Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

Summary

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Abstract

Wir beschreiben die Verwendung von Bio-Schicht Interferometrie inhibitorische Wechselwirkungen der ε-Untereinheit mit dem katalytischen Komplex von Escherichia coli ATP-Synthase zu studieren. Bakterielle F-ATP-Synthase ist das Ziel eines neuen, von der FDA zugelassene Antibiotikum zur Bekämpfung der medikamentenresistenten Tuberkulose. Verständnis bakterienspezifischen Auto Hemmung der ATP-Synthase durch die C-terminale Domäne von ε-Untereinheit kann ein neues Mittel, um das Enzym für die Entdeckung der antibakterielle Medikamente an. Die C-terminale Domäne von ε erfährt eine dramatische Konformationsänderung, wenn das Enzym die Übergänge zwischen den aktiven und inaktiven Zuständen und katalytischen Ort Liganden beeinflussen, welche von Konformationen ε vorherrschende ist. Die Assay-Maßnahmen Kinetik der ε die Bindung / Dissoziation mit der katalytischen Komplex und indirekt mealeistet die Verschiebung des enzymgebundenen ε zu und von der scheinbar nondissociable inhibitorische Konformation. Die Bio-Schicht Interferometrie Signal nicht überempfindlich auf Lösungszusammensetzung, so kann es auch verwendet werden, um allosterische Effekte von katalytischen Ort Liganden auf Konformationsänderungen ε überwachen werden.

Introduction

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für viele biologische Prozesse und markierungsfreie optische Methoden wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden in vitro verwendet worden, um die Kinetik der Bindung und Dissoziation ¹ studieren. Die meisten markierungsfreien Methoden ein Biomolekül Immobilisierung auf einer Sensoroberfläche und verwenden Sie ein optisches Signal an einen Bindungspartner aus der Lösung zu erkennen, wie es mit dem immobilisierten Biomolekül ¹ zuordnet. Während SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, ist es anfällig für Störungen aufgrund von Änderungen des Brechungsindex der Lösung über dem Sensor ² fließt. Obwohl nicht so empfindlich wie SPR, Bio-Schicht-Interferometrie (BLI) weniger von Änderungen in der Probenzusammensetzung ^1,3 betroffen. BLI verwendet LWL-Biosensoren, die eine proprietäre biokompatible Beschichtung an der Spitze zu haben. Das hier verwendete (Octet-RED96)-System enthält acht Spektralphotometer. Weißes Licht wird an einer Reihe von Sonden, die an einem Roboterarm bewegen geleitet. Faseroptische Sensoren are, aufgenommen durch die Sonden und in eine Platte mit 96 Vertiefungen enthaltenden Proben. Eines der Zielmoleküle auf der Biosensoroberfläche immobilisiert. Dann Sensoren werden in die Vertiefungen, die die Bindungspartner in der Lösung bewegt wird. BLI überwacht Verband der Bindungspartner immobilisiert mit dem Molekül und überwacht Dissoziation nach dem Umzug die Sensoren an-Lösung ohne den Bindungspartner dann. Bindung von Molekülen an die Biosensor-Oberfläche führt zu Änderungen der optischen Interferenz zwischen Lichtwellen, die von einer Innenfläche und von der externen Schnittstelle zwischen Sensor und zurück in die Lösung Spektralphotometer reflektieren. Diese Veränderungen in der Interferenz quantifiziert und zur kinetischen Raten der Bindung und Dissoziation, wie in der Animation der Figur 1 zusammengefaßt bestimmen.

Wir haben BLI angelegt, um Wechselwirkungen zwischen dem katalytischen Komplex von bakteriellen ATP-Synthase und seine ε-Untereinheit, die das automatische hemmen das Enzym zu messen. ATP synthase ist eine membranständige Drehnanomotor, der Synthese und Hydrolyse von ATP katalysiert ^4. Der katalytische Komplex (F ₁₎ in einer löslichen Form, die als ATPase arbeitet isoliert werden. Ε-Untereinheit besitzt zwei Domänen: die N-terminale Domäne (NTD) ist die korrekte Montage und funktionelle Kopplung des Enzyms notwendige, aber nicht direkt interagieren mit den katalytischen Untereinheiten, der C-terminalen Domäne (CTD) kann das Enzym durch die Interaktion mit inhibieren mehrere katalytischen Untereinheiten ^5,6. Diese ε-vermittelte Regulierung ist spezifisch für bakterielle ATP-Synthase und wird nicht in der mitochondrialen Homolog beobachtet. ATP-Synthase hat als Ziel für antibakterielle Medikamente entstanden, wie die jüngsten FDA-Zulassung von bedaquiline zu arzneimittelresistenten Tuberkulose zu behandeln ⁷ gezeigt. So Targeting ε die hemmende Rolle für die Wirkstoffforschung konnte die antibakterielle die mitochondriale ATP-Synthase nicht hemmen ergeben. Mit dem isolierten katalytischen Komplex (F _1), εwird zu einem dissoziierbares Untereinheit. Doch mit ε F ₁ gebunden ist, der kann einen dramatischen εCTD Konformationsänderung unterziehen, teilweise in zentralen Hohlraum des Enzyms Einfügen und Bildung eines hemmenden Zustand, die wahrscheinlich nicht direkt ^6,8 distanzieren ist. Wir verwenden BLI Kinetik der F ₁ / ε-Bindung und Dissoziation zu messen, und indirekt an allosterische Effekte von katalytischen-Ort-Liganden auf die ε-Konformation zu untersuchen.

