De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
We beschrijven het gebruik van Bio-layer Interferometrie remmende subeenheid interacties van ε studie met het katalytische complex van Escherichia coli ATP synthase. Bacteriële type F ATP synthase is het doelwit van een nieuwe, door de FDA goedgekeurde antibioticum-resistente tuberculose te bestrijden. Inzicht bacterie-specifieke auto-remming van ATP synthase door het C-terminale domein van subeenheid ε kan een nieuw middel om het enzym ontdekking van antibacteriële geneesmiddelen doelwit. De C-terminale domein van ε ondergaat een dramatische conformatieverandering wanneer het enzym overgangen tussen de actieve en inactieve toestanden en katalytische plaatse liganden beïnvloeden welke conformaties ε is overheersend. De test meet kinetiek van de binding ε / dissociatie met de katalytische complex en indirect mealen de verschuiving van enzym gebonden ε en naar de schijnbaar nondissociable remmende conformatie. De Bio-laag Interferometrie signaal niet overgevoelig voor oplossing samenstelling, dus het kan ook gebruikt worden om allosterische effecten van katalytische-ter liganden op ε de conformatieveranderingen volgen.
Inleiding
Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor vele biologische processen en labelvrije optische methoden zoals Surface Plasmon Resonance (SPR) gebruikt in vitro kinetiek van binding en dissociatie 1 bestuderen. De meeste labelvrije methoden immobiliseren een biomolecuul op een sensor oppervlak en gebruiken een optisch signaal om een bindende partner te detecteren uit de oplossing als het associeert met de geïmmobiliseerde biomolecuul 1. Terwijl SPR is een zeer gevoelige methode is gevoelig voor storingen als gevolg van veranderingen in de brekingsindex van de oplossing stroomt via sensor 2. Hoewel niet zo gevoelig als SPR, Bio....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Programmering van het instrument voor BLI Assay
Zet het instrument tenminste een uur gepresenteerd om de lamp is opgewarmd, dat noodzakelijk is om ruis te minimaliseren en drift optische signaal gedurende het experiment. Stel de gewenste temperatuur via het tabblad instrument om het monster plaat voorverwarmen door de houder. Stel vervolgens de experimentele benadering in de Data Acquisition software. Selecteer "Nieuwe Kinetics Experiment" in het tabblad Experiment Wizard. Dit biedt een menu met tabbladen met alle stappen die moeten worden gedefinieerd.
1.1. Plaat Definitie
Def....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Real time binding en dissociatie BLI kinetiek in figuur 3. Dit experiment werd uitgevoerd met testbuffer tezamen en dissociatie. Dit experiment werd gestart met een 10 minuten basislijn stap omdat de sensoren was voorbevochtigd slechts kort. Vervolgens werd gebiotinyleerd ε geladen op de sensoren. Geen detecteerbare dissociatie van ε trad in alle overige stappen gezien vanaf de referentiecurve (G) die geen bindende partner toegevoegd. Een tweede referentie sensor (H) miste geïmmobiliseerd eiwit en toond.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Thans beschikbare instrumenten voor BLI toelaten belangrijke doorvoer en flexibiliteit in assays voor biomoleculaire interacties. Verschillende monsters oplossing wordt overgebracht in putjes van een zwarte microtiterplaat en een stel evenwijdige BLI sensoren geprogrammeerd heen en weer schakelen tussen kolommen van putten op de plaat. De monsters worden geroerd door orbitaal schudden gedurende de test. Het systeem hier gebruikt heeft 8 sensoren en gebruikt een 96-well plaat monster, maar een ander systeem gebruikt 16 s.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Wij danken FortéBio voor het verschaffen grafieken in figuur 1. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie GM083088 aan TMD
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Vrij van vetzuren |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Schaal van 96 sensoren |
| Microtiterplaat | Greiner Bio-one | 655209 | Zwart, Polypropyleen |
| Data Acquisitie software | Pall/FortéBio | Versie 6.4 | Nieuwere versies beschikbaar |
| Data Analyse software | Pall/FortéBio | Versie 6.4 | Nieuwere versies beschikbaar |
Referenties
- Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 5....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
