La matrice extracellulare subisce sostanziale rimodellamento durante la guarigione delle ferite, l'infiammazione e tumorigenesi. Vi presentiamo un approccio immunofluorescenza intravitale romanzo per visualizzare le dinamiche di fibrillare come pure componenti della matrice maglia-come con alta risoluzione spaziale e temporale con epifluorescenza o microscopia a due fotoni.
Oltre ad essere un ponteggio fisico per mantenere la morfologia dei tessuti, la matrice extracellulare (ECM) è attivamente coinvolto nella regolazione della funzione delle cellule e dei tessuti durante lo sviluppo e organo omeostasi. Lo fa agendo attraverso vie di segnalazione biochimica, biomeccanica, e biofisiche, come ad esempio attraverso il rilascio di frammenti proteici ECM bioattivi, che regola la tensione dei tessuti, e fornire percorsi di migrazione delle cellule. La matrice extracellulare del microambiente tumorale subisce rimodellamento sostanziale, caratterizzato dal degrado, deposizione e l'organizzazione della matrice proteine fibrillari e non fibrillari. Stromali irrigidimento del microambiente tumorale può promuovere la crescita del tumore e l'invasione, e causare rimodellamento dei vasi sanguigni e linfatici. Immagini dal vivo di proteine della matrice, però, a questo punto è limitata a collageni fibrillari che possono essere rilevati dai generazione di seconda armonica mediante microscopia multi-fotone, lasciando la maggior parte dei componenti della matrice Largely invisibile. Qui si descrivono le procedure per tumore inoculazione nella cute dell'orecchio dorsale sottile, immunomarcatura di proteine della matrice extracellulare e l'imaging intravitale del tessuto esposto in topi vivi con epifluorescenza e la microscopia a due fotoni. Il nostro metodo di imaging intravitale consente di rilevare direttamente sia fibrillare e proteine della matrice non fibrillari nel contesto di un tumore cutaneo crescente. Mostriamo alcuni esempi di rimodellamento nave causate dalla contrazione matrice locale. Abbiamo anche trovato che matrice fibrillare del tumore rilevato con la generazione di seconda armonica è spazialmente distinte da componenti della matrice appena depositati come tenascin C. Abbiamo anche dimostrato di lunga durata (12 ore) l'imaging di interazione T-cellulare con cellule tumorali e cellule tumorali migrazione lungo il collagene IV della membrana basale. Presi insieme, questo metodo permette unicamente per la rilevazione simultanea di cellule tumorali, la loro microambiente fisica e il tessuto risposta immunitaria endogena nel tempo, che può provide importanti informazioni sui meccanismi sottostanti la progressione del tumore e il successo finale o resistenza alla terapia.
L'imaging intravitale dei processi di rimodellamento infiammatorio, metastatici e matrice è stato un importante settore di ricerca e ha motivato la creazione di numerosi modelli di topo giornalista transgenici che esprimono proteine fluorescenti 1,2. A causa di segnali fluorescenti out-of-focus, che riducono la qualità dell'immagine e limiti illuminano la penetrazione attraverso il tessuto, tessuto spesso imaging è possibile solo con confocale o microscopia a scansione multi-fotone 3. Utilizzando più veloce, meno costoso e complesso epifluorescenza è possibile solo con i tessuti quasi bidimensionali, come il corio-allantoideo membrana pollo 4 o del mouse derma orecchie 5. La maggior parte dei sistemi di imaging approfittare di topi transgenici che esprimono diverse proteine fluorescenti in un determinato tipo di cellule di moda. Anche se queste proteine offrono debole fototossicità, inducono la risposta immunitaria 6. Inoltre, è difficile commutare tra sottotipi cellulari specifici o contrassegnare l'ir basale o stati attivati in quanto tale modifica richiede la preparazione di un nuovo modello genetico. Inoltre, come espressione della proteina fluorescente è generalmente limitata al compartimento intracellulare, non è generalmente possibile a strutture extracellulari di immagine come proteine di membrana basale o depositi chemochine tessuto 7. Invece, l'etichettatura indiretta con anticorpi contro gli antigeni extracellulari offre flessibilità per qualsiasi tipo cellulare o matrice componente specifico 8,9. Tuttavia, il principale svantaggio di questo approccio di etichettatura è associato dell'immunotossicità mediata da antigene-anticorpo immunocomplessi che possono innescare complemento tossicità cellulare dipendente dal sistema e fagocitosi di cellule e strutture extracellulari 10.
