Summary
Il protocollo qui descritto ha lo scopo di spiegare e abbreviare i numerosi ostacoli nel cammino del percorso intricato portando a nucleosidi trifosfati modificati. Di conseguenza, questo protocollo facilita sia la sintesi di questi blocchi di costruzione attivati e la loro disponibilità per applicazioni pratiche.
Abstract
La strategia tradizionale per l'introduzione di funzionalità chimiche è l'uso di sintesi in fase solida aggiungendo precursori Phosphoramidite opportunamente modificati alla catena nascente. Tuttavia, le condizioni utilizzate durante la sintesi e la restrizione di sequenze piuttosto brevi ostacolano l'applicabilità di questa metodologia. D'altra parte, nucleosidi trifosfati modificati vengono attivati blocchi che sono stati impiegati per l'introduzione mite di numerosi gruppi funzionali in acidi nucleici, una strategia che apre la strada per l'uso di acidi nucleici modificati in una tavolozza ampia di applicazioni pratiche come codifica funzionale e generazione di ribozimi e DNAzymes. Una delle maggiori difficoltà risiede nella complessità della metodologia che porta all'isolamento e caratterizzazione di questi analoghi nucleosidici.
In questo articolo video, presentiamo un protocollo dettagliato per la sintesi di these analoghi modificati utilizzando reagenti a base di fosforo-(III). Inoltre, la procedura per la loro caratterizzazione biochimica di divulgazione, con particolare attenzione alle reazioni del primer e TdT tailing polimerizzazione. Questo protocollo dettagliato sarà di uso per la lavorazione di dNTP modificati e il loro ulteriore utilizzo in biologia chimica.
Introduction
5'-trifosfato (nucleosidi (d) PTR) rappresentano una classe di biomolecole vitali che sono coinvolti in innumerevoli processi e funzioni che vanno dall'essere la valuta universale di energia regolatori del metabolismo cellulare. Oltre al loro ruolo in queste trasformazioni biologiche fondamentali, loro omologhi modificati hanno avanzato come piattaforma versatile e delicato per l'introduzione di gruppi funzionali in oligonucleotidi, una metodologia che integra piacevolmente la sintesi in fase solida automatizzata che viene solitamente applicato 1,2. Infatti, a condizione che i (d) PTR possono agire come substrati per RNA e DNA polimerasi 3, una ricchezza di gruppi funzionali, tra cui aminoacidi, acidi 4-13 boronici 14,15, nornbornene 16, residui diamondoide-17, come catene laterali per organocatalisi 18, acidi biliari 19, e anche oligonucleotidi 20 può essere introdotto in oligonucleotidi.
_content "> Oltre che rappresenta una comoda vettoriale per la funzionalizzazione di acidi nucleici, dNTPs modificati possono essere impegnati in SELEX e altri metodi combinatori correlate di selezione in vitro per la generazione di modificati acidi nucleici catalitici 21-30 e aptameri per varie applicazioni pratiche 10, 31-36. Le ulteriori catene laterali che vengono introdotti dalla polimerizzazione dei dNTP modificati sono pensati per aumentare lo spazio chimico che può essere esplorato durante un esperimento di selezione e integrare l'arsenale funzionale piuttosto povera di acidi nucleici 37. Tuttavia, nonostante questi tratti interessanti e recenti progressi nello sviluppo sia di sintesi e di analisi, universalmente applicabile e alla procedura ad alto rendimento esiste per la lavorazione di modificati trifosfati nucleosidici 2,38.L'obiettivo del presente protocollo è quello di far luce nel (a volte) le procedure intricate leader to la sintesi e caratterizzazione biochimica di questi blocchi attivati (Figura 1B). Sarà data particolare enfasi su tutti i dettagli sintetici che spesso sono difficili da trovare o sono assenti nelle sezioni sperimentali, ma sono ancora cruciali per il buon esito del percorso di sintesi che porta all'isolamento di puri (d) PTR (Figura 1).
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Protocol
1. Sintesi dei nucleosidi trifosfati modificati
L'approccio sintetico prescelto segue la procedura sviluppata da Ludwig e Eckstein poiché questo metodo è generalmente affidabile e porta a pochissimi collaterali prodotti (Figura 1A) 39.
- Coevaporate nucleoside 3'-OAc protetto adeguatamente (tipicamente 0,1 mmol) due volte con piridina anidra (2 ml) e quindi asciugare sotto vuoto durante la notte. Allo stesso tempo, pirofosfato secco tributylammonium (0,13 mmol) sottovuoto durante la notte.
- Sciogliere il nucleoside in un minimo di piridina secca (0,2 ml) e aggiungere diossano secco (0,4 ml) come co-solvente. Infine, aggiungere 2-cloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one (0,11 mmol) e lasciare reagire a temperatura ambiente per 45 min.
Nota: È interessante notare che particolare cura deve essere presa con il 2-cloro-1 ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one reagente. Infatti, anche stoccaggio di questo reagente sotto un atmosp gas inertequi non è sufficiente per evitare la decomposizione. Così, il solido bianco che si forma in questa decomposizione può e deve essere raschiata prima dell'uso. - Preparare una soluzione di tributylammonium pirofosfato a secco DMF (0,17 ml) e tributilammina distillata (58 ml; mai aggiungere setacci molecolari). Aggiungere la soluzione risultante alla miscela di reazione (un precipitato bianco ma scompare rapidamente) e lasciare reagire a temperatura ambiente per 45 min.
- Preparare una soluzione di iodio (0,16 mmol) in piridina (0,98 ml) e H 2 O (20 mL) e aggiungere alla miscela di reazione per ossidare il Pα (III) centro. Lasciare la soluzione scura risultante agitazione a temperatura ambiente per 30 min.
- Utilizzare una soluzione acquosa al 10% NAS 2 O 3 per placare l'eccesso I 2. Rimuovere il solvente sotto vuoto (temperatura del bagno d'acqua dell'evaporatore rotante deve essere mantenuta al di sotto di 30 ° C). Aggiungere H 2 O (5 ml) e consentire l'kmxture riposare a temperatura ambiente per 30 min per idrolizzare il trifosfato parte ciclica.
- In questa fase, i gruppi di protezione vengono solitamente rimossi (cioè il 3'-OAc ei gruppi delle catene laterali del nucleobase). Conseguentemente, aggiungere NH 4 OH (30% in H 2 O, 10 ml) al grezzo e mescolare per 1,5 ore a temperatura ambiente, e rimuovere il solvente sotto vuoto.
- Aggiungere 2 ml di H 2 O e suddivisa in 2 tubi. Aggiungere 12 ml di una soluzione al 2% di NaClO 4 in acetone e centrifuga (1000 xg) per 30 min. Questa procedura viene ripetuta ancora una volta. Questa precipitazione consente la separazione dei solventi e reagenti utilizzati nella sintesi del trifosfato (che precipitare), semplificando così la conseguente purificazione con RP-HPLC sostanzialmente.
- Dopo l'essiccazione all'aria del residuo oleoso, registrare un 31 P-NMR spettro del grezzo (seguendo le procedure standard, vedere anche elenco dei materiali e figura 3) esciogliere in 4 ml di H 2 O.
Nota: Questa procedura sintetica concentra principalmente sulla generazione di deossinucleoside trifosfati modificati, ma una procedura molto simile può essere applicato per i loro omologhi RNA (semplicemente utilizzando 2 ', 3'-bis-O-acetilato precursori).
2. HPLC purificazione dei nucleosidi trifosfati modificati
- Preparazione di una M soluzione stock di trietilammonio bicarbonato (Teab) 1: 40
- Preparare una soluzione di 1 mole di trietilammina (139 ml) in ≈ 600 ml di acqua distillata e filtrata H 2 O.
- Bubble CO 2 (tramite ghiaccio secco e un gorgogliatore gas) nella soluzione sotto agitazione vigorosa fino a raggiungere un pH di 7,6 (questo richiederà almeno 10 ore). Questa soluzione madre può essere conservato in frigorifero per fino a un mese.
- Purificazione:
- Preparare due soluzioni tampone dal magazzino 1 M: 2 L di 50 Teab mM in acqua ultrapura (eluente A)nd 1 L di 50 mM in Teab 50% MeCN (eluente B). Degas due eluenti sottovuoto e agitazione per 20 min (attenzione è richiesta al fine di non alterare il pH rimuovendo CO 2 durante degasaggio).
- Preparare un campione da analizzare sciogliendo 10 ml di trifosfato grezzo in 300 ml di H 2 O distillata e iniettare in un sistema HPLC con una colonna RP semi-preparativa (C18) e con pendenza che varia da 0-100% B in 40 min (Figura 4). Regolare il programma HPLC con R t del trifosfato (che di solito è il picco principale sul cromatogramma) e il difosfato (che ha una leggermente inferiore R t). Purificare la miscela grezza utilizzando tali condizioni e rimuovendo prime frazioni che potrebbero contenere qualche difosfato.
- Combinare tutte le frazioni che contengono il prodotto e la liofilizzazione (che viene preferito evaporazione nell'evaporatore rotante al fine di minimizzare l'idrolisi alla diphosph indesideratoate). Coevaporate più volte con acqua ultrapura (per rimuovere trietilammina residuo dalle eluenti). Valutare la purezza del trifosfato mediante NMR (sia 1 H e 31 P NMR) e MALDI-TOF applicando protocolli standard (vedere la Figura 5). Le rese ottenute mediante l'applicazione di questo protocollo tipicamente si trovano nell'intervallo 30-70%, a seconda del substrato.
3. Reazioni primer extension e TdT polimerizzazione
- Etichettatura 5'-end del primer
- Mescolare 30 pmol di primer appropriato (ad esempio P1, elenco dei materiali) con 4 ml di 10x Polinucleotide chinasi (PNK) tampone, 3 ml di γ-[32 P]-ATP, 1 ml di PNK, e DDH 2 O (per un volume di reazione totale di 40 microlitri). Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 30 min e poi termicamente disattivare la chinasi (10 min a 70 ° C).
- Durante la reazione di marcatura preparareuna colonna Sephadex G10 inserendo una punta della pipetta da 1 ml con lana di vetro silanizzata e riempiendo la punta con la soluzione G10 (10% in DDH 2 O, autoclave). Spin down e lavare tre volte con 500 microlitri DDH 2 O e un lavaggio finale con 50 microlitri DDH 2 O. Eseguire la miscela di reazione attraverso il G10 (per rimuovere l'etichetta radioattivo gratuito).
- Gel purificare (PAGE 20%) il primer radiomarcato e recuperare mediante l'applicazione del metodo di compressione e ammollo (cioè eluizione con 500 ml di una soluzione acquosa contenente 1% LiClO 4 e 1 mM rete 3 (pH 8) a 72 ° C per 15 min). Etanolo precipitato e G10 desalt l'oligonucleotide eluito.
- Reazione di primer extension
- Anneal 1 pmol di innesco radiomarcato P1, 10 pmol di primer P1, e 10 pmol di modello T1 (elenco dei materiali) in tampone di reazione 10x (fornito dal fornitore della polimerasi da utilizzare) posizionando il tUbe a (90-95 ° C) acqua calda e consentendo di raffreddare gradualmente fino a temperatura ambiente (oltre 45 min).
- Mettere la provetta in ghiaccio e aggiungere (a sua volta) cocktail dNTP (contenenti sia modificato e trifosfati naturali, 100 pM concentrazione finale) e 1 U di DNA polimerasi (Vent (exo -), Klenow, Pwo o 9 ° N m) e terminare con acqua (per un volume totale di reazione di 20 microlitri). Incubare alla temperatura ottimale di lavoro dell'enzima (ad esempio 60 ° C per 30 min quando Vent (Exo - viene utilizzato)).
- Aggiungere 20 ml di soluzione di arresto (formammide (70%), etilendiamminotetraacetico (EDTA, 50 mm), blu di bromofenolo (0,1%), xilene cyanol (0,1%)), riscaldare i campioni (95 ° C, 5 min), fresco verso il basso (0 ° C), e risolvere da denaturazione elettroforesi su gel di poliacrilammide. Visualizza da phosphorimager.
- TdT polimerizzazione
- Diluire 7 pmol di singolo filamento, Senza etichetta Primer P2 (Elenco dei materiali), 1 pmol di primer radioattivo in 1 microlitri di buffer TdT 10x.
- Mettere la provetta in ghiaccio e aggiungere (a sua volta) il cocktail dNTP (ad un'adeguata concentrazione compresa tra 10 e 200 mM) e la polimerasi TdT (4 U). Incubare a 37 ° C per 1 ora. Aggiungere 10 ml di soluzione di stop, riscaldare i campioni (95 ° C, 5 min), raffreddare (0 ° C), e risolvere da denaturazione elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE 15%). Visualizza da phosphorimager.
4. PCR con modificati nucleosidi trifosfati
- Mescolare 8 pmol sia del forward e reverse primer con 0,5 pmol del modello da amplificare. Aggiungere 10x tampone di reazione e il cocktail dNTP (per una concentrazione finale di 200 mM) e mettere la provetta in ghiaccio. Aggiungere 1 U di DNA polimerasi e completo di H 2 O a raggiungere un volume finale di 20 microlitri. Trasferire il composto in una provetta per PCR e di effettuare 30 cicli di PCR.
- Diluire 6 ml con 6 ml di 2x tampone di caricamento saccarosio e risolvere per via di agarosio 2% (colorati con bromuro di etidio) elettroforesi. Visualizza da phosphorimager.
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Representative Results
Nucleosidi trifosfati modificati sono seducenti bersagli sintetici in quanto consentono l'introduzione facile di una vasta gamma di gruppi funzionali in acidi nucleici 41. Tuttavia, l'isolamento e la caratterizzazione di questi blocchi attivato viene rivelano spesso ardua. Di conseguenza, i risultati qui indicati sono pensati per fornire una mano per seguire le varie fasi all'interno delle suddette procedure sintetiche e biochimici (Figura 1B).
In particolare, la figura 3 mostra una tipica grezzo 31 P-NMR di un dNTP modificato (in questo caso particolare, dU Bpu TP (4) 18, Figura 2), dove si possono osservare i segnali caratteristici dei centri fosforo (cioè un doppione a -5.02 (P γ), un doppietto a -10,44 (P α), e un tripletto a -20,55 (P β) ppm). Inoltre, signals derivanti per il difosfato (due doppiette a -4,84 e -10,63 ppm) e monofosfato (singoletto a -0,18 ppm) collaterali prodotti con fosfati superiori (segnali a -21,02 e -23,19 ppm) sono sempre osservati in questa fase. Una prima analisi RP-HPLC della miscela grezza è mostrato in Figura 4 (Du Bpu TP (4)), dove il picco principale (R t = 30,78 min) corrisponde al 5'-trifosfato, mentre il sottoprodotto principale, il 5 '-difosfato, visualizza un tempo di ritenzione leggermente inferiore (R t = 30.03 min). Infine, dopo una accurata purificazione con RP-HPLC, il dNTP modificato deve essere caratterizzato tramite NMR e MALDI-TOF (Figura 5). Sia il 1 H-NMR e 31 P-NMR spectra sono cruciali per valutare la purezza dei dNTP modificati, poiché la presenza di indesiderati di-e mono-fosfati dà segnali distintivi.
Dopo aver stabilito la purezza delle nucleosanalogica ide e valutazione della concentrazione della soluzione madre sia in massa o in spettroscopia UV, la dNTP modificata può essere utilizzato in reazioni di estensione di primer per valutare la capacità substrato accettazione da vari polimerasi. figura 6 illustra il risultato di reazioni di estensione del primer con dU t P TP (2), dA Hs (6) TP, e dC Val TP (7) utilizzati sia come modifiche solitari (corsie 5-7), come combinazione di due dNTP modificati (corsie 8-10), o insieme insieme al dGTP naturale lone (corsia 11).
Infine, la Figura 7 mostra reazioni di polimerizzazione TdT-mediati rappresentativi con diversi analoghi dUTP modificati. In questo contesto, dU c P TP (1) e Du FP TP (3) sono i migliori substrati per TdT (corsie 1 e 4), in quanto le efficienze di decantazione sono confrontabili o superiori a quelle della dTTP naturale (corsia 6). Invece, dU Bpu TP (4) (corsia 5) è piuttosto scarsa substrato in questo contesto, dal piccolo polidispersi oligonucleotidi a più dimensioni possono essere osservati.
Figura 1. A) approccio Ludwig-Eckstein per la sintesi di (base) modificate trifosfati nucleosidici 39. B) Rappresentazione schematica di tutti i passi necessari per la sintesi e la caratterizzazione biochimica di dNTP modificati prima del loro utilizzo in applicazioni quali SELEX. Clicca qui per vedere ingrandisci .