In unserem System wurde ε für die Immobilisierung auf der Sensoroberfläche, da BLI-Signal (wie SPR) ausgewählt ist empfindlich gegenüber der Masse der Bindungsmoleküle an der Oberfläche. Die ε-Untereinheit ist klein (~ 15 kDa) gegenüber dem Haupt F _1-Komplex (~ 347 kDa). Somit wird eine größere BLI Signal aus der Bindung an immobilisiertes F ₁ ε führen. Um F ₁ Dissoziation, die sehr langsam sein kann überwachen, müssen ε stark immobilisiert werden. So entschieden wir uns für biotinylierenUnd Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten Biosensoren. Proteine ​​können durch (i) zufällige Modifikation der Oberfläche Lysine ^9, (ii) Umsetzung einer einzigartigen nativen oder gentechnisch Cystein mit einem Biotin-Maleimid-Reagenz ¹⁰ oder (iii) Zugabe einer genetisch bestimmten Biotin-Akzeptor-Peptid, das enzymatisch biotinyliert wird während biotinyliert in vivo-Expression des markierten Proteins ^11. In unserem System wird ε (iii) ⁸ unter Verwendung von Verfahren biotinyliert. Sobald Biotin-markierten ε auf Streptavidin immobilisiert Sensoren können BLI die Bindung und Dissoziation von F _1, die von ε-Untereinheit (F ₁ (-ε)) abgereicherte messen. Für die hier beschriebenen Experimente war vorläufigen Tests durchgeführt, um angemessene Mengen des biotinylierten Proteins zu bestimmen, um auf die Sensoren zu immobilisieren. Dies kann variieren, abhängig von dem Molekulargewicht des Proteins und seinem Bindungspartner, aber das Ziel ist, eine minimale Menge an immobilisiertem Protein t bestimmenHat bietet (i) akzeptable Signal-zu-Rauschen für Bindungskinetik mit einer niedrigen Konzentration des Bindungspartners (nachfolgend K _D) und (ii) minimale Verzerrung Bindungskinetik mit nahezu Sättigungskonzentration des Bindungspartners. Auch kann Stöchiometrie Biotinylierungsgrad variieren (aber vermeiden> 1 Mol Biotin / Mol Protein), so dass einige erste Test kann für jede neue Charge von biotinyliertem Protein benötigt werden, um zu bestätigen, dass eine konsistente BLI-Signal kann während der Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten erreicht werden Sensoren.

Protocol

1. Programmierung des Instruments für BLI-Test

Schalten Sie das Gerät mindestens eine Stunde im Voraus, um die Lampe zum Aufwärmen, das ist notwendig, um das Rauschen zu minimieren und Drift in der optischen Signal während des Experiments. Stellen Sie die gewünschte Temperatur über die Registerkarte Instrument, um die Probe Plattenhalter vorwärmen. Dann das experimentelle Design in der Datenerfassung-Software. Wählen Sie "Neu Kinetics Experiment" in der Registerkarte Assistent Experiment. Dies stellt eine Tabbed-Menü mit allen Schritten, die definiert werden müssen.

1.1. Teller Definition

Definieren Sie die Spalten, die auf der 96-Loch-Probenplatte verwendet werden. Weisen Spalten-Puffer, immobilisiert Protein oder Bindungspartner enthalten. Für jeden Verein gut, geben die Konzentration der Bindungspartner verwendet werden. Hinweis: die Platte Definition in Fig. 2 gezeigt hat Optionen für verschiedene Tests.

1.2. Assay Definition

NHALT "> Definieren Sie alle Schritte für den Test benötigt. Dazu gehören (i) Baseline (mehrere), (ii) Laden, (iii) Vereinigung und (iv) Die Dissoziation der Bindungspartner. dann, wie unten beschrieben, link einzelnen Testschritte mit Spalten von Vertiefungen auf der Probenplatte durch Auswählen der Testschritt und dann einen Doppelklick auf den jeweiligen Spalten. Diese Programme die Sensoren von einer Spalte von Vertiefungen zur nächsten während des Tests bewegt.