La matrice extracellulare del microambiente tumorale, ma anche di tessuto normale durante l'infiammazione o cicatrizzazione, subisce sostanziali rimodellamento. Stromali irrigidimento del microambiente tumorale può promola crescita del tumore te e l'invasione a causa di meccanismi di segnalazione indotte dallo stress e causa rimodellamento di vasi sanguigni e linfatici 11. Tuttavia, l'imaging dal vivo di proteine della matrice è limitata a collageni fibrillari che possono essere rilevati dalla generazione di seconda armonica mediante microscopia multi-fotone. Recentemente abbiamo pubblicato un metodo di imaging intravitale romanzo che riduce al minimo il rischio di foto-e immuno-tossica danni alle cellule impressi e le strutture del tessuto 5. In confronto con le tecniche di imaging stabilite in cui il singolo turno di continuo visualizzazione intravitale è in un intervallo di 30 minuti a 2 ore 12-17, il nostro immunofluorescenza intravital (IF) tecnica ha permesso 12 ore (a lungo termine 8) imaging. È importante notare che il tempo di imaging è limitato a 12 ore a causa di limiti definiti nel nostro protocollo animale ma non vi sono controindicazioni tecniche che non può essere prolungata per parametri critici della salute animale, come la pressione sanguigna e del cuorerate sono controllati 8. Inoltre, utilizzando un stereomicroscopio a fluorescenza automatizzato siamo stati in grado di raccogliere immagini da più campi durante un singolo esperimento e osservato rari processi immunologici e rimodellamento che si sono verificati nel contesto fisiologico della pelle sostenuto da sangue funzionale e vasi linfatici. Poiché la lente stereomicroscopio ha una relativamente grande di 2 cm, distanza di lavoro e in contrasto con due fotoni ottiche microscopiche non richiede vaporizzazione immersione in acqua, imaging a lungo termine è stato eseguito solo sotto stereomicroscopio a fluorescenza. Intravitale se consentito l'etichettatura immunitario e il rilevamento di qualsiasi componente della matrice extracellulare della pelle normale. Il motivo di questa tecnica si basa sul concetto innovativo di usare immunocolorazione per le cellule vive e elementi di matrice del tessuto sul derma topi esposti chirurgicamente senza causare effetti nocivi immunitossici 5. La procedura chirurgica in sé è sicuro al dermavascolare in quanto si basa solo sulla separazione dei due strati di pelle nell'orecchio che sono innervati indipendente, autonomo alimentato da sangue e drenato da circolazioni linfatiche separati. Il nostro apparato sperimentale permette l'imaging di una serie di importanti eventi fisiopatologiche oltre almeno 12 ore, incluso il traffico dei leucociti tra i vasi sanguigni e linfatici e processi di guarigione delle ferite. Nella pubblicazione originale, abbiamo confrontato la nostra tecnica a state-of-the-art standard in vari campi dell'imaging intravitale. Di conseguenza, abbiamo osservato vasi sanguigni stravaso e eventi intravasation linfatici da vari tipi di leucociti, compresa la visualizzazione unica di cellule immunitarie entrano raccolta invece previsto vasi linfatici iniziali 15. Inoltre, integrando le osservazioni fatte da altri gruppi 9,18, abbiamo scoperto che in CCL21 vivo è in grado di formare forti, depositi discontinue sulla raccolta, ma solo di rado su linfatici iniziali.
<p class = "jove_content"> Qui si descrive un intravital modificato IF tecnica che può essere combinato con microscopia a due fotoni per rilevare rete di collageni fibrillari con generazione di seconda armonica (SHG). Abbiamo dimostrato che questo metodo può essere utilizzato anche per l'invasione delle cellule di cancro imaging contesto del microambiente tumorale dinamico, che comprende molecole della matrice come tenascin C, che sono ampiamente esplorato da tecniche di imaging correnti 19. Abbiamo trovato che la matrice fibrillare del tumore, rilevato con la generazione di seconda armonica, occupa diverse posizioni del microambiente tumorale rispetto alla matrice appena depositato composto tenascin C. Inoltre, si descrivono esempi di rimodellamento nave causate dalla contrazione matrice locale, lungo termine (12 ore) l'imaging di interazioni T-cellulari con cellule tumorali e migrazione delle cellule tumorali lungo collagene IV della membrana basale. Tali eventi possono essere esposte contemporaneamente la registrazione di parametri fisiologici locali come pe vasi sanguignirmeability e il drenaggio linfatico.Significato
Presentiamo qui un approccio microscopia intravitale romanzo che permette alta risoluzione e visualizzazione dinamica dei diversi componenti del microambiente tissutale, incluse fibrillare e proteine della matrice di tipo maglia. Questo metodo presenta diversi vantaggi rispetto alle attuali tecniche di imaging intravitale: (i) intravitale imaging di fluorescenza è stato utilizzato in studi microcircolazione, ad esempio, per monitorare perdite soluto dal sangue o in linfatici, ma non è stato combinato con immunocolorazione. (Ii) L'uso di topi transgenici geneticamente modificati consente di specifici tipi cellulari per essere ripreso, ma richiede loro disponibilità (o sforzo sostanziale per creare nuove) e limita il numero di interagire tipi di cellule che possono essere studiate. (Iii) La matrice extracellulare può essere ripreso in vivo usando generazione di seconda armonica, ma questa tecnica può rilevare solo collageni fibrosi, lasciando un gran numero di importanti componenti extracellularicome membrane basali, fibronectine, tenascins, fattori di crescita, chemochine e glicosaminoglicani tessuti fuori dalla portata per la ricerca corrente. Il nostro metodo supera queste limitazioni, e permette tecniche di imaging standard per essere incorporati e ulteriormente combinati con immunostainings per altri tipi di cellule, strutture dei tessuti, depositi di eparina solfato di legame dei fattori di crescita (ad esempio VEGF 26) e chemochine (CCL21 5,18 e fig. 2D o), proteine della matrice extracellulare mentre simultaneamente rintraccia sangue e / o flussi linfatici.
Limitazioni
La rappresentazione epifluorescenza di intravitale IF è limitata ai lembi di pelle sottili, prive di spessore ipoderma (tessuto adiposo). Mentre abbiamo trovato che il derma orecchio dorsale è ottimale per relativamente innocuo esposizione chirurgica della pelle dell'orecchio, epifluorescenza dotato intravital IF tecnica non è limitata a derma orecchio e potrebbe potenzialmente essere applicate esla pelle esposta delle dita o indietro la pelle del topo neonato. