftet over tid gir bindende og dissosiasjon kinetikk. Grafikk er tilpasset med tillatelse fra FortéBio ^12.

Figur 2. Skjematisk arrangement av prøvene i 96-brønners prøveplaten. Sensorene vil bli beveget parallelt fra kolonne til kolonne, og kan beveges enten til venstre eller høyre slik det er definert i en bestemt analyseprotokollen. Brønner med grå farge representerer analysebuffer mens rødt, blått og grønt representerer immobilisert protein, forpliktende partner og ligaNDS, henholdsvis.

Figur 3. Skjermen fange viser rådata fra en BLI analysen. Vertikale røde linjene indikerer bevegelse av sensorer mellom analyse trinnene i protokollen. Trinn typene er merket på bildet. Lokalisering av buffer og eksempler er som vist i figur 2. Som det fremgår av tallene langs toppen av grafen, ble streptavidin-belagt sensorer flyttet mellom ulike kolonnene i prøveskilt i følgende rekkefølge: 123454. Legenden under grafen indikerer fargen for hver sensor data spor. I det lastes trinn ble hver sensor unntatt H inkubert med 50 nM biotinylert "ε" subenheten. I Foreningen skritt ble sensorer inkubert med nM konsentrasjoner av "ε"-utarmet F _1: 30 (A, H), 20 (B), 15 (C), 10 (D), 5 (E), 2,5 (F), 0 nM (G). for å vise større bilde.

Fig. 4. Skjermbilde av de analyserte data fra BLI assay på figur 3.. Dataene ble behandlet og montert som beskrevet i teksten. Kun Association og dissosiasjon Måten vises, delt av en vertikal rød linje. De bearbeidede data kurvene er blå, den ikke-lineær regresjon passer fra 01:01 globale analysen er vist i rødt. Globale sittende resultater ^8: k _{a =} 2 x 10 ⁵ m ^-1 s ^-1 (± 0,1%), k _d = 4,8 x 10 ^-5 s ^-1 ("±" 0,1%), noe som gir K _D = 0,24 nM. Godhet passer: R² = 0,999054. Den maksimale bindende parameter (R _max) var passe separat for hver sensor, med middelverdi = 0,813 nm ("±" 0,0803). Klikk her for å se større bilde.

Figur 5. Resultater fra en BLI analysen viser allosteriske effekter av ligander på ε sin konformasjon. Ble F ₁ (-ε) bundet til sensor-immobiliserte ε i nærvær av 1 mM ATP / EDTA. Enden av krets fase og en del av dissosiasjon fase er vist. Under dissosiasjon skritt ble distinkte ligander for F ₁ katalytiske nettsteder (oppført for hvert spor) inkludert for å observere sine allosteric effekter på dissosiasjon av F ₁

Discussion

For tiden tilgjengelige instrumenter for BLI tillate betydelig gjennomstrømming og fleksibilitet i analyser for biomolekylære interaksjoner. Forskjellige prøver løsning blir dispensert i brønner på en sort mikrotiterplate, og et sett med parallelle BLI sensorer er programmert til å bevege seg frem og tilbake mellom kolonner av brønner på platen. Prøvene ble omrørt med kretsende rysting i løpet av analysen. Systemet som er brukt her har 8 sensorer og bruker en 96-brønners prøveplate, men et annet system benytter 16 sensorer og en 384-brønners prøveplaten. Således kan interaksjon mellom en sensor-immobilisert biomolekyl, og dets bindingspartner i løsning testes under forskjellige betingelser med flere sensorer i parallell. For eksempel i den første analysen presentert her med det immobiliserte hemmende ε subenheten, ble interaksjoner måles med seks forskjellige konsentrasjoner av enzym (bindingspartner) parallelt (fig. 3 og 4). Dette tillot en global analyse for å bestemne et enkelt par av hastighetskonstanter (k _a, k _d) for netto binding og dissosiasjon, og dermed en likevekts-dissosiasjons-konstant (K _D = k _d / k _a), som går med tett med inhibitorisk konstant (K _I) bestemt fra løsnings analyser av enzym hemming av ε ^åtte. En annen type eksperiment (figur 5) viser at BLI kan også overvåke allosteriske effekter av små ligander på interaksjonen mellom to proteiner, ble virkningene av forskjellige ligander, ble sammenlignet i parallell. Det er begrensninger for å detektere virkninger av allosteriske ligander, siden BLI signal avhenger av massen av den bindende molekyl, og kan direkte detektere binding av små forbindelser under optimaliserte betingelser ^13. Men i analysen av figur 5, bindingspartner, _F-1, var det et stort proteinkompleks (~ 347 kDa), slik at BLI signal for dens binding / dissosiasjon ble ikke signifikant påvirket av adnelle binding av små ligander såsom ATP (~ 500 Da) til F ₁ kompleks. Dette ble bekreftet med analyser hvor disse ligander ikke påvirker BLI signal for F ₁ bundet til en avkortet form av ε mangler hemmende CTD ^åtte. Dermed må analyser av allosteriske effekter vurdere massen av allosterisk ligand i forhold til massene av de interagerende proteiner, og fortrinnsvis omfatter kontroller for å teste for direkte BLI respons på binding av liganden.

