Summary
הפרוטוקול המתואר במסמך זה נועד להסביר ולקצר מספר רב של מכשולים בדרכו של המסלול המורכב המוביל לtriphosphates נוקלאוזידים שונה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר גם לסינתזה של אבני הבניין הופעל אלה וזמינותם ליישומים מעשיים.
Abstract
האסטרטגיה המסורתית להקדמה של פונקציות כימיות היא השימוש בסינתזה מוצק שלב על ידי צירוף מבשרי phosphoramidite הותאמו כראוי לרשת המתהווה. עם זאת, תנאי שימוש במהלך הסינתזה וההגבלה לרצפים קצרים ולא לעכב את תחולתה של מתודולוגיה זו. מצד השני, triphosphates נוקלאוזידים שונה מופעלים אבני בניין שכבר מועסק להקדמה קלה של קבוצות פונקציונליות רבות לחומצות גרעין, אסטרטגיה שסוללת את הדרך לשימוש בחומצות גרעין שונה בפלטה רחבה של יישומים מעשיים כגון תיוג ודור תפקודיים של ribozymes וDNAzymes. אחד האתגרים הגדולים מתגורר במורכבות של המתודולוגיה שמוביל לבידוד והאפיון של אנלוגים נוקלאוזידים אלה.
במאמר זה וידאו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינתזה של thesדואר שונה אנלוגים באמצעות זרחן ריאגנטים מבוסס (III). בנוסף, ההליך לאפיון ביוכימי שלהם הוא חשף, עם דגש מיוחד על תגובות הארכה תחל ופילמור עוקב TdT. פרוטוקול מפורט זה יהיה שימוש לצורפות של dNTPs שונה והשימוש נוסף שלהם בביולוגיה כימית.
Introduction
triphosphates 5'-נוקלאוזידים ((ד) NTPs) מייצג סוג של ביומולקולות חיונית כי הם מעורבים בתהליכים אינספור פונקציות הנעים מלהיות המטבע האוניברסלי של אנרגיה לרגולטורים של חילוף חומרים בתא. בנוסף לתפקידם בשינויים הביולוגיים הבסיסיים אלה, עמיתים השונים קידמו כפלטפורמה תכליתית וקלה לכניסתה של קבוצות פונקציונליות לoligonucleotides, המתודולוגיה שיפה משלימה את הסינתזה מוצק שלב האוטומטי המיושמת בדרך כלל 1,2. ואכן, בתנאי NTPs (ד) יכול לפעול כמצעים לpolymerases RNA ו-DNA 3, עושר של קבוצות פונקציונליות כוללים חומצות אמינו 4-13, חומצות boronic 14,15, nornbornene 16, שאריות כמו diamondoid 17, תופעות שרשרות ל organocatalysis 18, חומצות מרה 19, ואפילו oligonucleotides 20 יכול להיות מוחדר oligonucleotides.
_content "> מעבר לייצוג וקטור נוח לfunctionalization של חומצות גרעין, יכול להיות מעורב dNTPs שונה בSelex ושיטות אחרות הקשורים קומבינטורית של בחירה במבחנה לייצור חומצות גרעין שונה קטליטי 21-30 וaptamers ליישומים מעשיים שונים 10, 31-36. צד רשתות נוספות שהוצגו על ידי פילמור של dNTPs שונה הם חשבו להגדיל את השטח הכימי שניתן לחקור בניסוי בחירה ולהשלים את הארסנל התפקודי עני למדי של חומצות גרעין 37. עם זאת, למרות אלה תכונות אטרקטיביות וההתקדמות האחרונה שנעשתה בפיתוחם של שני סינטטי ושיטות אנליטיות, לא ישימה באופן אוניברסלי והליך תשואה גבוהה קיימים לצורפות של triphosphates נוקלאוזידים הותאם 2,38.מטרת הפרוטוקול נוכחי זה היא לשפוך אור לתוך (לפעמים) לא מובילים הליכים מורכביםo הסינתזה והאפיון ביוכימי של אבני הבניין הופעל אלה (איור 1). דגש מיוחד יינתן על כל הפרטים סינטטיים שלעתים קרובות קשים למצוא או נעדרים בסעיפי ניסיוני, אבל הם עדיין חיוניים להשלמה המוצלחת של המסלול הסינתטי שהובילה לבידודה של NTPs הטהור (ד) (איור 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה של triphosphates נוקלאוזידים השתנה
הגישה סינתטית נבחרה להלן השיטה שפותחה על ידי לודוויג ואקשטיין מאחר ושיטה זו היא בדרך כלל אמינה ומובילה למעט מאוד תופעות לוואי (איור 1 א) 39.
