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Chemistry

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

Published: April 3, 2014 doi: 10.3791/51385
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

Summary

Das hierin beschriebene Protokoll zielt darauf ab, zu erläutern und verkürzen die zahlreichen Hindernisse in den Weg der komplizierten Weg führt zu modifizierten Nukleosidtriphosphaten. Folglich dieses Protokoll erleichtert sowohl die Synthese dieser aktiviert Bausteine ​​und ihre Verfügbarkeit für die Praxis.

Abstract

Die traditionelle Strategie für die Einführung von chemischen Funktionalitäten ist die Verwendung von Festphasensynthese durch Anhängen geeigneter Weise modifizierten Phosphoramidit-Vorläufern zu der entstehenden Kette. Jedoch sind die bei der Synthese und der Beschränkung auf eher kurze Sequenzen verwendeten Bedingungen behindern die Anwendbarkeit dieser Methode. Auf der anderen Seite werden modifizierte Nukleosidtriphosphate Bausteine, die für die leichte Einführung zahlreicher funktioneller Gruppen in Nukleinsäuren, eine Strategie, die den Weg für die Verwendung von modifizierten Nukleinsäuren in einer weitreichenden Palette von praktischen Anwendungen verwendet worden sind, ebnet aktivierten wie funktionelle Tagging und Generierung von Ribozymen und DNAzyme. Eine der größten Herausforderungen liegt in der Komplexität der Methode, die zur Isolierung und Charakterisierung dieser Nukleosid-Analoga.

In diesem Video-Artikel, ein ausführliches Protokoll für die Synthese von thes präsentieren wire modifizierten Analoga mit Phosphor (III)-basierenden Reagenzien. Darüber hinaus wird das Verfahren für ihre biochemische Charakterisierung weitergegeben, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Primerverlängerungsreaktionen und TdT Tailing-Polymerisation. Diese detaillierte Protokoll wird für die Verwendung des Handwerks von modifizierten dNTPs und ihre weitere Verwendung in der chemischen Biologie sein.

Introduction

5'-Nukleosid-Triphosphate ((d) Hohlstunden) stellen eine Klasse von lebenswichtigen Biomolekülen, die in zahllosen Prozessen und Funktionen, angefangen davon, dass die universelle Währung der Energie, um Regulatoren der Zellstoffwechsel beteiligt sind. Zusätzlich zu ihrer Rolle bei dieser grundlegenden biologischen Veränderungen, ihre modifizierten Gegenstücke als vielseitiger und leichter Plattform für die Einführung von funktionellen Gruppen in Oligonukleotide, einer Methode, die gut ergänzt die automatisierte Festphasensynthese, die normalerweise angewendet wird 1,2 schoben. Ja, vorausgesetzt, die (d) Hohlstunden können als Substrate für RNA-und DNA-Polymerasen 3, eine Fülle von Funktionsgruppen einschließlich Aminosäuren 4-13, Boronsäuren 14,15, nornbornene 16, diamantartige Rückstände 17, Seitenketten für handeln Organokatalyse 18, Gallensäuren 19 und sogar 20-Oligonukleotide können in Oligonukleotide eingeführt werden.

_content "> Darüber hinaus repräsentiert eine günstige Vektor für die Funktionalisierung von Nukleinsäuren können modifiziert dNTPs in SELEX und andere kombinatorische Verfahren der in vitro-Selektion für die Erzeugung von modifizierten katalytischen 21-30 Nukleinsäuren und Aptamere für verschiedene praktische Anwendungen 10 in Eingriff gebracht werden, 31-36. Die zusätzlichen Seitenketten, die durch die Polymerisation der modifizierten dNTPs eingeführt werden, werden gedacht, um den chemischen Raum, die bei einem Selektionsexperiment erforscht werden können und ergänzen die eher schlechte funktionelle Arsenal von Nukleinsäuren 37 zu erhöhen. Trotz dieser attraktiven Eigenschaften und die jüngsten Fortschritte in der Entwicklung der beiden synthetischen und analytischen Methoden gemacht, keine allgemein gültige und hochverzinslichen Verfahren besteht für die Crafting-modifizierter Nucleosidtriphosphaten 2,38.

Ziel dieses Protokolls ist es, Licht in die (manchmal) komplizierte Verfahren, die t Schuppeno Die Synthese und biochemische Charakterisierung dieser aktivierten Bausteine ​​(Abbildung 1B). Besonderer Wert wird auf alle synthetischen Details, die oft schwer zu finden oder nicht vorhanden sind in der experimentellen Abschnitte sind aber noch entscheidend für den erfolgreichen Abschluss des synthetischen Weg führt auf die Isolierung von reinem (d) Hohlstunden (Abbildung 1) gegeben werden.

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Protocol

1. Synthese der modifizierte Nukleosidtriphosphate

Der synthetische Ansatz gewählt wurde nach dem von Ludwig und Eckstein entwickelt, da diese Methode in der Regel zuverlässig und führt zu sehr wenige Nebenprodukte (Abbildung 1A) 39 Verfahren.

  1. Coevaporate die entsprechend 3'-OAc-Nucleosid (typischerweise 0,1 mmol) zweimal mit wasserfreiem Pyridin (2 ml) und dann unter Vakuum über Nacht trocknen. Zur gleichen Zeit, trocken Tributylammoniumpyrophosphat (0,13 mmol) über Nacht unter Vakuum.
  2. Lösen Sie das Nukleosid in einem Minimum von trockenem Pyridin (0,2 ml) und fügen trockenem Dioxan (0,4 ml) als Co-Lösungsmittel. Schließlich fügen 2-Chlor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (0,11 mmol) und lassen bei Raumtemperatur für 45 Minuten reagieren.
    Anmerkung: Es ist bemerkenswert, dass besondere Sorgfalt sollte mit dem 2-Chlor-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on-Reagenz entnommen werden. Ja sogar Lagerung dieses Reagenz unter Inertgas-Atmosphäre,hier nicht ausreicht, um seine Zersetzung zu verhindern. Somit ist die, die in diesem Zersetzung gebildete weiße Feststoff kann und sollte vor der Verwendung aus abgekratzt werden.
  3. Bereiten Sie eine Lösung von Tributylammoniumpyrophosphat in trockenem DMF (0,17 ml) und frisch destilliertem Tributylamin (58 ul; Molekularsiebe nie hinzufügen). Hinzufügen der resultierenden Lösung zu dem Reaktionsgemisch (ein weißer Niederschlag erscheint, aber schnell verschwindet) und lassen bei Raumtemperatur für 45 Minuten reagieren.
  4. Bereiten Sie eine Lösung von Iod (0,16 mmol) in Pyridin (0,98 ml) und H 2 O (20 ul) und zu der Reaktionsmischung, um die P &agr; oxidieren (III)-Zentrum. Die entstehende dunkle Lösung auf Raumtemperatur für 30 min gerührt.
  5. Verwenden eine 10% ige wässrige Lösung von NaS 2 O 3, die I 2-Überschuß zu löschen. Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum (die Temperatur des Wasserbades des Rotationsverdampfers muss unter 30 ° C gehalten werden). In H 2 O (5 ml) und erlauben dem mixture bei Raumtemperatur für 30 min stehen gelassen, um das zyklische Triphosphat-Rest hydrolysiert.
  6. Auf dieser Stufe werden die Schutzgruppen in der Regel (dh 3'-OAc und die Gruppen an den Seitenketten der Nukleobase) entfernt. Folglich fügen NH 4 OH (30% in H 2 O, 10 ml) zu dem rohen und rühre 1,5 Stunden bei Raumtemperatur und Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum.
  7. 2 ml H 2 O und aufgeteilt in 2 Röhren. Hinzufügen von 12 ml einer 2% igen Lösung von NaClO 4 in Aceton und Zentrifuge (1.000 × g) für 30 min. Dieser Vorgang wird noch einmal wiederholt. Diese Ausfällung ermöglicht die Abtrennung der Lösungsmittel und Reagenzien für die Synthese von Triphosphat (die Ausfällung wird) verwendet, wodurch die anschließende RP-HPLC-Reinigung wesentlich vereinfacht.
  8. Nach Lufttrocknung der ölige Rückstand, notieren Sie eine 31-P-NMR-Spektrum des Rohproduktes (Standardverfahren, siehe auch Liste der Materialien und Abbildung 3) undin 4 ml H 2 O lösen,
    Anmerkung: Diese Syntheseverfahren konzentriert sich hauptsächlich auf die Erzeugung von modifizierten Desoxynucleosidtriphosphate, aber ein sehr ähnliches Verfahren kann für die RNA-Gegenstücke (einfach durch Verwendung von 2 ', 3'-Bis-O-acetylierten Vorstufen) angewendet werden.

