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Chemistry

Nucleósidos Trifosfatos - De la síntesis a la Caracterización bioquímica

Published: April 3, 2014 doi: 10.3791/51385
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

Summary

El protocolo descrito en el presente documento tiene como objetivo explicar y limite los numerosos obstáculos en el camino de la ruta intrincada que conduce a trifosfatos de nucleósidos modificados. En consecuencia, este protocolo facilita tanto la síntesis de estos bloques de construcción activados y su disponibilidad para las aplicaciones prácticas.

Abstract

La estrategia tradicional para la introducción de funcionalidades químicas es el uso de la síntesis en fase sólida añadiendo precursores de fosforamidita adecuadamente modificados a la cadena naciente. Sin embargo, las condiciones utilizadas durante la síntesis y la restricción de las secuencias más cortas dificultan la aplicación de esta metodología. Por otro lado, trifosfatos de nucleósidos modificados son bloques de construcción que se han empleado para la introducción suave de numerosos grupos funcionales en los ácidos nucleicos, una estrategia que allana el camino para el uso de ácidos nucleicos modificados en una gama de colores amplia de aplicaciones prácticas activan tales como etiquetado funcional y generación de ribozimas y ADNzimas. Uno de los principales desafíos reside en la complejidad de la metodología que conduce al aislamiento y caracterización de estos análogos de nucleósidos.

En este artículo de vídeo, se presenta un protocolo detallado para la síntesis de these análogos modificados utilizando fósforo reactivos (III) con sede en. Además, el procedimiento para su caracterización bioquímica es divulgada, con un énfasis especial en las reacciones de extensión de cebador y polimerización del tizón TdT. Este protocolo detallado será de utilidad para la elaboración de dNTPs modificados y su uso posterior en la biología química.

Introduction

Trifosfatos de nucleósidos 5'-((d) PNT) representan una clase de biomoléculas vitales que están implicadas en incontables procesos y funciones que van desde ser la moneda universal de energía a los reguladores del metabolismo celular. Además de su papel en estas transformaciones biológicas fundamentales, sus homólogos modificados han avanzado como una plataforma versátil y suave para la introducción de grupos funcionales en oligonucleótidos, una metodología que complementa muy bien la síntesis en fase sólida automatizada que por lo general se aplica 1,2. De hecho, siempre que las (d) los PNT pueden actuar como sustratos para ARN y ADN polimerasas 3, una gran cantidad de grupos funcionales que incluyen aminoácidos 4-13, ácidos bórico 14,15, nornbornene 16, residuos diamondoid-17, como parte de las cadenas de organocatálisis 18, los ácidos biliares 19, e incluso oligonucleótidos 20 se puede introducir en oligonucleótidos.

_content "> Más allá de lo que representa un vector conveniente para la funcionalización de los ácidos nucleicos, dNTPs modificados pueden acoplarse en SELEX y otros métodos combinatorios relacionados de selección in vitro para la generación de ácidos nucleicos catalíticos modificados 21-30 y aptámeros para diversas aplicaciones prácticas 10, 31-36. Las cadenas laterales adicionales que se introducen por la polimerización de los dNTPs modificados se cree que aumentar el espacio químico que puede ser explorado durante un experimento de selección y complementar el bien pobre arsenal funcional de ácidos nucleicos 37. Sin embargo, a pesar de estos rasgos atractivos y los recientes progresos realizados en el desarrollo de tanto sintéticos como los métodos de análisis, universalmente aplicable y el procedimiento de alto rendimiento existe para la elaboración de nucleósidos trifosfato modificados 2,38.

El objetivo del presente protocolo es arrojar luz en la (a veces) los procedimientos intrincados líder to la síntesis y caracterización bioquímica de estos bloques de construcción activados (Figura 1B). Se hará especial hincapié en todos los detalles sintéticos que a menudo son difíciles de encontrar o están ausentes en tramos experimentales, pero que son, pero crucial para el buen fin de la ruta sintética que conduce al aislamiento de (d) los PNT puros (Figura 1).

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Protocol

1. Síntesis de los trifosfatos de nucleósido modificado

El enfoque sintético elegido sigue el procedimiento desarrollado por Ludwig y Eckstein ya que este método es generalmente fiable y conduce a muy pocos subproductos secundarios (Figura 1A) 39.

  1. Coevaporate el nucleósido protegido adecuadamente-3'-OAc (típicamente 0,1 mmol) dos veces con piridina anhidra (2 ml) y después se seca a vacío durante la noche. Al mismo tiempo, pirofosfato de tributilamonio seca (0,13 mmol) bajo vacío durante la noche.
  2. Se disuelve el nucleósido en un mínimo de piridina seca (0,2 ml) y añadir dioxano seco (0,4 ml) como codisolvente. Por último, añadir 2-cloro-1, 3,2-benzodioxaphosphorin-4-ona (0,11 mmoles) y dejar reaccionar a temperatura ambiente durante 45 min.
    Nota: Es de destacar que en particular se debe tener cuidado con la 2-cloro-1, 3,2-benzodioxaphosphorin-4-ona reactivo. De hecho, incluso el almacenamiento de este reactivo en virtud de un ambi gas inerteaquí no es suficiente para evitar su descomposición. Por lo tanto, el sólido blanco que se forma en esta descomposición puede y debe ser levantada antes de su uso.
  3. Preparar una solución de pirofosfato de tributilamonio en DMF seca (0,17 ml) y tributilamina recién destilado (58 l; nunca añadir tamices moleculares). Añadir la solución resultante a la mezcla de reacción (un precipitado blanco aparece pero desaparece rápidamente) y dejar reaccionar a temperatura ambiente durante 45 min.
  4. Preparar una solución de yodo (0,16 mmol) en piridina (0,98 ml) y H2O (20 l) y añadir a la mezcla de reacción con el fin de oxidar el Pα (III) central. Deje que la solución oscura resultante en agitación a temperatura ambiente durante 30 min.
  5. Utilice una solución acuosa al 10% de NaS 2 O 3 para inactivar el exceso de I 2. Eliminar el disolvente en vacío (la temperatura del baño de agua del evaporador rotatorio debe mantenerse por debajo de 30 ° C). Añadir H 2 O (5 ml) y permitir que el millasxture en reposo a temperatura ambiente durante 30 min para hidrolizar el resto trifosfato cíclico.
  6. En esta etapa, los grupos protectores se eliminan normalmente (es decir, el 3'-OAc y los grupos en las cadenas laterales de la nucleobase). En consecuencia, añadir NH4OH (30% en H2O, 10 ml) a la crudo y se agita durante 1,5 horas a temperatura ambiente, y eliminar el disolvente bajo vacío.
  7. Añadir 2 ml de H 2 O y se dividió en 2 tubos. Añadir 12 ml de una solución 2% de NaClO 4 en acetona y se centrifuga (1.000 xg) durante 30 min. Este procedimiento se repitió una vez más. Esta precipitación permite la separación de los disolventes y reactivos utilizados en la síntesis de la trifosfato (que precipitará), simplificando de este modo la subsiguiente purificación por RP-HPLC sustancialmente.
  8. Después de aire de secado del residuo aceitoso, grabar un espectro de RMN P-31 de la crudo (siguiendo procedimientos estándar, ver también Lista de Materiales y Figura 3) ydisolver en 4 ml de H2O
    Nota: Este procedimiento de síntesis se centra principalmente en la generación de trifosfatos de desoxinucleósidos modificados, pero un procedimiento muy similar se puede aplicar para sus contrapartes de ARN (por el simple uso de 2 ', 3'-bis-O-acetilado precursores).

2. Purificación por HPLC de los trifosfatos de nucleósido modificado

  1. Preparación de una solución 1 M de stock de bicarbonato de trietilamonio (TEAB): 40
    1. Preparar una solución de 1 mol de trietilamina (139 ml) en ≈ 600 ml de agua destilada y se filtró H 2 O.
    2. Burbuja de CO 2 (a través de hielo seco y un burbujeador de gas) en la solución con agitación vigorosa hasta que se alcanza un pH de 7,6 (esto llevará al menos 10 horas). Esta solución madre se puede almacenar en el refrigerador hasta por un mes.
  2. Purificación:
    1. Prepare dos soluciones tampón de la acción 1 M: 2 L de 50 mM TEAB en agua ultrapura (eluyente A) unND 1 L de 50 mM de TEAB en 50% de MeCN (eluyente B). Degas ambos eluyentes bajo vacío y agitación durante 20 min (se requiere una cuidadosa atención a fin de no alterar el pH mediante la eliminación de CO 2 durante la desgasificación).
    2. Preparar una muestra analítica por disolución de 10 l de la trifosfato de crudo en 300 l de H 2 O destilada y se inyecta en un sistema de HPLC equipado con una columna RP semi-preparativa (C18) y usando un gradiente que varía de 0-100% de B en 40 min (Figura 4). Ajuste el programa de HPLC de acuerdo con el Rt del trifosfato (que normalmente es el pico principal en el cromatograma) y el difosfato (que tiene un R ligeramente inferior t). Se purifica la mezcla bruta mediante estas condiciones y removiendo primeras fracciones que puedan contener algunos difosfato.
    3. Combinar todas las fracciones que contienen el producto y liofilizar (que se prefiere a la evaporación en el evaporador rotatorio con el fin de minimizar la hidrólisis a la diphosph no deseadaate). Coevaporate varias veces con agua ultrapura (para eliminar trietilamina remanente de los eluyentes). Evaluar la pureza del trifosfato por RMN (tanto 1 H y 31 P RMN) y MALDI-TOF por la aplicación de los protocolos estándar (ver Figura 5). Los rendimientos típicos obtenidos mediante la aplicación de este protocolo típicamente se encuentran en el intervalo de 30-70%, dependiendo del sustrato.

3. Primer extensión reacciones y TdT polimerización

  1. Etiquetado extremo 5 'del cebador
    1. Mezclar 30 pmol del cebador apropiado (por ejemplo P1, Lista de Materiales) con 4 l de 10x polinucleótido quinasa tampón (PNK), 3 l de γ-[32 P]-ATP, 1 l de PNK, y ddH2O (por un volumen de reacción total de 40 l). Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 30 min y después de calor-desactivar la quinasa (10 min a 70 ° C).
    2. Durante la reacción de marcaje prepararuna columna de Sephadex G-10 conectando una punta de pipeta de 1 ml con lana de vidrio silanizada y llenando la punta con una solución de G-10 (10% en ddH2O, en autoclave). Decantar y lavar tres veces con 500 l ddH 2 O y un lavado final con 50 l ddH 2 O. Ejecute la mezcla de reacción a través del G-10 (para eliminar el marcador radioactivo gratis).
    3. Gel de purificar (PAGE 20%) el cebador radiomarcado y recuperarse mediante la aplicación de la aglomeración y remojo método (es decir, la elución con 500 l de una solución acuosa que contiene 1% LiClO 4 y 1 mM de NEt3 (pH 8) a 72 ° C durante 15 min). El etanol y el precipitado G10 desalar el oligonucleótido eluido.
  2. Reacción de extensión del cebador
    1. Recocido 1 pmol de cebador radiomarcado P1, 10 pmol de cebador P1, y 10 pmol de plantilla T1 (Lista de Materiales) en tampón de reacción 10x (suministrado por el proveedor de la polimerasa para ser utilizado) mediante la colocación de la tUbe en (90-95 ° C) de agua caliente y al permitir que se enfríe gradualmente hasta la temperatura ambiente (durante 45 min).
    2. Poner el tubo en hielo y añadir (a su vez) el cóctel de dNTP (que contiene tanto el modificado y los trifosfatos naturales, 100 mM concentración final) y 1 U de la ADN polimerasa (Vent (exo -), de Klenow, de Pwo o 9 ° N m) y completar con agua (para un volumen total de reacción de 20 l). Incubar a la temperatura de trabajo óptima de la enzima (por ejemplo, 60 ° C durante 30 min cuando Vent (exo - se está utilizando)).
    3. Añadir 20 l de solución de parada (formamida (70%), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; 50 mM), azul de bromofenol (0,1%), cianol xileno (0,1%)), calentar las muestras (95 º C, 5 min), fresco hacia abajo (0 ° C), y resolver por electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida. Visualizar phosphorimager.
  3. Polimerización TdT
    1. Diluir 7 pmol de una sola hebra, Cebador P2 sin marcar (Lista de Materiales), 1 pmol de cebador radiomarcado en 1 l de tampón TdT 10x.
    2. Poner el tubo en hielo y añadir (a su vez) el cóctel de dNTP (a una concentración adecuada comprendida entre 10 y 200 mM) y la TDT de la polimerasa (4 U). Incubar a 37 ° C durante 1 hora. Añadir 10 l de la solución de parada, calentar las muestras (95 ° C, 5 min), enfriamiento (0 º C), y resolver mediante la desnaturalización electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE 15%). Visualizar phosphorimager.

4. PCR con trifosfatos de nucleósidos modificados

  1. Mezclar 8 pmol de tanto la cebadores directo e inverso con 0,5 pmol de la plantilla a amplificar. Añadir 10x tampón de reacción y el cóctel de dNTP (para una concentración final 200 mM) y poner el tubo en hielo. Añadir 1 U de la ADN polimerasa y completa con H 2 O para llegar a un volumen final de 20 l. Transferir la mezcla a un vial de PCR y llevar a cabo 30 ciclos de PCR.
  2. Diluir 6 l con 6 l de tampón de carga 2x sacarosa y resolver por agarosa al 2% (teñido con bromuro de etidio) electroforesis. Visualizar phosphorimager.

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Representative Results

Trifosfatos de nucleósidos modificados son atractivos objetivos sintéticos ya que permiten la introducción fácil de una gran variedad de grupos funcionales en los ácidos nucleicos 41. Sin embargo, el aislamiento y la caracterización de estos bloques de construcción activados es frecuentemente revelado a ser ardua. En consecuencia, se cree que los resultados que se muestran en este documento para ofrecer una mano de ayuda para seguir los diferentes pasos dentro de los procedimientos sintéticos y bioquímicas antes mencionadas (Figura 1B).

En particular, la figura 3 muestra un típico espectro crudo 31 P-RMN de un dNTP modificado (en este caso particular, dU Bpu TP (4) 18, Figura 2), donde se pueden observar las señales características de los centros de fósforo (es decir, una doblete a -5,02 (P γ), un doblete a -10,44 (P α), y un triplete a -20,55 (P β) ppm). Además, signals derivados para el difosfato (dos dobletes a -4,84 y -10,63 ppm) y monofosfato (singlete a -0,18 ppm) productos secundarios, junto con fosfatos superiores (señales a -21,02 y -23,19 ppm) siempre se observan en esta etapa. Un primer análisis de RP-HPLC de la mezcla en bruto se muestra en la Figura 4 (de Du Bpu TP (4)) en el que el pico principal (Rt = 30,78 min) corresponde a la 5'-trifosfato, mientras que el principal subproducto, el 5 '-difosfato, muestra un tiempo de retención ligeramente inferior (R t = 30,03 min). Finalmente, después de una purificación por RP-HPLC a fondo, el dNTP modificado necesita ser caracterizado por RMN y MALDI-TOF (Figura 5). Tanto el 1-H NMR y 31 P-espectros de RMN son cruciales para evaluar la pureza de los dNTPs modificados, ya que la presencia de no deseados di-y mono-fosfatos da señales distintivas.

Después de establecer la pureza de los núcleosanálogo de IDE y la evaluación de la concentración de la solución madre ya sea en masa o en-espectroscopía UV, el dNTP modificado se puede utilizar en reacciones de extensión de cebador con el fin de evaluar su capacidad de aceptación de sustrato por diversas polimerasas. La Figura 6 ilustra el resultado de las reacciones de extensión de cebador con dU t P TP (2), dA Hs TP (6), y dC Val TP (7) utilizan ya sea como modificaciones solitarios (carriles 5-7), como combinaciones de dos dNTPs modificados (carriles 8-10), o en conjunto junto con el dGTP naturales solitario (calle 11).

Finalmente, la Figura 7 muestra las reacciones de polimerización mediada por TdT representativos con diferentes análogos de dUTP modificados. En este contexto, dU C P TP (1) y DU FP TP (3) son los mejores sustratos para la TdT (carriles 1 y 4), ya que las eficiencias del tizón son comparables o superiores a los de la dTTP naturales (carril 6). En lugar de ello, dU Bpu TP (4) (carril 5) es un sustrato bastante pobre en este contexto ya que poco polidispersos oligonucleótidos más largos de tamaño pueden ser observados.

Figura 1
Figura 1. A) enfoque Ludwig-Eckstein para la síntesis de (base) modificó nucleósidos trifosfato 39. B) Representación esquemática de todos los pasos necesarios para la síntesis y caracterización bioquímica de dNTPs modificados antes de su uso en aplicaciones tales como SELEX. Haz clic aquí para ver la Ampliar imagen .

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Figura 2. Las estructuras químicas de los nucleósidos trifosfato modificados: dU c P TP (1), dU t P TP (2), dU FP TP (3), dU Bpu TP (4), dU Bs TP (5), 18 dA Hs TP ( 6), y dC Val TP (7) 13. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 3
Figura 3. 31 espectro de P-RMN (121 0,4 MHz, D2O) de la mezcla de reacción bruta de dU Bpu TP (4). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Figura 4
Figura 4. Perfil RP-HPLC del crudo dU Bpu TP (4): 3.5 ml / min (eluyente A: 0-100% de eluyente B en 40 min, caudal mM TEAB 50 en H 2 O; eluyente B: 50 mM TEAB en H 2 O / CH 3 CN (1/1)). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Figura 5. Caracterización del trifosfato de nucleósido modificado dU B TP (5): A) espectro de 31 P-RMN (121,4 MHz, D2O, 128 exploraciones); 18 B) 1 H-RMN espectro (300 MHz, D2O, 128 exploraciones );. C) Espectro de MALDI-TOF Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

La figura 6
Figura 6. Imagen de gel de Representante (PÁGINA 15%) de las reacciones de extensión de cebador con diversos análogos de dNTP base modificada Carril 1:. De cebadores; carril 2: dNTPs naturales sin dUTP; carril 3: dNTPs naturales sin dATP; carril 4: dNTPs naturales sin dCTP; carril 5: dU <em> t P TP (2); carril 6: dA Hs TP (6); carril 7: dC Val TP (7); carril 8: dA Hs TP (6) y dU t P TP (2); carril 9: dA Hs TP (6) y dC Val TP (7); carril 10: DU t P TP (2) y dC Val TP (7); carril 11: DU t P TP (2), dA Hs TP (6), y dC Val TP (7); carril 12:. dNTPs naturales clic aquí para ver la imagen más grande .

La figura 7
Figura 7. La imagen del gel (PAGE 20%) de las reacciones de polimerización TdT con diversos análogos de base modificada dUTP Carril 1:. DU C P TP (1); carril 2: dU t P TP (2); carril 3: dU B TP (5); carril 4: dU FP TP (3); carril 5: dU Bpu TP (4); carril 6: dTTP; carril 7: imprimación. Concentraciones:. 10 M, 25 m, 50 m, 75 m, y 100 M Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

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Discussion

La inclusión de las modificaciones en los ácidos nucleicos es de interés para numerosas aplicaciones prácticas, incluyendo el desarrollo de agentes antisentido y antigenes 42,43, el etiquetado y el marcado funcional de oligonucleótidos 41, y en los esfuerzos para ampliar el alfabeto genético 44-46. Las alteraciones químicas y grupos funcionales son por lo general introducidos en ácidos nucleicos mediante la aplicación de protocolos de síntesis en fase sólida estándar y automatizados. Sin embargo, los bloques de construcción de fosforamidita deben ser resistentes a las condiciones más duras impuestas por esta metodología, que a su vez impone una restricción severa en la naturaleza de la funcionalidad química 47. En lugar de ello, la polimerización mediada por enzima de trifosfatos de nucleósidos modificados permite la introducción de una gama más amplia de funcionalidades, ya que la única restricción es que actúan como sustratos para las polimerasas de 1,2. A pesar de que existe una notable falta de generaciónmetodología ralmente aplicable, sintético fiable y robusto y metodologías analíticas se han desarrollado para la síntesis de dNTPs modificados. Por otra parte, debido a su naturaleza inherente, trifosfatos modificados son bastante sensibles a diferentes condiciones externas (por ejemplo, pH, temperatura) y por lo tanto, un protocolo detallado para su síntesis y caracterización es altamente beneficioso.

El flujo de trabajo presentado en este documento incluye la síntesis química de dNTPs modificados, purificación por RP-HPLC, análisis de RMN, y ensayos enzimáticos para la caracterización bioquímica de estos análogos de nucleósidos. Los pasos más críticos para una síntesis exitosa y caracterización de dNTPs modificados son el análisis del producto en bruto (por RMN), la purificación por HPLC a fondo, el análisis del material purificado, y la elección de un (ARN) de la polimerasa de ADN apropiada.

Para la síntesis de los dNTPs modificados se aplicó el método desarrollado por Ludwig y EckStein 39, desde menos subproductos se forman en comparación con otros procedimientos, aunque a expensas de una ruta ligeramente más largo sintético. Además, la purificación por RP-HPLC sin duda representa el paso crucial de toda la vía de síntesis, ya que permitirá la separación de los difosfatos de nucleósidos (dNDPs) que a menudo inhiben fuertemente ADN y ARN polimerasas 48. Después de alcanzar la síntesis y purificación, la pureza de la trifosfato resultante necesita ser evaluado tanto por RMN y MALDI-TOF para garantizar que no difosfato polimerasa de inhibición está presente.

El ensayo de incorporación se muestra en la Figura 6 pone de relieve claramente la utilidad de este enfoque. De hecho, todos los dNTP empleadas en este ejemplo representativo revelan para ser buenos sustratos para la ADN polimerasa (en este caso particular Vent (exo -)), ya que no más rápido bandas correspondientes a fragmentos más pequeños pudieron observarse en funcionamiento. Besidus, la enzima tolera dos sustratos adornados con residuos de ácidos carboxílicos (Du t P TP (3) y dC Val TP (7)) y la polimerización de los dos dNTPs resultados en un oligonucleótido cojinete no menos de 39 cargas negativas adicionales. Otra característica notable es que las bandas resultantes de la incorporación de dNTPs modificados a menudo muestran movilidades electroforéticas más lento que los controles naturales (por ejemplo, comparar los carriles 11 y 12). Por lo tanto, las reacciones de extensión de cebador representan una forma poderosa y sencilla para evaluar la aceptación de sustrato de dNTPs modificados.

Por otra parte, la polimerización mediada por TdT de trifosfatos en el 3'-terminales de oligonucleótidos de cadena simple es una estrategia atractiva para la generación de ácidos nucleicos altamente funcionalizados 49-52. El ejemplo representativo se muestra en la Figura 7 demuestra claramente el procedimiento para selectinag las funcionalidades que son tolerados por el Co 2 +-dependiente TdT 53. De hecho, dU c P TP (1) y dU FP TP (3), que están equipados con el aminoácido L-prolina proteinogénico y el dipéptido-α Phe-Pro, respectivamente, son los mejores sustratos para la TDT y dieron lugar a tizón de la eficiencia que se comparan favorablemente con el control sin modificar dTTP, incluso a concentraciones tan bajas como 10 mM (carriles 1 y 4). Sorprendentemente, análogo dU t P TP (2) en el que el residuo de prolina está conectado al brazo de enlace en trans en comparación con el ácido carboxílico libre, no es un sustrato tan bueno como su homólogo cis desde oligonucleótidos polidispersa ya de tamaño sólo se observan en mayor concentraciones de dNTP (> 100 m, carril 2). Además, el dNTP modificado sulfonamida-5 es un sustrato moderado para TdT y comparable a dU T P TP (2) (carril 3). Además, dU Bpu TP (4), que tiene un gran motivo de enlaces de hidrógeno donar, es más bien un mal sustrato para la TdT y la reacción de polimerización parece ser indiferente a la concentración de dNTP modificado. Por lo tanto, el siguiente orden de aceptación sustrato puede interpretarse a partir de la Figura 7: dU C P TP (1), dU FP TP (3)> dU t P TP (2), dU B TP (5)> dU Bpu TP (4 ).

Por último, el procedimiento descrito para las reacciones de polimerización bajo condiciones de PCR usando los análogos modificados es bastante similar a la participación de los dNTP naturales. Sin embargo, la compatibilidad de dNTPs modificados con polimerasas en estas condiciones es de importancia crucial para la generación de func alta densidadácidos nucleicos zed 7, especialmente con respecto a su uso en los experimentos in vitro de selección.

En resumen, el método para la síntesis y caracterización de nucleósidos trifosfato modificados se destacó y el establecimiento de un protocolo de este tipo sin duda ayudará en el desarrollo y elaboración de nuevos análogos. Al mismo tiempo, la aparición de tales nuevos dNTPs facilitará la generación de oligonucleótidos funcionalizados; en particular, los ácidos nucleicos catalíticos.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (Becas n ° PZ00P2_126430 / 1 y PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann se agradece para proporcionar el espacio y equipo de laboratorio, así como por su constante apoyo. La Sra. Sue Knecht se reconoce para un debate fructífero.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
Dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
γ-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo-) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).

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