Vær oppmerksom på at enkelte trinn og modifikasjoner i forsøksprotokollen kan være avgjørende for å oppnå bedre resultater og mer nøyaktig analyse. For eksempel, som i den protokoll som er beskrevet her (se trinn 1.2.3, 1.2.5), bør en analyse beregnet for global analyse av binding og dissosiasjon hastighetskonstanter inkludere en ekstra utgangstrinn (se trinn 1.2.3) på en ny kolonne med buffer-brønner (fig. 2, kolonne 4) før foreningen trinnet, og sensorene bør være returned til den samme kolonnen med buffer-brønner for dissosiasjon trinn (se trinn 1.2.5). Etter å ha hver sensor i samme brønn (med de samme optiske egenskaper) før og etter foreningen trinn kan bedre inter-trinn korreksjon (trinn 3.4) i forening / Dissosiasjonen trinn, og dette letter global kinetiske montering av flere data spor (i i figur 4). Også for analyser som er mer foreløpige enn vist her, har programmet et alternativ til å forkorte eller forlenge tiden for en hvilken som helst trinn i løpet av analysen (mens det er den aktive trinn). Dette er nyttig, for eksempel, hvis den optimale last signalet ikke allerede er kjent, eller hvis mer tid er nødvendig for å tillate tilstrekkelig dissosiasjon for å oppnå en god passform for dissosiasjon hastighet.

Ikke-spesifikk binding av bindingspartneren til sensoroverflaten kan være et problem for merkefrie metoder som SPR og BLI. I våre analyser, ble dette effektivt minimalisert ved å inkludere BSA i analysebuffer. Som i immunoblotterende protokoller, unntatt BSA proteiner kan bli brukt, og lave konsentrasjoner av vaskemiddel kan også minimalisere ikke-spesifikk binding (Tween20 brukes i kinetikk buffer fra leverandøren). Selv med minimale ikke-spesifikk binding skal de fleste analyser omfatter minst en kontrollsensor uten immobilisert protein, men med den høyeste konsentrasjon av bindingspartner i forening trinn (se figur 3, sensor H), subtraksjon av det gjenværende ikke-spesifikke binding (og dens nedbrytning i løpet dissosiasjon trinn) kan forbedre bevegelsesanalyser for den spesifikke bindingen / dissosiasjon blir studert. På den annen side, når første-analyser bekrefter at det biotinylerte protein forblir stabilt bundet i det den lastes trinn (se figur 3, sensor G), kan denne kontrollen utelates og at sensoren kan brukes for en prøve tilstand.

For robust fastsettelse av foreningen og dissosiasjon hastighetskonstanter bruker BLI, flere konsentrasjoner av binding partner skal brukes, og alle data-spor skal få plass ved global analyse, dersom det er mulig (som i figurene 3 og 4). Ideelt sett bør konsentrasjonsområde strekke ~ 10 ganger over og under den beregnede K _D. I vårt tilfelle, med en høy-affinitets interaksjoner (K _D = 0,25 nM), var den signal-til-støy-fattig for bindingskinetikker med _{sub-K-D-konsentrasjoner.} Således, ble konsentrasjoner av bindingspartner ovenfor K _D benyttes, slik at vesentlige endringer i de observerte rater og nivået av binding ble oppnådd (se figur 3). Også en lang dissosiasjon trinn ble brukt til å forbedre tilliten til montering av langsom dissosiasjon rate. Med høy affinitet interaksjoner, er det også mulig at langsom dissosiasjon er overdrevet av ny binding under dissosiasjon trinnet, siden BLI analysene er utført i en omrørt prøve i stedet for fortsatt strømning over sensoren, som for SPR. Dette potensialet artefakt kan testes med såstår der dissosiasjon bufferen inneholder et "sink" for overflødig konkurrerende protein som binder dissosiert bindingspartner og hindrer den fra ny binding til sensor-immobiliserte protein ^14. I vårt system, ble dette gjort ved å sammenligne resultatene med og uten nonbiotinylated (> 10 ganger høyere K _D) i dissosiasjon godt, og vi bekreftet at rebinding var ikke et betydelig problem ^åtte. Til slutt, hvis sett av kinetiske resultater ikke er passe godt av global analyse (1:01 eller 2:01 modeller tilgjengelig), finnes det andre analysemuligheter for feilsøking. For eksempel, i stedet for å velge "Utland (Full)" (i trinn 4.2), "Local" kan velges for å passe hver sensor spor uavhengig av hverandre. Ved binding følger en enkel 01:01 modellen, å plotte de observerte bindingsfrekvens _(kobs) vs konsentrasjonen av bindingspartner bør vise en lineær avhengighet, med stigning lik den andre-ordens, indre bindingshastighet. Analyse kategorien av programvaren har en "XYgraf "vindu som gir rask visualisering av dette forholdet.

En begrensning av instrumentet som vi brukte er den tilgjengelige temperaturområde. Med et utvalg av 2 ° C over omgivelsestemperaturen til 40 ° C, kan bare molekyler som er stabile i dette området brukes. Videre er termodynamisk analyse begrenset av det smale temperaturområde. En annen generell begrensning er at den maksimale analysetiden er ~ 4 timer, og etter dette, gjenstander utvikles på grunn av fordampning av prøver fra den åpne mikrotiterplate.

BLI involverer et relativt enkelt arrangement i forhold til SPR. Sensorene blir beveget mellom kolonner av brønner med faste volumer, i stedet for en konstant strøm av prøven over sensoren. Selv om det ikke er så følsom som SPR, er BLI mindre påvirket av endringer i brytningsindeks på grunn av endringer i prøvesammensetning. Generelt, med denne relative brukervennlighet og fleksibiliteten av apparatet i skiftende mellom analysebetingelser, BLI leveresa allsidig verktøy for in vitro prøver av biomolekylære interaksjoner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available