المصفوفة خارج الخلية يخضع لإعادة عرض كبيرة أثناء التئام الجروح، والتهاب وتكون الأورام. نقدم نهجا المناعي intravital المجهري الرواية لتصور ديناميات ييفي وكذلك مكونات المصفوفة مثل شبكة مع القرار المكانية والزمانية عالية باستخدام epifluorescence أو اثنين من الفوتون المجهري.
إضافة إلى كونه سقالة البدنية للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة، المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتشارك بنشاط في تنظيم الخلايا والأنسجة وظيفة خلال التنمية والتوازن الجهاز. وهو يفعل ذلك من خلال العمل عن طريق الكيمياء الحيوية، والنشاط الحيوي، ومسارات الإشارات الفيزيائية الحيوية، وذلك من خلال الإفراج عن شظايا النشطة بيولوجيا البروتين ECM، وتنظيم التوتر الأنسجة، وتوفير مسارات للهجرة الخلية. المصفوفة خارج الخلية من المكروية الورم يخضع لإعادة عرض كبيرة، والتي تتميز تدهور وترسب وتنظيم ييفي وغير ييفي البروتينات المصفوفة. اللحمية تشنج المكروية الورم يمكن أن تعزز نمو الورم والغزو، وتسبب إعادة تشكيل الأوعية الدموية واللمفاوية. تصوير حي من البروتينات المصفوفة، ولكن، لهذه النقطة يقتصر على الكولاجين لييفي التي يمكن الكشف عنها بواسطة الجيل الثاني التوافقي باستخدام متعدد الفوتون المجهري، وترك الغالبية العظمى من مكونات المصفوفة لغير مرئية argely. نحن هنا تصف إجراءات الورم التلقيح في الظهرية رقيقة الجلد الأذن، immunolabeling من البروتينات المصفوفة خارج الخلية وintravital التصوير من الأنسجة التي تتعرض لها من الفئران الحية باستخدام epifluorescence واثنين من الفوتون المجهري. يسمح لنا طريقة intravital التصوير للكشف المباشر على حد سواء ييفي وغير ييفي البروتينات المصفوفة في سياق الورم الجلدي المتنامية. وتبين لنا أمثلة على السفينة إعادة الناجمة عن الانكماش مصفوفة المحلية. وجدنا أيضا أن مصفوفة ييفي من الكشف عن الورم مع الجيل الثاني التوافقي يختلف مكانيا من مكونات المصفوفة المودعة حديثا مثل tenascin C. نحن أيضا أظهرت طويلة الأجل (12 ساعة) التصوير التفاعل مع الخلايا T-الخلايا السرطانية والخلايا السرطانية الهجرة على طول الكولاجين الرابع من الغشاء القاعدي. أخذت معا، وهذه الطريقة تسمح فريد للكشف في وقت واحد من الخلايا السرطانية، المكروية البدنية والأنسجة الاستجابة المناعية الذاتية مع مرور الوقت، والتي قد الأقليمIDE معلومات هامة عن الآليات الكامنة وراء تطور الورم والنجاح في نهاية المطاف أو مقاومة للعلاج.