2. HPLC-Reinigung der modifizierte Nukleosidtriphosphate

  1. Herstellung einer 1 M Stammlösung von Triethylammoniumbicarbonat (TEAB): 40
    1. Eine Lösung aus 1 Mol Triethylamin (139 ml) in ≈ 600 ml destilliertem und filtriert H 2 O
    2. Bubble-CO 2 (Trockeneis und über eine Gaswaschflasche) in die Lösung unter kräftigem Rühren, bis ein pH-Wert von 7,6 erreicht ist (dies wird mindestens 10 Stunden dauern). Diese Stammlösung kann im Kühlschrank bis zu einem Monat aufbewahrt werden.
  2. Reinigung:
    1. Bereiten Sie zwei Pufferlösungen von der 1 M Lager: 2 L 50 mM TEAB in ultrareinem Wasser (Laufmittel A) einnd 1 l 50 mM TEAB in 50% MeCN (Laufmittel B). Entgasen beide Eluenten unter Vakuum und Rühren für 20 min (Aufmerksamkeit wird, um nicht den pH-Wert durch Entfernen von CO 2 während der Entgasung ändern erforderlich).
    2. Vorbereitung einer Analyseprobe, indem 10 ul des rohen Triphosphat in 300 &mgr; l destilliertem H 2 O und Injizieren in ein HPLC-System mit einer semi-präparative RP-Säule (C18) ausgerüstet ist und mit einem Gradienten von 0-100% B in 40 min (Abbildung 4). Stellen Sie die HPLC-Programm nach der R t des Triphosphats (was in der Regel der Hauptpeak im Chromatogramm) und das Diphosphat (die einen etwas niedrigeren R t hat). Das rohe Gemisch mit diesen Bedingungen und durch Entfernen frühen Fraktionen, die einige Diphosphat enthalten könnten.
    3. Vereinen alle Fraktionen, die das Produkt enthalten und gefrierTrocken (die, um die Hydrolyse zu der unerwünschten diphosph Minimierung der Verdampfung am Rotationsverdampfer bevorzugtate). Coevaporate mehrmals mit Reinstwasser (zum Rest Triethylamin aus den Eluenten entfernen). Bewerten Sie die Reinheit der NMR-Triphosphat (beide 1 H-und 31 P-NMR) und MALDI-TOF durch Anwendung von Standardprotokollen (siehe Abbildung 5). Typische Ausbeuten durch Anwendung dieses Protokolls erhaltenen liegen typischerweise im Bereich von 30-70%, abhängig von dem Substrat.

3. Primerverlängerungsreaktionen und TdT Polymerisation

  1. 5'-Endmarkierung des Primers
    1. Mischungs 30 pmol der entsprechenden Primer (z. B. P1, Materialliste) mit 4 ul 10x-Polynukleotidkinase (PNK)-Puffer, 3 &mgr; l γ-[32 P]-ATP, 1 ul PNK und ddH 2 O (für ein Gesamtreaktionsvolumen von 40 ul). Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 30 min und dann wärme deaktivieren Kinase (10 min bei 70 ° C).
    2. Während der Markierungsreaktion vorbereitenein G10 Sephadex-Säule durch Einstecken einer 1 ml Pipettenspitze mit silanisierten Glaswolle und Füllen der Spitze mit G10-Lösung (10% in ddH2O, autoklaviert). Spin down und dreimal mit 500 ul ddH 2 O und einem letzten Waschen mit 50 ul ddH 2 O. Führen Sie das Reaktionsgemisch durch den G10 (um die freie radioaktive Markierung entfernen).
    3. Gel reinigen (PAGE 20%) die radioaktiv markierten Primer und erholen sich durch die Anwendung der Andrang und genießen Verfahren (dh die Elution mit 500 ul einer wässrigen Lösung mit 1% LiClO 4 und 1 mm Netto 3 (pH 8) bei 72 ° C für 15 min). Ethanol Niederschlag und G10 entsalzen das eluierte Oligonukleotid.
  2. Primer-Extension-Reaktion
    1. Glühen 1 pmol radioaktiv markierten Primer P1, 10 pmol Primer P1 und 10 pmol Vorlage T1 (Materialliste) in 10x Reaktionspuffer (durch den Lieferanten der Polymerase verwendet werden zur Verfügung gestellt), indem Sie den tube in heißem (90-95 ° C) Wasser und durch die Möglichkeit, schrittweise abkühlen auf Raumtemperatur (über 45 min).
    2. Setzen Sie die Röhrchen auf Eis und fügen Sie (wiederum) die dNTP-Cocktail (die sowohl die modifizierte und die natürlichen Triphosphate, 100 uM Endkonzentration) und 1 U der DNA-Polymerase (Vent (exo -) Klenow, Pwo oder 9 ° N m) und komplett mit Wasser (für eine Gesamtreaktionsvolumen von 20 ul). Inkubieren bei der optimalen Arbeitstemperatur des Enzyms (z. B. 60 ° C für 30 min bei Vent (exo -) verwendet wird).
    3. In 20 ul-Stop-Lösung (Formamid (70%), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; 50 mM), Bromphenolblau (0,1%), Xylencyanol (0,1%)), erhitzen die Proben (95 ° C, 5 min), cool unten (0 ° C), und lösen durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Visualisieren von Phosphor.
  3. TdT Polymerisation
    1. Jeweils 7 pmol Einzelstrang-Unmarkierte Primer P2 (Materialliste), 1 pmol radioaktiv markierter Primer in 1 ul TdT-Puffer 10x.
    2. Setzen Sie die Röhrchen auf Eis und fügen Sie (wiederum) die dNTP-Cocktail (in ausreichender Konzentration zwischen 10 und 200 um liegt) und der Polymerase TdT (4 U). Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde. Werden 10 ul der Stop-Lösung, Erwärmen der Proben (95 ° C, 5 min), Abkühlen (0 ° C) und löst durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE 15%). Visualisieren von Phosphor.

4. PCR mit modifizierten Nucleosidtriphosphaten

  1. Mischen 8 pmol sowohl die Vorwärts-und Rückwärts-Primern mit 0,5 pmol der Template amplifiziert werden. In 10x Reaktionspuffer und die dNTP-Cocktail (für eine 200 uM Endkonzentration), das Glas auf Eis. 1 U der DNA-Polymerase und komplett mit H 2 O auf ein Endvolumen von 20 &mgr; l zu erreichen. Übertragen Sie die Mischung in ein PCR-Röhrchen und führen 30 PCR-Zyklen.
  2. Verdünnen 6 ul mit 6 ul 2x Saccharose-Ladepuffer und lösen durch Agarose 2%-Elektrophorese (gefärbt mit Ethidiumbromid). Visualisieren von Phosphor.

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Representative Results

Geändert Nucleosidtriphosphaten sind verlockend Syntheseziele, da sie ermöglichen die einfache Einführung einer Vielzahl von funktionellen Gruppen in Nukleinsäuren 41. Jedoch ist die Isolierung und Charakterisierung dieser aktivierten Bausteine ​​oft mühsam, offenbart ist. Daher sind die hier gezeigten Ergebnisse gedacht, um eine helfende Hand bieten, um die verschiedenen Schritte innerhalb der zuvor genannten synthetischen und biochemischen Verfahren (Abbildung 1B) zu folgen.

Insbesondere Figur 3 zeigt ein typisches rohes 31 P-NMR-Spektrum eines modifizierten dNTP (in diesem speziellen Fall dU BPU TP (4) 18, Fig. 2), wobei die charakteristischen Signale der Phosphorzentren beobachtet werden (dh eine Dublett bei -5,02 (P-γ), ein Dublett bei -10,44 (P α) und einem Triplett bei -20,55 (P β) ppm). Darüber hinaus istignals ergeben für das Diphosphat (zwei Dubletts bei -4,84 und -10,63 ppm) und Monophosphat (Singulett bei -0.18 ppm) Nebenprodukte zusammen mit höheren Phosphate (Signale bei -21,02 und -23,19 ppm) werden immer in dieser Phase beobachtet. Eine erste RP-HPLC-Analyse der rohen Mischung wird auf Fig. 4 (für dU BPU TP (4)), wobei der Hauptpeak (R t = 30,78 min) dem 5'-Triphosphat, während das Hauptnebenprodukt, das 5 '-diphosphat, zeigt eine etwas geringere Retentionszeit (R t = 30,03 min). Schließlich, nach einer gründlichen RP-HPLC-Reinigung, muss das modifizierte dNTP durch NMR-und MALDI-TOF (Fig. 5) gekennzeichnet ist. Sowohl die 1 H-NMR und 31 P-NMR-Spektren sind von entscheidender Bedeutung für die Beurteilung der Reinheit der modifizierten dNTPs, da die Anwesenheit von unerwünschten Di-und Monophosphaten gibt Scheidungssignale.

Nach der Gründung der Reinheit der Nukleoside analogen und Beurteilung der Konzentration der Stammlösung entweder mit Masse oder durch UV-Spektroskopie kann das modifizierte dNTP in Primerverlängerungsreaktionen, um dessen Substrataufnahmekapazität durch verschiedene Polymerasen Beurteilung verwendet werden. Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse der Primerverlängerungsreaktionen dU t P TP (2), dA Hs TP (6) und dC Val TP (7) entweder als Einzel Modifikationen (Spuren 5-7) als Kombinationen von zwei modifizierten dNTPs (Bahnen 8-10) oder zusammen zusammen mit dem einsamen Natur dGTP (Bahn 11).

Schließlich zeigt Fig. 7 repräsentativ TdT-vermittelte Polymerisationen mit verschiedenen modifizierten dUTP-Analoga. In diesem Zusammenhang dU c P TP (1) und dU FP TP (3) sind die besten Substrate für die TdT (Spuren 1 und 4), da die Rückstand Effizienz vergleichbar oder übertreffen die des natürlichen dTTP (Bahn 6). Stattdessen dU BPU TP (4) (Spur 5) ist ein ziemlich schlechtes Substrat ist in diesem Zusammenhang, da wenig mehr polydisperse großen Oligonukleotiden beobachtet werden.

Figur 1
Fig. 1 ist. A) Ludwig-Eckstein-Ansatz für die Synthese von (Basis-) modifizierte Nucleosid-Triphosphate 39. B) Schematische Darstellung aller für die Synthese und biochemische Charakterisierung der modifizierten dNTPs vor ihrem Einsatz in Anwendungen wie SELEX erforderlichen Schritte. Klicken Sie hier zur Ansicht größeres Bild .

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2. Chemische Strukturen der modifizierten Nukleosidtriphosphate: dU c P TP (1), dU t P TP (2), dU FP TP (3) dU BPU TP (4) dU B TP (5), 18 dA Hs TP ( 6) und dC Val TP (7) 13. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 3
3. 31 P-NMR-Spektrum (121 0,4 MHz, D 2 O) des rohen Reaktionsgemisches von dU BPU TP (4). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 4
4. RP-HPLC-Profil von Roh-dU BPU TP (4): 0-100% Laufmittel B in 40 min, Durchflussrate: 3,5 ml / min (Laufmittel A: 50 mM TEAB in H 2 O; Laufmittel B: 50 mM TEAB in H 2 O / CH 3 CN (1/1)). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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5. Charakterisierung der modifizierten Nukleosidtriphosphat dU B TP (5): A) 31 P-NMR-Spektrum (121,4 MHz, D 2 O, 128 Scans) 18 B) 1 H-NMR-Spektrum (300 MHz, D 2 O, 128 Scans ). C) MALDI-TOF-Spektrum Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 6
6. Bild repräsentative Gel (PAGE 15%) der Primer-Verlängerungsreaktionen mit verschiedenen Basis modifizierten dNTP-Analoga Spur 1:. Primer; Spur 2: natürliche dNTPs ohne dUTP; Spur 3: natürliche dNTPs ohne dATP; Spur 4: natürliche dNTPs ohne dCTP; Spur 5: dU <em> t P TP (2); Spur 6: dA Hs TP (6); Spur 7: DC Val TP (7); Spur 8: dA Hs TP (6) und dU t P TP (2); Bahn 9: dA Hs TP (6) und dC Val TP (7); Spur 10: dU t P TP (2) und dC Val TP (7); Spur 11: dU t P TP (2), dA Hs TP (6) und dC Val TP (7); Spur 12:. natürlichen dNTPs Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Fig. 7
Abbildung 7. Bild Gel (PAGE 20%) der TdT Polymerisationsreaktionen mit verschiedenen Basis modifizierte dUTP-Analoga Spur 1:. DU c P TP (1); Spur 2: dU t P TP (2); Spur 3: dU Bs TP (5); Spur 4: dU FP TP (3); Spur 5: dU BPU TP (4); Spur 6: dTTP; Spur 7: Grundierung. Konzentrationen:. 10 uM, 25 uM, 50 uM, 75 uM und 100 uM Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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Discussion

Die Einbeziehung von Änderungen in Nukleinsäuren ist von Interesse für viele praktische Anwendungen, einschließlich der Entwicklung von Antisense-und Antigen-Mittel 42,43, Kennzeichnung und Funktions Tagging von Oligonukleotiden 41 und bei den Bemühungen um die genetische Alphabet 44-46 ausbauen. Die chemischen Änderungen und Funktionsgruppen werden in der Regel durch die Anwendung von Standard-und automatisierte Festphasensynthese Protokolle in Nukleinsäuren eingeführt. Allerdings müssen die Phosphoramidit-Bausteinen robust zu den eher rauen Bedingungen mit dieser Methode, die wiederum legt eine starke Einschränkung auf die Art der chemischen Funktionalität 47 auferlegt werden. Stattdessen kann der Enzym-vermittelte Polymerisation modifizierte Nukleosidtriphosphate für die Einführung eines breiteren Spektrums von Funktionalitäten, da die einzige Einschränkung ist, dass sie als Substrate für Polymerasen 1,2 handeln. Auch wenn es einen spürbaren Mangel an generally Methodik anwendbar, zuverlässig und robust synthetischen und analytischen Methoden zur Synthese von modifizierten dNTPs entwickelt. Darüber hinaus aufgrund ihrer Natur modifizierte Triphosphate sind sehr empfindlich auf unterschiedliche äußere Bedingungen (zB pH-Wert, Temperatur) und damit ist ein detailliertes Protokoll für ihre Synthese und Charakterisierung von großem Nutzen.

Die hier dargestellten Arbeitsablauf beinhaltet die chemische Synthese von modifizierten dNTPs, RP-HPLC-Reinigung, NMR-Analyse und Enzymassays für die biochemische Charakterisierung dieser Nukleosidanaloga. Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Synthese und Charakterisierung modifizierter dNTPs sind die Analyse des Rohproduktes (NMR), die gründliche HPLC-Reinigung, die Analyse des gereinigten Materials, und die Wahl eines geeigneten DNA (RNA)-Polymerase.

Für die Synthese der modifizierten dNTPs verwendeten wir den von Ludwig und Eck-Methode,Stein 39, da weniger Nebenprodukte gebildet werden, im Vergleich zu anderen Verfahren, wenn auch auf Kosten eines etwas längeren Syntheseweg. Ferner die RP-HPLC-Reinigung stellt sicherlich die Schwenkstufe des gesamten Syntheseweg, da es zur Trennung der Nukleosiddiphosphate (dNDPs), die häufig stark hemmen DNA und RNA-Polymerasen, 48 zu ermöglichen. Nach Erreichen der Synthese und Reinigung, die Reinheit des resultierenden Triphosphat muss sowohl durch NMR-und MALDI-TOF bewertet, um sicherzustellen, daß keine Hemmung der Polymerase-Diphosphat vorliegt.