1. Grundlinie
   Beginnen mit einer kurzen Basislinien Schritt (≥ 60 sec), mit Sensoren in Assay-Puffer (Figur 2, Spalte 1), um Ausgangssignale BLI in der 96-Well-Platte herzustellen.
2. Laden (Immobilisierung des biotinylierten Proteins auf die Sensoren)
   Zuweisen Sensoren Vertiefungen, welche das biotinylierte Protein (Fig. 2, Spalte 2) enthält. Verwenden Sie die Schwellenwertfunktion, um eine vorgegebene Grad der Bindung (siehe Einleitung) zu erreichen. Stellen Sie die Option Schwelle, so dass alle Sensoren Bewegung seind zur nächsten Spalte von Vertiefungen, wenn einer der Sensoren den Schwellenwert erreicht.
3. Grundlinie
   Fügen Sie einen weiteren Schritt in der Baseline-Puffer (Abbildung 2, Spalte 3, in der Regel> 5 min), um die von den Sensoren weg waschen nicht immobilisierten biotinylierten Proteinen und neue, stabile Basislinie Signale. Für grundlegende Bindung / Dissoziation Assays nur (wie in Abbildung 3), extra eine Basisstufe (60 sec) mit Sensoren in neue Brunnen Puffer (Abbildung 2, Spalte 4) vor der Vereinigung Schritt.
4. Verband (des Bindungspartners an das immobilisierte Protein)
   Für eine Grund Bindung / Dissoziation Assay (wie in Abbildung 3), wählen Sie einen Bereich von Konzentrationen der Bindungspartner für verschiedene Sensoren / Brunnen verwendet werden (Abbildung 2, Spalte 5). Einstellen der Schrittzeit, so dass zumindest ein Sättigungskonzentration des Bindungspartners sollte Gleichgewicht nähern Bindungssignal. Für eineAssay, um allosterische Effekte von kleinen Liganden auf die Dissoziation des Protein-Protein-Komplex (siehe Abbildung 5) zu testen, wählen Sie eine einzelne hohe Konzentration der Bindungspartner (~ 10-fache über dem geschätzten K _D) für den Einsatz in allen Verband Brunnen.
5. Dissoziation (der Bindungspartner)
   Einen Grundbindungs ​​/ Dissoziation Assay nur (wie in Fig. 3) bezeichnen die Sensoren bis Spalte 4 (Fig. 2), den gleichen Puffer als Brunnen für die zusätzliche Grundlinie vor der Vereinigung verwendet zurückzukehren. Für ein Test, um allosterische Effekte kleiner Liganden zu testen, statt bezeichnen Sensoren bis Spalte 6 (Abbildung 2), wobei jeder gut kann Puffer plus verschiedene allosterische Liganden enthalten zu bewegen.

1.3. Sensor Zuordnung

Geben Sie die Stellen in der Sensorschale, die Feuchtsalzstreuung Sensoren für den Test enthält. Identifizieren Sie alle leeren Stellen, da das Experiment fail, wenn keine Sensoren werden bei Ihnen abgeholt.

1.4. Bewertung Experiment

Visualisieren Sie alle geplanten Schritte, um auf Fehler zu überprüfen und gehen Sie zurück, um sie zu korrigieren.

1.5. Führen Experiment

Geben Sie notwendigen Informationen, einschließlich Standort der Datendateien. Geben Sie die gewünschte Temperatur für das Experiment. Wenn die Sensoren noch Vorbenetzung benötigen, wählen Sie die Option, verzögern Start des Experiments. Schließlich ist, wenn alle Probenvorbereitung abgeschlossen (Schritt 2) und sowohl die Probenplatte und Sensorfach im Gerät geladen ist, klicken Sie auf die Go-Taste, um den Test auszuführen.