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Figura 2. Strutture chimiche dei nucleosidi trifosfati modificati: DU c P TP (1), dU t P TP (2), dU FP TP (3), dU Bpu TP (4), dU Breakfast TP (5), 18 dA Hs TP ( 6), e DC Val TP (7) 13. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Spettro 31 P-NMR (121 0,4 MHz, D 2 O) della miscela di reazione grezza di dU Bpu TP (4). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Profilo RP-HPLC di greggio dU Bpu TP (4): 0-100% eluente B in 40 min, portata: 3,5 ml / min (eluente A: 50 mM Teab in H 2 O; eluente B: Teab 50 mM in H 2 O / CH 3 CN (1/1)). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Figura 5. Caratterizzazione del nucleoside trifosfato modificato dU B TP (5): A) spettro 31 P-NMR (121,4 MHz, D 2 O, 128 scansioni); 18 B) 1 H-NMR (300 MHz, D 2 O, 128 scansioni ). C) spettro MALDI-TOF Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 6. Immagine gel Rappresentante (PAGE 15%) di reazioni di estensione di primer con varie basi modificato dNTP analoghi corsia 1:. Inneschi; corsia 2: dNTP naturali senza dUTP; corsia 3: dNTP naturali senza dATP; corsia 4: dNTP naturali senza dCTP; corsia 5: dU <em> t P TP (2); corsia 6: dA Hs TP (6); corsia 7: dC Val TP (7); corsia 8: dA Hs TP (6) e Du t P TP (2); lane 9: dA Hs TP (6) e dC Val TP (7); lane 10: dU t P TP (2) e dC Val TP (7); lane 11: dU t P TP (2), dA Hs (6) TP, e dC Val TP (7); lane 12:. dNTP naturali Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 7. Immagine Gel (PAGE 20%) delle reazioni di polimerizzazione TdT con varie basi modificate analoghi dUTP Corsia 1:. DU c P TP (1); corsia 2: dU t P TP (2); corsia 3: dU B TP (5); corsia 4: dU FP TP (3); corsia 5: dU Bpu TP (4); corsia 6: dTTP; corsia 7: primer. Concentrazioni: 10. Pm, 25 pm, 50 pm, 75 pm, e 100 micron Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
L'inclusione di modifiche in acidi nucleici è di interesse per numerose applicazioni pratiche, tra cui lo sviluppo di agenti antisenso e antigene 42,43, l'etichettatura e tagging funzionale di oligonucleotidi 41, e negli sforzi per espandere l'alfabeto genetico 44-46. Le alterazioni chimiche e gruppi funzionali sono generalmente introdotti in acidi nucleici mediante l'applicazione di protocolli di sintesi in fase solida standard e automatizzati. Tuttavia, i mattoni Phosphoramidite devono essere resistente alle condizioni piuttosto rigide imposte da questa metodologia, che a sua volta impone una rigorosa restrizione sulla natura della funzionalità chimica 47. Invece, la polimerizzazione enzimatica di nucleosidi trifosfati modificati consente l'introduzione di una più ampia gamma di funzionalità, in quanto l'unica limitazione è che agiscono come substrati per polimerasi 1,2. Anche se vi è una notevole mancanza di genmetodologia ralmente applicabile, sintetico affidabile e robusta e metodologie analitiche sono state sviluppate per la sintesi dei dNTP modificati. Inoltre, a causa della loro natura intrinseca, trifosfati modificati sono piuttosto sensibili alle diverse condizioni esterne (ad esempio, pH, temperatura) e quindi, un protocollo dettagliato per la loro sintesi e caratterizzazione è estremamente utile.
Il flusso di lavoro qui presentata comprende la sintesi chimica dei dNTP modificati, purificazione con RP-HPLC, NMR, e saggi enzimatici per la caratterizzazione biochimica di questi analoghi nucleosidici. Le fasi più critiche per una riuscita sintesi e caratterizzazione dei dNTP modificati sono l'analisi del prodotto grezzo (da NMR), la purificazione HPLC approfondita, l'analisi del materiale purificato, e la scelta di un appropriato DNA (RNA) polimerasi.