Die in Fig. 6 gezeigte Inkorporationstest unterstreicht deutlich die Brauchbarkeit dieses Ansatzes. Tatsächlich alle der in diesem repräsentativen Beispiel verwendeten dNTPs zeigen gute Substrate für die DNA-Polymerase (in diesem besonderen Fall Vent (exo -)), da nicht schneller laufen Bändern entsprechend kleinere Fragmente beobachtet werden. BesIden, verträgt das Enzym zwei Substrate mit Carbonsäurereste (dU t P TP (3) und dC Val TP (7)) und die Polymerisation der beiden dNTPs Ergebnisse in einer Oligonukleotid-Lager nicht weniger als 39 weitere negative Ladungen geschmückt. Ein weiteres auffälliges Merkmal ist, dass die Bands aus dem Einbau von modifizierten dNTPs resultierenden oft langsamer elektrophoretische Mobilität zeigen als die natürlichen Kontrollen (vgl. zB Bahnen 11 und 12). Somit Primerverlängerungsreaktionen sind ein leistungsfähigen und einfachen Weg, um die Substratakzeptanz modifizierter dNTPs beurteilen.

Darüber hinaus ist die TdT-vermittelte Polymerisation von Triphosphate auf das 3'-Termini der einzelsträngigen Oligonukleotide ein anziehendes Strategie für die Erzeugung von hoch funktionalisierten Nukleinsäuren 49-52. Die in Fig. 7 gezeigten repräsentativen Beispiel zeigt deutlich das Verfahren für Selekting die Funktionalitäten, die durch die Co 2 +-abhängigen TdT 53 toleriert werden. Tatsächlich dU c P TP (1) und dU FP TP (3), die mit der proteinogenen Aminosäure L-Prolin und das Dipeptid ausgestattet sind α-Phe-Pro, jeweils die besten Substrate für die TdT und verursachte Tailing Effizienz, die positiv auf die unmodifizierten dTTP Steuer vergleichen, selbst bei so niedrigen Konzentrationen wie 10 uM (Spuren 1 und 4). Überraschenderweise analogen dU t P TP (2), wo die Prolin-Rest an den Linker Arm in trans Vergleich zu der freien Carbonsäure verbunden ist, ist nicht so gut ein Substrat als cis Gegen seit mehr polydisperse große Oligonukleotide sind nur bei höheren beobachtet dNTP-Konzentrationen (> 100 uM, Spur 2). Darüber hinaus ist der Sulfonamid-modifizierten dNTP 5 eine moderate Substrat für TdT und vergleichbar mit dU t P TP (2) (Spur 3). Zusätzlich dU BPU TP (4), die eine starke Wasserstoffbrücken-spend Motiv trägt, ist ein ziemlich schlechtes Substrat für TdT und die Polymerisationsreaktion scheint indifferent zu der Konzentration des modifizierten dNTP sein. So kann die folgende Reihenfolge der Substratakzeptanz aus 7 ausgelegt werden: dU c P TP (1), dU FP TP (3)> dU t P TP (2), dU Bs TP (5)> dU BPU TP (4 ).

Schließlich ist die für Polymerisationsreaktionen unter PCR-Bedingungen unter Verwendung der modifizierten Analoga beschriebenen Verfahren recht ähnlich, daß mit natürlichen dNTPs. Jedoch ist die Verträglichkeit der modifizierten dNTPs mit Polymerase unter diesen Bedingungen von entscheidender Bedeutung für die Erzeugung von High-Density-Funktionalitätenzed Nukleinsäuren 7, insbesondere im Hinblick auf ihre Verwendung in in vitro Selektionsexperimente.

Zusammenfassend wurde die Methode für die Synthese und Charakterisierung von modifizierten Nucleosidtriphosphaten betont und die Einrichtung eines solchen Protokolls wird sicherlich in der Entwicklung und Crafting neuartiger Analoga helfen. Gleichzeitig wird das Auftreten eines solchen neuartigen dNTPs die Erzeugung von funktionalisierten Oligonucleotiden zu erleichtern; Insbesondere katalytische Nucleinsäuren.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den Schweizerischen Nationalfonds (Grants Nr. PZ00P2_126430 / 1 und PZ00P2_144595) unterstützt. Prof. C. Leumann ist dankbar für die Bereitstellung der Laborflächen und Geräte, sowie für seine ständige Unterstützung. Frau Sue Knecht ist für fruchtbare Diskussionen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
Dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
γ-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo-) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Chemie Heft 86 Nukleinsäure-Analoga Bioorganische Chemie PCR Primer-Extension-Reaktionen der organischen Synthese PAGE HPLC Nucleosidtriphosphaten
Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung
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Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).

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