2. Probenvorbereitung

1. Eine geeignete Testpuffer. Puffer für Experimente in den Fig. 3 und 5 gezeigt: 20 mM MOPS (3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure), Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) (um den pH auf 8,0 einzustellen), 50 mM KCl. Fügen BSA (Rinderserumalbumin, Fettsäure-frei, 0.5mg / ml Endkonzentration) in dem Puffer für alle Testschritte und für alle Verdünnungen der biotinylierten Proteins oder Bindungspartner, nicht-spezifische Bindung von Proteinen an die Sensoren zu minimieren.
2. Verdünnen Sie die biotinylierte Protein (ε) in Assay-Puffer auf eine geeignete Konzentration (siehe Einleitung).
3. Verdünnungen des Bindungspartners (F ₁ (-ε)) in Assay-Puffer (siehe Beiträge zu Konzentrationsbereich zu verwenden).
4. Vorbefeuchtet die Streptavidin-beschichteten Sensoren für mindestens 10 min auf ihre Schutz Saccharose Beschichtung zu entfernen. Entfernen Sie den Sensor-haltigen Zahnstange von der Sensorleiste und legen Sie eine 96-Well-Platte in den Boden der Schale, Schiebe einer Ecke der Platte in der Orientierungs Kerbe auf dem Tablett. Für die Spalte von Sensoren verwendet werden, mit 200 &mgr; l Assay-Puffer pro well in dieser Spalte der 96-Well-Platte. Bringen Sie das Rack von Sensoren, die das Fach in der richtigen Ausrichtung (mit Tabs in Slots).
5. Wie bei der Programmierung in Schritt 1 zugeordnet, füllen Brunnen of die Probenplatte mit Testpuffer oder der entsprechenden Proteinverdünnungen, wie in 2. Einführen von Luftblasen zu vermeiden, da sie Rauschen in dem optischen Signal führen. Eine oder mehrere Referenzvertiefungen, die entweder (i) biotinylierte Protein oder (ii) Bindungspartner verzichtet werden.
6. Öffnen Sie die Tür des Gerätes und stecken Sie den Sensor Tablett auf die Bühne (links), mit Reitern des Fachs in die Schlitze der Bühne eingesetzt. Legen Sie die Probenplatte in den Plattenhalter (rechts), stellen Sie sicher, dass die Platte flach und in der richtigen Orientierung sitzt, wie auf dem Plattenhalter angezeigt. Schließen Sie die Tür und starten den Test von der Datenerfassungsprogramm (Schritt 1.5).

3. Datenverarbeitung

1. Nachdem der Test ausgeführt wurde, öffnen Sie die Datenanalyse-Software, und laden Sie den Ordner mit den Daten. Klicken Sie auf die Registerkarte "Bearbeiten", um eine schrittweise Verarbeitung Menü (links) und die rohen kinetischen Daten zu sehen, mit jedem Sensor (AH) eine andere Farbe zugeordnet (sieheAbbildung 3).
2. Unter "Datenauswahl", klicken Sie auf die Schaltfläche "Sensorauswahl". Auf der "Sample-Kennzeichen-Karte", bezeichnen die Vertiefungen für 1 oder 2 Steuersensoren (G, H in Test von Abbildung 3) als Referenzquellen. Auf der Verarbeitung Menü, überprüfen Sie die "Subtraktion" und wählen Sie "Referenz Wells", um Referenzsignal (Einzel-oder gemittelt) von jedem anderen Sensor das Signal zu subtrahieren.
3. Richten Sie alle Spuren zu Y = 0 mit dem "Y-Achse ausrichten" Schritt. Wählen Sie "Baseline" als Ausrichtungsschritt (dies ist die letzte Grundlinie vor der Vereinigung Schritt). Für "Zeitbereich" geben Sie die letzten 10 Sekunden von dieser Grundlinie (dh 50-60 Sekunden für eine 60-Sekunden-Basislinie, wie in Abbildung 3).
4. Überprüfen Sie die "Inter-Schritt-Korrektur"-Box, um die Signalverschiebungen zwischen Assoziation und Dissoziation Schritte zu minimieren. Wählen ausrichten, um Baseline oder Dissoziation.
5. Wählen Savitzky-Golay-Filter-Funktion in den meisten Fällen und klicken Sie auf "Process Data!" , um fortzufahren. Sichtprüfungdie letzten verarbeiteten Daten (unten rechts). Mit Tests zur globalen Datenanalyse (wie in Abbildung 4) bestimmt, ob das Signal Spuren zeigen eine deutliche Verschiebung zwischen Assoziation und Dissoziation Schritte, ändern Sie die Auswahl der Dissoziation oder Baseline für die "Inter-Schritt-Correction" und neu verarbeiten die Daten, bevor Sie mit Daten Analyse.

4. Datenanalyse

Klicken Sie auf die Registerkarte "Analyse" in der Datenanalyse zu beginnen. Hinweis: Das Beispiel unten sind die Schritte für die globale Analyse von mehreren Bindungs ​​/ Dissoziations-Kurven (wie in 3).