- Coevaporate נוקלאוזידים המוגן 3'-OAC כראוי (בדרך כלל 0.1 מילימול) פעמיים עם פירידין נטול מים (2 מיליליטר) ולאחר מכן יבש תחת ואקום הלילה. במקביל, pyrophosphate היבש tributylammonium (0.13 מילימול) תחת ואקום הלילה.
- ממיסים את נוקלאוזידים במינימום של פירידין היבש (0.2 מיליליטר) ולהוסיף dioxane היבש (0.4 מיליליטר) כcosolvent. לבסוף, להוסיף 2-כלורו-1-,3,2 benzodioxaphosphorin-4-אחד (0.11 מילימול) ומאפשר להגיב בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות.
הערה: ראוי לציין כי טיפול מסוים צריך לקחת עם המגיב ,3,2-benzodioxaphosphorin-4-2-אחד כלורו-1. ואכן, גם אחסון של המגיב הזה, לפי atmosp גז אינרטיכאן הוא לא מספיק כדי למנוע הפירוק שלה. לפיכך, אפשר וצריך לגרד הלבן מוצקים שנוצר בפירוק זה לפני השימוש. - הכן פתרון של pyrophosphate tributylammonium בDMF היבש (0.17 מיליליטר) וtributylamine טרי מזוקק (58 μl; לא להוסיף מסננות מולקולריות). מוסיף את הפתרון שהתקבל לתערובת התגובה (משקע לבן מופיע אבל מהר נעלם) ומאפשר להגיב בטמפרטורת חדר למשך 45 דקות.
- הכן פתרון של יוד (0.16 מילימול) בפירידין (0.98 מיליליטר) ו-H 2 O (20 μl) ולהוסיף לתערובת התגובה על מנת לחמצן Pα (שלישי) במרכז. אפשר הפתרון הכהה שנוצר כדי לעורר בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות.
- השתמש בתמיסה מימית 10% מNAS 2 O 3 כדי להרוות את עודפי 2. הסר את הממס תחת ואקום (הטמפרטורה של אמבט המים של המאייד הסיבובי חייבת להישמר מתחת 30 מעלות צלזיוס). הוספת H 2 O (5 מיליליטר) ולאפשר למילxture לעמוד בטמפרטורת חדר במשך 30 דקות לhydrolyze מחצית אדנוזין המחזורי.
- בשלב זה, קבוצות הגנת מוסרים בדרך כלל (כלומר, 3'-OAC והקבוצות ברשתות בצד של Nucleobase). כתוצאה מכך, להוסיף 4 OH NH (30% H 2 O, 10 מיליליטר) לגולמי ומערבבים ל1.5 שעות בטמפרטורת חדר, ולהסיר את הממס תחת ואקום.
- הוסף 2 מיליליטר של H 2 O ופיצול ל 2 צינורות. הוספת 12 מיליליטר של פתרון 2% מ4 NaClO באצטון וצנטריפוגה (1,000 XG) במשך 30 דקות. הליך זה חוזר על עצמו עוד פעם אחת. משקעים זה מאפשר את ההפרדה של הממסים וחומרים כימיים המשמשים בסינתזה מאדנוזין (שיזרז), ובכך לפשט את טיהור RP-HPLC שהתפתח באופן משמעותי.
- אחרי אוויר ייבוש של השאריות שומניות, להקליט ספקטרום P-NMR יום 31 של גולמי (בעקבות הליכים סטנדרטיים, ראה גם רשימה של חומרים ואיור 3) ולפזר ב4 מיליליטר H 2 O.
הערה: הליך סינטטי זה מתמקד בעיקר בדור של triphosphates deoxynucleoside שונה, אבל הליך דומה מאוד יכול להיות מיושם לעמיתי RNA שלהם (פשוט על ידי שימוש 2 ', 3'-BIS-acetylated O מבשרים).
2. טיהור HPLC של triphosphates נוקלאוזידים השתנה
- הכנת פתרון M מניית 1 של יקרבונט triethylammonium (TEAB): 40
- הכן פתרון של שומה 1 של triethylamine (139 מיליליטר) ב≈ 600 מיליליטר של H 2 O. מזוקק והמסונן
- בועת CO 2 (באמצעות קרח יבש וbubbler גז) לתוך התמיסה תחת ערבוב נמרץ, עד pH של 7.6 הוא הגיע (זה ייקח לפחות 10 hr). פתרון מניות זה ניתן לאחסן במקרר לתקופה של עד חודש אחד.
- טיהור:
- הכן שני פתרונות חיץ ממניות 1 M: 2 L של 50 מ"מ TEAB במי ultrapure (eluent)nd 1 ליטר של 50 מ"מ TEAB ב50% MeCN (eluent ב '). דגה גם eluents תחת ואקום וערבוב במשך 20 דקות (נדרש תשומת לב קפדנית על מנת שלא לשנות את רמת החומציות על ידי הסרת ה-CO 2 במהלך degassing).
- הכן מדגם אנליטית על ידי המסת 10 μl של אדנוזין הגולמי ב300 μl מזוקק H 2 O ולהזריק לתוך מערכת HPLC מצוידת בעמודה למחצה preparative RP (C18) ובאמצעות שיפוע החל 0-100% B ב40 דקות (איור 4). התאם את תכנית HPLC לפי t R של אדנוזין (שהיא בדרך כלל השיא העיקרי בהכרומתוגרמה) ודיפוספט (שבה יש לא R מעט נמוך יותר). לטהר את התערובת גולמי באמצעות תנאים אלה ועל ידי הסרת שברים מוקדמים שעשויים להכיל כמה דיפוספט.
- מערבבים את כל השברים המכילים את המוצר ולהקפיא יבשים (שהוא העדיף אידוי על המאייד הסיבובי על מנת למזער הידרוליזה לdiphosph לא רצויאכלתי). Coevaporate מספר פעמים עם המים ultrapure (כדי להסיר triethylamine שריד מeluents). להעריך את הטוהר של אדנוזין ידי תמ"ג (שני H 1 וNMR 31 בP) וMALDI-TOF על ידי יישום של פרוטוקולים סטנדרטיים (ראה איור 5). תשואות אופייניות מתקבלות על ידי יישום של פרוטוקול זה בדרך כלל לשקר בטווח של 30-70%, בהתאם למצע.
3. תגובות הארכת פריימר ופלמור TdT
- תיוג סוף 5'-של פריימר
- מערבבים 30 pmol של פריימר המתאים (למשל P1, רשימה של חומרים) עם 4 μl של 10x קינאז Polynucleotide חיץ (PNK), 3 μl של γ-[P 32]-ATP, μl 1 של PNK, וDDH 2 O (עבור בסך הכל תגובת נפח 40 μl). דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן חום לבטל את קינאז (10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס).
- במהלך תגובת התיוג להכיןעמודת G10 Sephadex ידי חיבור קצה פיפטה 1 מיליליטר עם צמר זכוכית silanized וממלא את הקצה עם פתרון G10 (10% בDDH 2 O, autoclaved). ספין למטה לשטוף שלוש פעמים עם 500 μl DDH 2 O ולשטוף סופיים אחד עם DDH μl 50 2 O. הפעל את תערובת התגובה דרך G10 (כדי להסיר את תווית רדיואקטיבית חינם).
- ג'ל לטהר (עמוד 20%) פריימר radiolabeled ולשחזר על ידי יישום של ההתאהבות ולספוג שיטה (elution כלומר עם 500 μl של תמיסה מימית המכילה 1% LiClO 4 ו 1 מ"מ נטה 3 (pH 8) בשעה 72 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות). משקע אתנול וG10 desalt oligonucleotide eluted.
- תגובת הארכת פריימר
- לחשל 1 pmol של P1 פריימר radiolabeled, 10 P1 פריימר pmol, ו10 pmol של T1 תבנית (רשימה של חומרים) בחיץ 10x תגובה (המסופק על ידי הספק של פולימראז לשמש) על ידי הצבת tאופה ב( 90-95 מעלות צלזיוס) מים חמים ועל ידי מתן אפשרות להתקרר בהדרגה לטמפרטורת חדר (מעל 45 דקות).
- שים את הצינור על קרח ולהוסיף (בתורו) קוקטייל dNTP (המכיל גם שונה וtriphosphates הטבעי, 100 מיקרומטר ריכוז סופי) ו1 U של DNA פולימרז (Vent (Exo -), Klenow, PWO או 9 ° N מ ') ולהשלים עם מים (על סך נפח תגובה של 20 μl). דגירה בטמפרטורה האופטימלית העבודה של האנזים (למשל 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כאשר Vent (Exo -) נמצא בשימוש).
- הוסף 20 μl של להפסיק פתרון (פוראמיד (70%), חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA; 50 מ"מ), bromophenol הכחול (0.1%), cyanol קסילן (0.1%)), לחמם את הדגימות (95 ° C, 5 דקות), מגניב למטה (0 מעלות צלזיוס), וליישב בdenaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide. דמיין ידי Phosphorimager.
- פילמור TdT
- לדלל 7 pmol של אחד גדילים, P2 פריימר ללא תווית (רשימת החומרים), pmol 1 של פריימר radiolabeled במאגר TdT μl 1 10x.
- שים את הצינור על קרח ולהוסיף (בתורו) קוקטייל dNTP (בריכוז נאות המורכב בין 10 200 מיקרומטר) ופולימראז TdT (4 U). לדגור על C ° 37 במשך שעה 1. הוסף 10 μl של להפסיק פתרון, לחמם את הדגימות (95 ° C, 5 דקות), להתקרר (0 מעלות צלזיוס), וליישב בdenaturing ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד 15%). דמיין ידי Phosphorimager.
4. PCR עם triphosphates נוקלאוזידים השתנה
- מערבבים 8 pmol של שני קדימה לאחור פריימרים עם 0.5 pmol של התבנית להיות מוגבר. הוספת 10x חיץ תגובה וקוקטייל dNTP (לצורך ריכוז סופי 200 מיקרומטר) ולשים את הצינור על קרח. הוסף 1 U של פולימראז ה-DNA ולהשלים עם H 2 O להגיע נפח סופי של μl 20. מעביר את התערובת לתוך בקבוקון PCR ולבצע 30 מחזורי ה-PCR.
- לדלל 6 μl עם 6 μl של חיץ טעינת סוכרוז 2x ולפתור על ידי 2% agarose (מוכתם ברומיד ethidium) אלקטרופורזה. דמיין ידי Phosphorimager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
triphosphates נוקלאוזידים שינוי הינו מפתים מטרות סינתטיות שכן הם מאפשרים להקדמה הקלילה של מגוון רחב של קבוצות פונקציונליות לחומצות גרעין 41. עם זאת, הבידוד והאפיון של אבני הבניין הופעל אלה מתגלים לעתים קרובות להיות מפרכים. כתוצאה מכך, התוצאות הראו במסמך זה נחשבות לספק יד מסייעת לבצע את השלבים השונים בתהליכים ביוכימיים סינטטיים והאמורים (איור 1).
בפרט, איור 3 מציג ספקטרום אופייני יום 31 הגולמי P-NMR של dNTP שונה (במקרה הספציפי הזה, DU BPU TP (4) 18, איור 2), שבו האותות האופייניים למרכזי זרחן ניתן לצפות (כלומר כפיל ב-5.02 (γ P), כפיל ב-10.44 (α P), ושלישייה ב-20.55 עמודים לדקה (β P)). בנוסף, signals נובע לדיפוספט (שתי כפילויות ב-4.84 ו-10.63 עמודים לדקה) וmonophosphate (גופייה ב-0.18 עמודים לדקה) תופעות מוצרים יחד עם פוספטים גבוהים יותר (אותות ב-21.02 ו-23.19 עמודים לדקה) תמיד הם נצפו בשלב זה. ניתוח RP-HPLC ראשון של התערובת הגולמי מוצג באיור 4 (לdu BPU TP (4)) שבו השיא הראשי (t R = 30.78 דקות) מתאים ל5'-טריפוספט, בעוד תוצר הלוואי העיקרי, 5 '-דיפוספט, מציג זמן שמירה מעט נמוך יותר (t R = 30.03 דקות). לבסוף, לאחר טיהור RP-HPLC יסודי, dNTP שונה צריכה להיות מאופיינת בתמ"ג וMALDI-TOF (איור 5). שני H-NMR ו 31 בספקטרום P-NMR הוא 1 חיוניים להערכת טוהר dNTPs שונה, שכן נוכחותו של די ומונה פוספטים לא רצויים נותנת אותות ייחודיים.
לאחר הקמת טוהר nucleosאנלוגי IDE והערכת הריכוז של פתרון המניות או על ידי מסה או על ידי UV-ספקטרוסקופיה, dNTP שונה ניתן להשתמש בתגובות הארכה תחל על מנת להעריך את יכולת קבלת מצע שלה על ידי polymerases השונים. איור 6 ממחיש את התוצאה של תגובות הארכה תחל עם TP P t DU (2), דה HS (6) TP, ו DC ואל TP (7) המשמשים גם כשינויים בודדים (נתיבי 5-7), כצירוף של שני dNTPs שונה (נתיבי 8-10), או ביחד יחד עם dGTP הבודד הטבעי (מסלול 11).
לבסוף, איור 7 מראה תגובות פילמור בתיווך TdT נציג עם אנלוגים dUTP שונה שונים. בהקשר זה, TP P ג du (1) וdu FP TP (3) הם מצעים הטובים ביותר עבור TdT (מסלולי 1 ו -4) מאז היעילות עוקב ניתנת להשוואה או עולה על אלו של dTTP הטבעי (מסלול 6). במקום זאת, du BPU TP (4) (מסלול 5) הוא מצע עני למדי בהקשר זה מאז ניתן לצפות oligonucleotides יותר בגודל polydisperse הקטן.
איור 1. א) גישה לודוויג-אקשטיין לסינתזה של (בסיס) הותאם triphosphates נוקלאוזידים 39. ב ') ייצוג סכמטי של כל השלבים הנדרשים לסינתזה והאפיון ביוכימי של dNTPs שונה לפני השימוש שלהם ביישומים כגון Selex. לחץ כאן לצפייה תמונה גדולה יותר.
"עבור: תוכן width =" 5in "עבור: src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2.jpg "width =" "/> 600px
איור 2. מבנים כימיים של triphosphates נוקלאוזידים שונה: TP P ג du (1), TP P t DU (2), DU FP TP (3), DU BPU TP (4), DU Bs TP (5), 18 dA Hs TP ( 6), ו-DC ואל TP (7) 13. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. 31 בספקטרום P-NMR (121 .4 MHz, D 2 O) של תערובת התגובה הגסה של du BPU TP (4). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. פרופיל RP-HPLC של הנפט הגולמי du BPU TP (4): 0-100% eluent B ב40 דקות, קצב הזרימה: 3.5 מיליליטר / דקה (eluent: 50 מ"מ TEAB בH 2 O; eluent B: 50 מ"מ TEAB בH 2 O / CH 3 CN (1/1)). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
/ "Width =" 51385fig5.jpg "/> 600px
איור 5. אפיון אדנוזין נוקלאוזידים הותאם du Bs TP (5): א) ביום 31 בספקטרום P-NMR (MHz 121.4, D 2 O, 128 סריקות); 18 B) ספקטרום H-NMR 1 (MHz 300, D 2 O, 128 סריקות ;). C) ספקטרום MALDI-TOF לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 6. תמונת ג'ל נציג (עמוד 15%) של תגובות הארכה תחל עם אנלוגים בסיס שונה שונים dNTP 1 ליין:. פריימר; מסלול 2: dNTPs הטבעי ללא dUTP; מסלול 3: dNTPs הטבעי ללא dATP; מסלול 4: dNTPs הטבעי ללא dCTP; מסלול 5: du <em> TP P t (2); מסלול 6: Da Hs TP (6); נתיב 7: (7) DC Val TP; מסלול 8: Da Hs TP (6) וTP P t DU (2); מסלול 9: Da Hs TP (6) ו DC ואל TP (7); נתיב 10: TP P t DU (2) ו DC ואל TP (7); מסלול 11: TP P t DU (2), דה HS (6) TP, ו DC ואל TP (7); נתיב 12:. dNTPs הטבעי לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 7. תמונת ג'ל (עמוד 20%) של תגובות פילמור TdT עם אנלוגים dUTP בסיס שונה שונים 1 ליין:. TP P ג du (1); מסלול 2: TP P t DU (2); מסלול 3: du Bs TP (5); מסלול 4: du FP TP (3); מסלול 5: du BPU TP (4); מסלול 6: dTTP; נתיב 7: פריימר. ריכוזים:. 10 מיקרומטר, 25 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 75 מיקרומטר, ו100 מיקרומטר לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכללת שינויים בחומצות גרעין היא עניין של יישומים מעשיים רבים, כולל הפיתוח של סוכני antisense וantigene 42,43, תיוג ותיוג פונקציונלי של oligonucleotides 41, ובמאמצים להרחיב את האלפבית הגנטי 44-46. שינויים כימיים וקבוצות פונקציונליות בדרך כלל מוכנסים חומצות גרעין על ידי יישום של פרוטוקולי סינתזה מוצק שלב סטנדרטיים ואוטומטיים. עם זאת, אבני בניין phosphoramidite צריך להיות עמיד לתנאים הקשים למדי שהוטלו על ידי מתודולוגיה זו, אשר בתורו מטילה הגבלות חמורות על אופי פונקציונלי הכימי 47. במקום זאת, פילמור בתיווך האנזים של triphosphates נוקלאוזידים שונה מאפשר כניסתה של מגוון רחב יותר של פונקציות, שכן המגבלה היחידה היא שהם פועלים כמצעים לpolymerases 1,2. למרות שקיים מחסור בולט של דורהמתודולוגיה erally ישימה, סינטטי אמין וחזק ומתודולוגיות אנליטיות פותחו עבור הסינתזה של dNTPs שונה. יתר על כן, בשל האופי הטבוע בם, triphosphates שונה למדי רגיש לתנאים שונים חיצוניים (כגון pH, טמפרטורה) ובכך, פרוטוקול מפורט לסינתזה והאפיון שלהם הוא מאוד מועיל.
זרימת העבודה שהוצגה במסמך זה כוללת את הסינתזה הכימית של dNTPs שונה, טיהור RP-HPLC, ניתוח NMR, ומבחנים אנזימטיים לאפיון ביוכימי של אנלוגים נוקלאוזידים אלה. השלבים הקריטיים ביותר לסינתזה ואפיון מוצלחת של dNTPs שינוי הינו הניתוח של המוצר הגולמי (על ידי NMR), טיהור HPLC יסודית, הניתוח של החומר מטוהר, ובחירה של ה-DNA המתאים פולימראז (RNA).
לסינתזה של dNTPs שונה שיישמנו את השיטה שפותחה על ידי לודוויג ואק39 שטיין, שכן פחות תוצרי לוואי נוצרים בהשוואה לנהלים אחרים, גם אם על חשבון מעט יותר סינטטי מסלול. יתר על כן, טיהור RP-HPLC בהחלט מייצגת את הצעד המרכזי של המסלול הסינתטי כל שכן הוא יאפשר להפרדת diphosphates נוקלאוזידים (dNDPs) אשר לעתים קרובות מאוד מעכבת DNA ו-RNA polymerases 48. לאחר שהשיג את הסינתזה וטיהור, את הטוהר של אדנוזין וכתוצאה מכך צריך להיות מוערך הן על ידי NMR וMALDI-TOF כדי לוודא ששום דיפוספט עיכוב פולימראז הוא הווה.
Assay השילוב מוצג באיור 6 בבירור מדגיש את התועלת שבגישה זו. ואכן, כל dNTPs המועסק בדוגמא מייצגת זה חושף להיות מצעים טובים לDNA פולימרז (במקרה הספציפי הזה Vent (Exo -)) שכן אין יותר מהר בריצה הלהקות המתאימה שברים קטנים יותר יכולים להיבחן. בסאידו, האנזים סובל שני מצעים מעוטרים בשאריות חומצה קרבוקסילית (TP P t DU (3) ו DC ואל TP (7)) ופילמור של שני תוצאות dNTPs בoligonucleotide נושאת לא פחות מ 39 מטענים שליליים נוספים. מאפיין בולט נוסף הוא שהלהקות הנובעות משילוב של dNTPs שונה לעתים קרובות להציג mobilities electrophoretic איטי יותר מהפקדים הטבעיים (השווה למשל נתיבים 11 ו12). לפיכך, תגובות הארכה תחל לייצג דרך רבת עוצמה ועם זאת פשוטה כדי להעריך את קבלת המצע של dNTPs שונה.
יתר על כן, פילמור בתיווך TdT של triphosphates על 3'-Termini של oligonucleotides חד גדילים הוא אסטרטגיה מפתה עבור הדור של חומצות גרעין פונקציונליות מאוד 49-52. הדוגמא המייצגת מוצגת באיור 7 מדגימה בבירור את ההליך לselecting הפונקציות שהם נסבלים על ידי TdT Co 2 + תלוי 53. ואכן, TP P ג du (1) וdu FP TP (3), אשר מצויד L-פרולין חומצת אמינו proteinogenic ופפטיד α-Phe-Pro, בהתאמה, הם מצעים הטובים ביותר עבור TdT והוליד עוקב יעילות שלהשוות לטובה לשליטה ללא שינוי dTTP, גם בריכוזים נמוכים כמו 10 מיקרומטר (מסלולי 1 ו -4). באופן מפתיע, TP P t DU האנלוגי (2) שבו שאריות פרולין מחוברת לזרוע המקשר בטרנס בהשוואה לחומצה קרבוקסילית בחינם, הוא לא טוב כמו מצע כמו עמית cis שלה מאז oligonucleotides polydisperse יותר בגודל הם נצפו רק בגבוה יותר ריכוזי dNTP (> 100 מיקרומטר, מסלול 2). יתר על כן, dNTP-הותאם sulfonamide 5 היא מצע מתון לTdT ולהשוות du
לבסוף, ההליך המתואר עבור תגובות פילמור בתנאי PCR באמצעות אנלוגים שונה הוא די דומה לזה שהיה מעורב dNTPs הטבעי. עם זאת, את התאימות של dNTPs שונה עם polymerases בתנאים אלה היא בעלי חשיבות מכרעת עבור הדור של functionali בצפיפות גבוההחומצות גרעין zed 7, במיוחד בכל הקשור לשימוש בם בניסויים במבחנה בחירה.
לסיכום, השיטה לסינתזה והאפיון של triphosphates נוקלאוזידים שונה הודגשה והקמת פרוטוקול כזה תהיה בהחלט לעזור בפיתוח והגיבוש של אנלוגים רומן. במקביל, את הופעתה של dNTPs רומן כזה תקל על הדור של oligonucleotides פונקציונליות; במיוחד, חומצות גרעין קטליטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן השוויצרית הלאומית למדע (מענקי N ° PZ00P2_126430 / 1 וPZ00P2_144595). פרופ 'ג Leumann הוא הודה בהכרת תודה למתן חלל המעבדה וציוד, כמו גם לתמיכה המתמדת שלו. הגב 'סו Knecht הוא הודה לדיונים פוריים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| γ-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo-) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1 |
|||
| 5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1 |
|||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F |
|||
References
- Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
- Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
- Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
- Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
- Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
- Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
- Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
- Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
- Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
- Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
- Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
- Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
- Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
- Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
- Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
- Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
- Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
- Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
- Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
- Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
- Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
- Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
- Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
- Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
- Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
- Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
- Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
- Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
- Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
- Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
- Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
- Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
- Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
- Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
- Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
- Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
- Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
- Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
- Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
- Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
- Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
- Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
- Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
- Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
- Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
- Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
- Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
- Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
- Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
- Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
- Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).