Per la sintesi dei dNTP modificati abbiamo applicato il metodo sviluppato da Ludwig e EckStein 39, poiché meno sottoprodotti sono formate rispetto ad altre procedure, anche se a scapito di un percorso leggermente più lungo sintetico. Inoltre, la purificazione con RP-HPLC rappresenta certamente la fase cruciale dell'intero percorso sintetico quanto consentirà la separazione dei difosfati nucleosidici (dNDPs) che spesso inibiscono fortemente DNA e RNA polimerasi 48. Dopo aver raggiunto la sintesi e la purificazione, la purezza del trifosfato risultante deve essere valutata sia mediante NMR e MALDI-TOF per garantire che non-polimerasi inibendo difosfato è presente.
Il saggio di incorporazione illustrato nella Figura 6 evidenzia chiaramente l'utilità di questo approccio. Infatti, tutti i dNTP impiegate in questo esempio rappresentativo rivelano essere buoni substrati per la DNA polimerasi (in questo caso particolare Vent (exo -)), in quanto non più veloce esecuzione potrebbero essere osservate bande corrispondenti a frammenti più piccoli. Besidi, l'enzima tollera due substrati ornate con residui di acido carbossilico (dU t P TP (3) e dC Val TP (7)) e la polimerizzazione di entrambi i dNTP risultati in un oligonucleotide cuscinetto non inferiore a 39 ulteriori cariche negative. Un'altra caratteristica che colpisce è che le bande risultanti dalla incorporazione di dNTP modificati spesso mostrano mobilità lenta elettroforetici rispetto ai controlli naturali (confrontare ad esempio corsie 11 e 12). Così, le reazioni di estensione dei primer rappresentano un modo potente e tuttavia semplice per valutare l'accettazione substrato dNTP modificati.
Inoltre, la polimerizzazione TdT-mediata trifosfati sul 3'-terminali di oligonucleotidi a singolo filamento è una strategia allettante per la generazione di acidi nucleici altamente funzionalizzati 49-52. L'esempio rappresentativo illustrato nella Figura 7 dimostra chiaramente la procedura per selectinag le funzionalità che vengono tollerati dal Co 2 +-dipendente TdT 53. Infatti, dU c P TP (1) e Du FP TP (3), che sono equipaggiati con il proteinogenici aminoacido L-prolina e il dipeptide α-Phe-Pro, rispettivamente, sono i migliori substrati per la TdT e hanno dato luogo a tailing efficienze che confrontano favorevolmente al controllo non modificato dTTP, anche a concentrazioni basse quanto 10 micron (corsie 1 e 4). Sorprendentemente, analogo dU t P TP (2) dove il residuo di prolina è collegato al braccio linker in trans rispetto ad acido carbossilico libero, non è un buon substrato come la sua controparte cis da oligonucleotidi polydisperse più dimensioni vengono osservati solo a più alto Le concentrazioni dNTP (> 100 micron, corsia 2). Inoltre, il dNTP sulfonamide modificato 5 è un substrato moderato per TdT e paragonabile a dU
Infine, la procedura descritta per reazioni di polimerizzazione in condizioni di PCR utilizzando gli analoghi modificati è piuttosto simile a quello che riguardava dNTPs naturali. Tuttavia, la compatibilità dei dNTP modificati con polimerasi in queste condizioni è di importanza cruciale per la generazione di functionali alta densitàacidi nucleici zed 7, in particolare per quanto riguarda il loro uso in vitro esperimenti di selezione in.
In sintesi, il metodo per la sintesi e la caratterizzazione di nucleosidi trifosfati modificati stato sottolineato e la creazione di un tale protocollo sarà certamente di aiuto nello sviluppo e nella lavorazione di nuovi analoghi. Allo stesso tempo, l'insorgere di tali nuovi dNTP faciliterà la generazione di oligonucleotidi funzionalizzati; particolare, acidi nucleici catalitici.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (Grants n ° PZ00P2_126430 / 1 e PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann Si ringrazia per la fornitura di spazi e attrezzature di laboratorio, nonché per il suo costante sostegno. La signora Sue Knecht è riconosciuto per le discussioni fruttuose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| γ-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo-) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1 |
|||
| 5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1 |
|||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F |
|||
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