1. Für "Step auf Analyze", wählen Sie Assoziation und Dissoziation. Für "Model", wählen 01.01. Hinweis: andere begrenzte Optionen sind verfügbar.
2. Für "Fitting", wählen Sie Global (Full). Für "Group By" wählen Farbe (wie auf der Grafik). Wählen Sie "R _max UNLINKED Durch Sensor" für unabhängige Montage von R _max ermöglichen (maximale Signalantwort auf Sättigung der Bindung des Partner an das immobilisierte Protein). Hinweis: Wir tun dies für die meisten Tests als Sensoren unterscheiden sich leicht in der Menge an Protein immobilisiert (siehe Abbildung 3, Loading).
3. Auf der gezeigten Tabelle sicher, dass alle Sensor Spuren analysiert werden dieselbe Farbe haben, so werden sie als globaler Satz analysiert werden. Wählen Sie bei Bedarf ein oder mehrere Sensor Spuren von den globalen Pass weglassen: Unter dem "Include"-Spalte mit der rechten Maustaste auf die gewünschte Sensorposition und wählen Sie "Ausschließen Wells".
4. Klicken Sie auf "Fit Kurven!" , um die nicht-lineare Regressionsanalyse starten. Untersuchen Sie die passenden Ergebnisse, die (i) Überlagerung von Regressionskurven mit Sensordatenspuren (wie in Abbildung 4), (ii) Grundpass Residuen und (iii) eine Tabelle mit bestimmten Parameterwerte (Geschwindigkeitskonstanten, R _max umfassen, K _D) und Statistiken (Standardfehler für die Parameter, Chi-Quadrat, R ^2).
5. Unter "Daten-Export", speichern Anpassungsergebnisse, indem Sie auf "Export Tabelle zu. Csv-Datei". Für grapHing oder weitere Analyse der Daten / Kurven ausgestattet mit anderer Software, klicken Sie auf "Export Fitting Ergebnisse", um die Daten der einzelnen Sensor und angepassten Kurve in einer Textdatei speichern.

Representative Results

Echtzeit-Bindung und Dissoziation BLI Kinetik sind in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Experiment wurde mit Testpuffer in Assoziation und Dissoziation getan. Dieses Experiment wurde mit einer 10 min Basis Schritt gestartet, da die Sensoren erst kurz vorbefeuchtet worden. Als nächstes wurde biotinyliertes ε auf den Sensoren geladen. Keine nachweisbare Dissoziation von ε aufgetreten ganzen restlichen Schritte von der Referenzkurve (G), die keine Bindungspartner aufgenommen hatte gesehen. Eine zweite Referenzsensor (H) war frei von immobilisierten Protein und zeigten eine geringe unspezifische Bindung des Bindungspartners. Verschiedene Konzentrationen von F ₁ (-ε) wurden in den Verein Schritt für Sensoren AF, um Ergebnisse zu global passen und die besten Werte für k _a, k _d und K _D eingesetzt. Ergebnisse wurden wie in dem Protokoll verarbeitet, wodurch die Datenspuren (blau) in 4. In diesem Fall wurde die Referenzsensor Spur H von der Probe abgezogen trAsse für unspezifische Bindung der Bindungspartner und Systemsignaldrift zu korrigieren. In der Datenanalyse Schritt wurden alle Kurven global fit mit einem 1:1-Modell (Einzel k _a, k Einzel _d), die "Global (Full)" fit nimmt vollständige Dissoziation des Bindungspartners (Signal auf Null bei unendlicher zurück Zeit) (Fig. 4, rot). Beachten Sie, dass bei den zwei höchsten Konzentrationen von F ₁ (-ε), gibt es kleine, aber erhebliche Abweichungen der Daten von dem globalen 1:1-Modell. Niedrige Konzentrationen von immobilisierten Liganden (biotinyliert "ε"-Untereinheit) wurden verwendet, und die Passform nicht durch, einschließlich einem Massentransportfaktor in dem Modell (nicht gezeigt) verbessert. Jedoch F ₁ (- "ε") ist ein großer Komplex (~ 350 kDa) und anderen Experimenten (nicht gezeigt) legen nahe, dass diese Abweichungen aufgrund der reduzierten Bindungs ​​Zugänglichkeit einer Fraktion von immobilisierten Liganden, dh ein F ₁ zu bindenden ein "ε" sterisch Zugang zu einem anderen biotinylierten behindern"Ε" auf der gleichen Tetramer Streptavidin gebunden.

Figur 5 zeigt ein anderes Experiment, in dem das Enzym gebunden ist, um ε-Sensor immobilisiert in Gegenwart von 1 mM ATP / EDTA, das prädisponiert meisten F ₁ / "ε"-Komplexe, die nichthemmenden Konformation, die leicht dissoziiert ⁸ annehmen. Sensoren wurden dann in Vertiefungen, die Assay-Puffer mit verschiedenen Liganden Dissoziation. Dies zeigt die Wirkung von verschiedenen Liganden auf die Konformation des ε. Zum Beispiel, die Exposition gegen MgADP / Pi dramatisch verlangsamt Netto Dissoziation, die anzeigt, dass ε verschoben Anpassung an die fest gebundene, hemmenden Zustand. Komplex Dissoziationskinetiken wurden beobachtet, da verschiedene Liganden verursacht verschiedene Schichten in der Fraktion F _1. Ε mit ε-Komplexe in den aktiven (abspaltbare) oder inhibierende (nondissociable) Konformationen. Es ist auch möglich, dass wesentliche Konformationsänderungen des gebundenen Proteinetragen direkt auf Veränderungen in BLI-Signal, aber in unseren Studien, erscheint diese vernachlässigbar im Vergleich zu dem Signal für die Bindung / Dissoziation des großen F _1-Komplex (siehe Shah et al ^8, 5D;. Übergang zu Linien 3 und 6 sehr ähnliches Verhalten, auch wenn ihre Bedingungen begünstigen Konformationen der gebundenen F _1). Die Datenanalyse Software nicht für solche komplexen Dissoziationskinetik konzipiert. So exportierten wir die Daten für nicht-lineare Regressionsanalyse mit anderen Software-Text-Dateien.

Abbildung 1. Prinzipien der Bio-Schicht-Interferometrie. Animation, fasst die zugrunde liegende Physik zur Erfassung biomolekulare Interaktions von BLI. Licht, das durch die Sonden von der Innenfläche des Sensors und (ii) von der äußeren in zurück zu den Spektralphotometer (i) reflektiertenSchnittstelle des Sensors mit der Probenlösung. Dies führt zu einem Interferenzmuster. Bindung der Moleküle an die Sensoroberfläche ändert das Interferenzmuster. Dies kann als ein Nanometer-Verschiebung der relativen Intensität gegen Wellenlänge aufgetragen werden. Die Überwachung dieser Nanometer-Verschiebung über die Zeit bietet Bindung und Dissoziation Kinetik. Grafiken werden mit Genehmigung von FortéBio ¹² angepasst.

2. Schematische Anordnung von Proben in der 96-Well-Probenplatte. Die Sensoren werden parallel von Spalte zu Spalte bewegt werden und kann entweder nach links oder rechts, wie in einem bestimmten Assay-Protokoll definiert bewegt werden. Wells mit grauer Farbe darstellen Assay-Puffer in der Erwägung, rot, blau und grün ist immobilisierte Protein, Bindungspartner und ligands auf.

Abbildung 3. Bildschirmaufnahme, die Rohdaten aus einer BLI-Test. Vertikale rote Linien zeigen Bewegung der Sensoren zwischen Testschritte des Protokolls. Schrittarten werden auf dem Bild bezeichnet. Stellen der Puffer und Proben werden wie in Fig. 2 gezeigt. Die durch die Anzahl auf dem oberen Rand des Diagramms angegeben, wurden Streptavidin-beschichtete Sensoren bewegt zwischen verschiedenen Spalten der Probenplatte in der folgenden Reihenfolge: 123454. Die Legende unterhalb des Diagramms gibt die Farbe für Datenspur jedes Sensors. Im Laden Schritt wurde jeder Sensor außer H mit 50 nM biotinyliertem "ε"-Untereinheit inkubiert. 30 (: In der Vereinigung Schritt wurden Sensoren mit nM Konzentrationen von "ε" abgereicherten F ₁ inkubiertA, H), 20 (B), 15 (C), 10 (D), 5 (E), 2,5 (F), 0 nM (G). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

4. Abbildung der analysierten Daten aus dem BLI Assay von 3. Die Daten wurden verarbeitet und angebracht, wie im Text beschrieben. Nur Assoziation und Dissoziation Schritte werden gezeigt, geteilt durch eine vertikale rote Linie. Die verarbeiteten Daten Kurven sind blau, die nichtlineare Regression passt 1:1 globale Analyse sind in rot dargestellt. Globale Anpassungsergebnisse ^8: k = _a 2 × 10 ⁵ M ^-1 s ^-1 (± 0,1%), K _d = 4,8 × 10 ^-5 s ^-1 ("±" 0,1%), was K _D = 0,24 nM. Anpassungsgüte: R² = 0,999054. Die Bindung Parameter maximale (R _max) war fit für jeden Sensor separat mit Mittelwert = 0,813 nm ("±" 0,0803). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

5. Ergebnisse einer BLI Assay zeigt allosterische Effekte von Liganden auf die ε-Konformation. F ₁ (-ε) mußte Sensor immobilisierten ε in Gegenwart von 1 mM ATP / EDTA. Das Ende der Assoziationsphase, und ein Teil des Spaltphasen gezeigt. Während der Dissoziation Schritt, verschiedene Liganden für die F ₁ katalytischen Zentren (für jede Spur aufgeführt) wurden aufgenommen, um ihre Auswirkungen auf allosterische Dissoziation von F ₁ zu beobachten

Discussion

Die derzeit verfügbaren Instrumente zur BLI ermöglichen signifikante Durchsatz und Flexibilität in Tests zur biomolekularen Wechselwirkungen. Verschiedene Lösungsproben werden in die Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte abgegeben wird, und einen Satz von parallelen BLI Sensoren programmiert werden, um zwischen den Spalten der Vertiefungen auf der Platte hin und her zu bewegen. Die Proben werden durch Orbitalschütteln während des Tests gerührt. Das hier verwendete System 8 Sensoren und verwendet eine 96-well-Probenplatte, aber ein anderes System verwendet Sensoren 16 und eine 384er Probenplatte. Somit kann die Interaktion zwischen einem Sensor-immobilisierten Biomolekül und seinem Bindungspartner in Lösung unter verschiedenen Bedingungen mit mehreren Sensoren parallel getestet werden. Zum Beispiel in dem ersten Test hier mit dem immobilisierten inhibierenden ε-Untereinheit dargestellt, Wechselwirkungen wurden mit sechs verschiedenen Konzentrationen des Enzyms (Bindungspartner), der parallel (Fig. 3 und 4) gemessen. Dies ermöglichte eine globale Analyse Bestimmungne ein einziges Paar von Geschwindigkeitskonstanten (k _{a, k-d)} der Netto Bindung und Dissoziation und somit eine Gleichgewichts-Dissoziationskonstante (K _D = k _d / k _a), die stimmt eng mit der Inhibitorkonstanten (K _i) bestimmt aus Lösung Assays der Enzymhemmung durch ε ^8. Eine zweite Art von Experiment (Fig. 5) zeigten, dass BLI können allosterische Effekte von kleinen Liganden über die Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen zu überwachen, die Auswirkungen der verschiedenen Liganden wurden parallel verglichen. Es gibt Einschränkungen zum Erfassen Auswirkungen der allosterischen Liganden, da BLI-Signal hängt von der Masse des Bindemoleküls und kann direkt unter optimierten Bedingungen ¹³ Bindung von kleinen Verbindungen zu detektieren. Aber in dem Test der Fig. 5, der Bindungspartner, F _1, ein großes Protein-Komplex (~ 347 kDa), so dass die BLI-Signal für die Bindung / Dissoziation wurde durch ad nicht signifikant beeinflusstzusätzliche Bindung von kleinen Liganden, wie ATP (~ 500 Da) in die F _1-Komplexes. Dies wurde mit Tests, in denen diese Liganden nicht die BLI-Signal für F ₁ zu einer verkürzten Form von ε fehlt die hemmende CTD ⁸ gebunden beeinflussen bestätigt. Somit muß Assays allosterische Effekte der Masse der allosterischen Liganden relativ zu den Massen der interagierenden Proteine ​​zu betrachten, und umfassen vorzugsweise Steuerelemente zur direkten BLI Reaktion auf die Bindung des Liganden zu testen.

Beachten Sie, dass bestimmte Schritte und Modifikationen in der Versuchsprotokoll kann kritisch für bessere Ergebnisse zu erzielen und genauere Analyse sein. Zum Beispiel, wie in dem hier beschriebenen Protokoll (siehe Schritte 1.2.3, 1.2.5), ein Test für die globale Analyse der Bindung und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten bestimmt sind, sollten eine zusätzliche Ausgangsstufe (siehe Schritt 1.2.3) in einer neuen Spalte enthalten Puffer Vertiefungen (Figur 2, Spalte 4) vor der Vereinigung Schritt, und die Sensoren sollten returned zu gleichen Spalte der Puffer-Bohrungen zur Dissoziation Schritt (siehe Schritt 1.2.5). Mit jeden Sensor in der gleichen gut (mit den gleichen optischen Eigenschaften) vor und nach der Vereinigung Schritt können die inter-Schritt-Korrektur (Schritt 3.4) für Verband / Dissoziation Schritten zu verbessern, und dies erleichtert globale kinetische Einbau von mehreren Datenspuren (wie in Abbildung 4). Auch für Tests, die mehr als vorläufigen hier gezeigt werden, hat das Programm die Möglichkeit, zu verkürzen oder zu verlängern, dass der Zeitpunkt der Schritt während des Tests (während es die aktiver Schritt). Dies ist zum Beispiel nützlich, wenn die optimale Ladesignal nicht bereits bekannt ist, oder wenn mehr Zeit benötigt wird, um genügend Dissoziation um einen guten Sitz für die Dissoziation Rate zu erreichen erlauben.

Unspezifische Bindung des Bindungspartners an die Sensoroberfläche kann ein Problem für die markierungsfreie Methoden, wie SPR und BLI sein. In unseren Untersuchungen wurde diese effektiv mit BSA in dem Assay-Puffer minimiert. Wie in Immunoblotting-Protokolle, außer BSA-Proteine ​​verwendet werden können, und niedrige Konzentrationen an Detergens kann auch Minimierung unspezifischer Bindung (Tween20 in Kinetikpuffer vom Lieferanten verwendet). Abzug des Rest unspezifische Bindung (und seinen Zerfalls während, auch mit minimalen unspezifische Bindung, sollten die meisten Tests zumindest einen Steuersensor ohne immobilisierte Protein, aber mit der höchsten Konzentration der Bindungspartner in der Vereinigung Schritt (siehe Abbildung 3, Sensor-H) sind Die Dissoziation Schritt) deutlich verbessern kann kinetische Analysen für die spezifische Bindung / Dissoziation untersucht. Auf der anderen Seite, sobald erste Tests bestätigen, dass das biotinylierte Protein bleibt stabil nach dem Laden Schritt gebunden (siehe Abbildung 3, Sensor-G), kann diese Kontrolle verzichtet werden und für eine Probe Bedingung, dass der Sensor eingesetzt werden.

Für robuste Bestimmung der Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten mit BLI verschiedenen Konzentrationen von b(4, wie in Fig. 3 und) Inding Partner verwendet werden und alle Datenspuren ist durch die globale Analyse angepasst werden, wenn möglich. Idealerweise sollte der Bereich der Konzentrationen ~ 10-fach oberhalb und unterhalb des geschätzten K _D erstrecken. In unserem Fall mit einem hochaffinen Wechselwirkung _(K d = 0,25 nM), das Signal-zu-Rausch war schlecht für Bindungskinetik mit _{Sub-K-D-Konzentrationen.} So Konzentrationen von Bindungspartner über der K _D wurden eingesetzt, dass wesentliche Änderungen in Raten beobachtet und Ebenen der Bindung gewonnen wurden (siehe Abbildung 3). Es wurde auch eine lange Dissoziation Schritt verwendet, um das Vertrauen in die Montage der langsame Dissoziationsgeschwindigkeit verbessern. Mit hochaffine Wechselwirkungen, ist es auch möglich, dass eine langsame Dissoziation durch erneute Bindung während der Dissoziation Schritt übertrieben, da BLI Assays werden in einem gerührten Probe nicht weiter Strom über den Sensor, wie für SPR erfolgt. Dieses Potential kann als Artefakt prüfendensagt, in dem der Spaltpuffer enthält eine "Senke" von überschüssigem die dissoziierten kompetitiven Proteinbindungspartner bindet und verhindert erneute Bindung an den Sensor-immobilisiertes Protein ^14. In unserem System wurde dies durch den Vergleich der Ergebnisse mit und ohne nichtbiotinylierten (> 10-fach über K _D) in der Dissoziation gut gemacht, und wir bestätigt, dass Rebinding war kein signifikantes Problem ^8. Schließlich, wenn Sätze von kinetischen Ergebnisse nicht passen gut durch die globale Analyse (1:1 oder 2:1-Modelle verfügbar), gibt es andere Analysemöglichkeiten für die Fehlersuche. Zum Beispiel, statt der Wahl "Global (Full)" (in Schritt 4.2), "Local" gewählt, um jede Spur unabhängig Sensor passen. Wenn die Bindung folgt einem einfachen 1:1-Modell, Plotten die beobachteten Bindungsraten (k _obs) gegen die Konzentrationen der Bindungspartner sollte eine lineare Abhängigkeit zu zeigen, mit der Steigung gleich der zweiten Ordnung, innere Bindungsrate. Die Registerkarte Analyse der Software hat eine "XYGraph "-Fenster, die eine schnelle Visualisierung von dieser Beziehung ermöglicht.

Eine Beschränkung des Instruments, die wir verwendeten, ist die zur Verfügung stehende Temperaturbereich. Mit einem Bereich von 2 ° C über Raumtemperatur bis 40 º C, kann nur Moleküle, die in diesem Bereich stabil sind, verwendet werden. Darüber hinaus wird durch die thermodynamische Analyse engen Temperaturbereich begrenzt. Eine weitere allgemeine Einschränkung ist, dass die maximale Testzeit ist ~ 4 h, danach entwickeln Artefakte aufgrund von Verdampfung von Proben aus dem offenen Mikrotiterplatte.

BLI beinhaltet eine relativ einfache Anordnung im Vergleich zu SPR. Die Sensoren zwischen den Spalten von Vertiefungen mit festen Volumen bewegt wird, anstelle einer konstanten Fluss von Probe über den Sensor. Obwohl sie nicht so empfindlich wie SPR, BLI weniger durch Änderungen im Brechungsindex aufgrund von Änderungen in der Probenzusammensetzung beeinflusst. Insgesamt ist mit diesem relativ einfache Handhabung und Flexibilität des Instruments bei der Verlagerung zwischen den Assaybedingungen bereitzustellen BLIsa vielseitiges Werkzeug für in-vitro-Assays von biomolekularen Wechselwirkungen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
Bovine Serum Albumin	Sigma	A6003-10G	Fatty Acid free
Biosensor/Streptavidin	Pall/FortéBio	18-5019	Tray of 96 sensors
Microtiter plate	Greiner Bio-one	655209	Black, Polypropylene
Data Acquisition software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available
Data Analysis software	Pall/FortéBio	Version 6.4	Newer versions available