وقد intravital التصوير من عمليات إعادة التهابات، والنقيلي ومصفوفة مجالا هاما للبحث والتي حفزت إنشاء العديد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن مراسل البروتينات الفلورية 1،2. بسبب إشارات الفلورسنت خارج التركيز، والتي تقلل من جودة الصورة وحدود الضوء من خلال اختراق الأنسجة، والتصوير الأنسجة سميكة هو الوحيد الممكن مع متحد البؤر المسح الضوئي أو متعدد الفوتون المجهري 3. باستخدام أسرع وأقل تكلفة وتعقيدا المجهري epifluorescence هو الوحيد الممكن مع ما يقرب من أنسجة ثنائية الأبعاد مثل الدجاج المشيمية السقاء الغشاء 4 أو الماوس الأدمة الأذن 5. معظم أنظمة التصوير الاستفادة من الفئران المعدلة وراثيا معربا عن مختلف البروتينات الفلورية في نوع محدد خلية الموضة. على الرغم من هذه البروتينات تقدم الضيائية ضعيفة، فإنها تحفز الاستجابة المناعية 6. وعلاوة على ذلك، فإنه من الصعب للتبديل بين أنواع فرعية معينة من الخلايا أو بمناسبةالقاعدية الأشعة تحت الحمراء أو الدول تفعيلها على هذا النحو التغيير يتطلب إعداد نموذج وراثية جديدة. بالإضافة إلى ذلك، كما الفلورسنت التعبير البروتين يقتصر عموما على حجرة داخل الخلايا، فإنه عادة ما يكون غير ممكن لصورة هياكل خارج الخلية مثل البروتينات الغشاء القاعدي أو الودائع chemokine الأنسجة 7. بدلا من ذلك، وضع العلامات غير المباشرة مع الأجسام المضادة ضد المستضدات خارج الخلية يوفر مرونة لتقريبا أي خلية من نوع مصفوفة أو عنصر محدد 8،9. ومع ذلك، ويرتبط العيب الرئيسي لهذا النهج وضع العلامات مع المناعية بوساطة مستضد الضد المركبات المناعية التي يمكن أن تؤدي تكملة سمية الخلايا التي تعتمد على نظام والبلعمة من الخلايا والهياكل خارج الخلية 10.
المصفوفة خارج الخلية من المكروية الورم، ولكن أيضا من الأنسجة الطبيعية أثناء الالتهاب أو التئام الجروح، ويخضع لإعادة عرض كبيرة. اللحمية تشنج المكروية الورم يمكن الترويجيالشركة المصرية للاتصالات نمو الورم والغزو بسبب آليات الإشارات التي يسببها التوتر وإعادة عرض القضية من الدم والأوعية اللمفاوية 11. ومع ذلك، والتصوير الحية من البروتينات المصفوفة يقتصر على الكولاجين لييفي التي يمكن الكشف عنها بواسطة الجيل الثاني التوافقي باستخدام متعدد الفوتون المجهري. مؤخرا قمنا بنشر طريقة intravital التصوير الرواية التي تقلل من خطر الإصابة الصور والمناعة سامة تلف الخلايا والهياكل تصوير الأنسجة 5. بالمقارنة مع تقنيات التصوير أنشئت فيها دورة واحدة من التصور حيوي داخلي المستمر هو في مجموعة من 30 دقيقة إلى 2 ساعة 12-17، لدينا المناعي حيوي داخلي (IF) تقنية سمحت 12 ساعة (على المدى الطويل 8) التصوير. من المهم أن نلاحظ أن وقت التصوير يقتصر على 12 ساعة بسبب القيود المحددة في البروتوكول الحيوانية لدينا ولكن لا توجد مؤشرات-مكافحة التقنية أنه لا يمكن رفعه إذا المعلمات الصحية الحرجة للحيوان، مثل ضغط الدم والقلبيتم التحكم في معدل 8. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام stereomicroscope مضان الآلي تمكنا من جمع الصور من حقول متعددة خلال تجربة واحدة، ولاحظ العمليات المناعية وإعادة عرض النادرة التي وقعت في سياق الفسيولوجية للبشرة معتمدة من قبل الدم وظيفية والأوعية اللمفاوية. لأن عدسة stereomicroscopic لديه كبيرة نسبيا، 2 سم، بعد العمل وعلى النقيض من اثنين من الفوتون المجهري البصريات لا يتطلب تبخير الماء الغمر، تم إجراء التصوير على المدى الطويل إلا تحت مضان stereomicroscope. IF حيوي داخلي يسمح بوضع العلامات المناعة، والكشف عن أي عنصر المصفوفة خارج الخلية من الجلد الطبيعي. ويستند تصميم هذه التقنية على مفهوم مبتكر من استخدام المناعية للخلايا الحية وعناصر مصفوفة أنسجة الأدمة على الماوس يتعرض جراحيا دون التسبب في آثار ضارة مناعية 5. العملية الجراحية نفسها آمنة للالأدمة الأوعية الدموية لأنها تعتمد فقط على فصل اثنين من طبقات الجلد في الأذن التي معصب بشكل مستقل، تتغذى ذاتيا عن طريق الدم واستنزفت من قبل التداولات اللمفاوي منفصلة. يسمح لنا الإعداد التجريبية تصوير مجموعة من الأحداث الهامة المرضية الفسيولوجية على مدى 12 ساعة على الأقل، بما في ذلك الاتجار الكريات البيض بين الأوعية الدموية واللمفاوية وعمليات التئام الجروح. في المنشور الأصلي، قارنا تقنية جهدنا لدولة من بين الفن المعايير في مختلف مجالات intravital التصوير. بالتالي، لاحظنا تسرب الدم السفينة والأحداث دخول الوعاء اللمفاوي من خلال أنواع مختلفة من الكريات البيضاء، بما في ذلك التصور فريدة من دخول الخلايا المناعية بدلا من جمع المتوقع الأوعية اللمفاوية الأولية 15. أيضا، واستكمال الملاحظات الذي قامت به مجموعات أخرى 9،18، وجدنا أن في الجسم الحي CCL21 قادر على تشكيل قوي والودائع متقطع على جمع ولكن من النادر فقط على الأوعية اللمفاوية الأولية.
<p cمعشوقة = "jove_content"> هنا نحن تصف حيوي داخلي تعديل IF التقنية التي يمكن دمجها مع اثنين من الفوتون المجهري للكشف عن شبكة من الكولاجين لييفي باستخدام الجيل الثاني التوافقي (SHG). وتبين لنا أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لغزو الخلايا السرطانية التصوير في سياق المكروية الورم الديناميكية، والذي يتضمن جزيئات المصفوفة مثل tenascin C، التي هي غير مستكشفة إلى حد كبير من خلال تقنيات التصوير الحالية 19. وجدنا أن المصفوفة ييفي من الورم، والكشف مع الجيل الثاني التوافقي، وتحتل مواقع مختلفة من المكروية الورم من المصفوفة المودعة حديثا يتألف من tenascin C. علاوة على ذلك، نحن تصف أمثلة على السفينة إعادة الناجمة عن الانكماش مصفوفة المحلية، منذ فترة طويلة المدى (12 ساعة) التصوير من التفاعلات تي خلية مع الخلايا السرطانية والخلايا السرطانية الهجرة على طول الكولاجين الرابع من الغشاء القاعدي. ولا يمكن تصوير هذه الأحداث في وقت واحد في حين تم تسجيل المعلمات الفسيولوجية المحلية مثل المؤسسة العامة الأوعية الدمويةrmeability والتصريف اللمفاوي.أهمية
نحن هنا تقديم نهج intravital المجهري الرواية التي يسمح عالية الدقة والتصور الدينامي للمكونات المختلفة المكروية الأنسجة، بما في ذلك ييفي فضلا عن البروتينات المصفوفة مثل شبكة. هذه الطريقة لها العديد من المزايا تقنيات intravital التصوير الحالية: (ط) وقد استخدم التصوير مضان حيوي داخلي في الدراسات دوران الأوعية الدقيقة، على سبيل المثال، لتعقب تسرب المذاب من الدم أو الأوعية اللمفاوية إلى، ولكن لم يتم جنبا إلى جنب مع المناعية. (ب) استخدام الفئران المعدلة وراثيا مراسل يسمح لأنواع معينة من الخلايا المراد تصويره، ولكن يتطلب توافرها (أو بذل جهد كبير لإنشاء مؤسسات جديدة) ويحد من عدد من أنواع الخلايا المتفاعلة التي يمكن دراستها. (ج) ولا يمكن تصوير المصفوفة خارج الخلية في الجسم الحي باستخدام الجيل الثاني التوافقي، ولكن هذه التقنية يمكن الكشف فقط الكولاجين الليفي، وترك عدد كبير من المكونات الهامة خارج الخليةمثل الأغشية الطابق السفلي، fibronectins، tenascins، عوامل النمو، وكيموكينات الجليكوزامينوجليكان الأنسجة بعيدا عن متناول البحوث الحالية. أسلوبنا يتغلب على هذه القيود، ويسمح تقنيات التصوير القياسية لإدراجها وكذلك جنبا إلى جنب مع أنواع أخرى immunostainings للخلية، وهياكل الأنسجة، والودائع الهيبارين كبريتات ملزمة عوامل النمو (مثل VEGF 26) وكيموكينات (5،18 CCL21 والشكل 2D )، أو البروتينات المصفوفة خارج الخلية في وقت واحد في حين تتبع الدم و / أو التدفقات اللمفاوي.
القيود
التصوير epifluorescence من حيوي داخلي IF يقتصر على اللوحات الجلد رقيقة، والمحرومين من اللحمة سميكة (الأنسجة الدهنية). في حين وجدنا أن الأدمة الظهرية الأذن هو الأمثل لمعرض الجراحية غير ضارة نسبيا من الجلد الأذن، epifluorescence مع حيوي داخلي IF تقنية لا يقتصر على الأدمة الأذن ويحتمل أن تطبق على سبيل المثالالجلد المكشوفة من أصابع القدم أو الجلد الخلفي من الماوس حديثي الولادة. السريع تلطيخ الضد (15 دقيقة) في المناعي IF لا يعتمد على نشر السلبي ولكن يتطلب التصريف اللمفاوي وظيفية وتدفق السائل الخلالي، وبالتالي لا يمكن ملاحظتها تلطيخ إذا المغطي الأوعية اللمفاوية 27. وتمشيا مع ذلك، الأوعية اللمفاوية وصمة عار أقوى الأوعية الدموية الدم ثم راشح (السفن بجروح، الشرايين) 5. الفصل بين ظهري وبطني اللوحات الجلد الأذن هو إجراء العمليات الجراحية خفيف ولكنه يسبب إصابة بعض الشعيرات الدموية وموت الخلايا إلى خلايا الأنسجة المختلفة. قد تكون هذه مشكلة عندما يحتاج أحد للتحقيق في الأنسجة سليمة تماما، على سبيل المثال النظر في تأثير خفيف من المخدرات على بقاء الخلية. أيضا تطبيق مضادات الأكسدة التي تعمل على حماية البشرة من الضيائية وphotobleaching من يستبعد استخدام تقنية المناعي حيوي داخلي لدراسة مثل الاكسدة الأنسجة أو أكسيد النيتريك بيولوجذ.
أخيرا، المسببة للعمى الضامة الأنسجة المقيمين مع المركبات المناعية يمكن تنشيط هذه الخلايا والتأثير على سبيل المثال دراسة الاستجابة المناعية الأنسجة وتنشيط الخلايا الجذعية.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
من أجل دراسة الاكسدة الأنسجة أو أكسيد النيتريك البيولوجيا، أسكوربات لابد من استبدالها مع وسائل الإعلام متوافقة الأنسجة الأخرى التي لا تتعارض مع الانتاج التجريبي. وبالمثل، ومنع مستقبلات القطعة Fc على خلايا المناعة عن طريق الجلد ينبغي تجنبها إذا كان الهدف من هذه الدراسة هو وظيفة وتفعيل الاستجابة المناعية الأنسجة وتنشيط الخلايا الجذعية والهجرة. ويمكن أن يتم هذا مع استخدام الأجسام المضادة الثانوية مع نادي جزء المشقوق (F (أ ب) 2 شظايا الأجسام المضادة) أو استخدام الأجسام المضادة والبيروكسيديز streptavidin الفلورسنت كما كشف الكواشف.
التطبيقات المستقبلية
نقدم داخل الرواية وفريدة من نوعهاIF تقنية الحيوية لمكونات الصورة غير ييفي من المصفوفة خارج الخلية في أورام الجلد زرع بالاشتراك مع مجموعات المساعدة الذاتية ييفي الكشف عن والكولاجين نضجت باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. واحدة من مزايا استخدام متعدد الفوتون (أو متحد البؤر) المجهر على التصوير epifluorescence هو التراص ض إمكانية ونتيجة المكانية شارك في توطين الأحداث التي تحدث داخل المصفوفة خارج الخلية، مثل دخول الوعاء الورم اللمفاوي أو في الأوعية الدموية، والتي في حالة معيار المجهري epifluorescence يمكن الاستدلال على ذلك من تغيرات شكلية فقط من الخلية الغازية. هذه التقنية لديها امكانات أوسع بكثير. على سبيل المثال، استخدمنا حيوي داخلي IF للتحقيق في آلية انسداد اللمفاوية التي كتبها اللمفاوي محددة العلاج الضوئي 27. وتشمل التطبيقات المحتملة إضافية من هذه الطريقة ولكن لا تقتصر على التحقيق في الحصانة الجلد أثناء الالتهاب، آلية الرفض زرع أو أساليب الدم واللمف اتيك نمو الأوعية أثناء تكون الأورام.
الخطوات الحاسمة في الإجراء
الخطوة الأكثر أهمية التي لها آثار حاسمة في الحفاظ على بيئة الأنسجة الفسيولوجية هو فصل الجراحي للجلد بطني والغضاريف من الأدمة الظهرية. وقطع أو انسدادات الشريان الرئيسي أو الوريد يؤدي إلى النزيف ونقص الأكسجة الأنسجة المحلية، والتي سوف تؤثر على استجابة الخلايا للعلاجات وحركة الخلية 8. شل حركة الأذن مع الغراء الجراحية يجب أن يتم بحذر كما إراقة الغراء على فضح الأنسجة سوف يتسبب في ضرر دائم للأنسجة مع انسداد الأوعية الدموية. يجب التحكم في درجة الحرارة من الفأرة والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، يحتاج الأكسجين مرطب لاستخدامها في التخدير isoflurane و، بحيث العينين والرئتين البقاء مرطب بشكل صحيح أثناء التجربة. أيضا، يجب أن يكون مستعدا أسكوربات الصوديوم طازجة وفحص درجة الحموضة لها قبل الاستخدام.
ntent "> وخلاصة القول، وهذا حيوي داخلي المناعي الجسور في الوقت الحقيقي، والقياسات المحلية من وظيفة فسيولوجية مع التصوير الجزيئي من الأحداث الخلوية المعقدة في الجلد الماوس. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة لديها امكانات كبيرة لأنه يمكن تطبيقها بسهولة على سبيل المثال ما بعد الدراسة التنموية آليات الدموية واللمفاوية-الأوعية الدموية أو لتصور المراحل المبكرة من العدوى الجلدية من قبل مختلف العوامل الممرضة. مع مرونة وإمكاناته الإنتاجية العالية، ويمكن هذا الأسلوب حيوي داخلي تساهم بشكل كبير في حقول متعددة من علم الأحياء.The authors have nothing to disclose.
المؤلفون ممتنون لجيريمي CM تيو وS. ريان أوليفر لمساهمتهم ويولانتا Kilarska للمساعدة في معالجة الصور. نشكر مرفق الأساسية BIOP في EPFL للدعم مع اثنين من الفوتون المجهري
وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المفوضية الأوروبية للبحوث (DC-الليمفاوية، 206٬653-2)، ومشروع الإطار الأوروبي 7 (AngioScaff)، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31-135756)، والمعاهد الوطنية الأميركية للصحة (NIH) / المعاهد الوطنية للصحة القلب والرئة والدم المعهد (NHLBI) (RO1 HL096539). بالإضافة إلى ذلك، الأموال من جائزة روبرت وينر (سرطان السويسري الممتاز) سمح للشراء على stereomicroscope ايكا المستخدمة في هذه الدراسة. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |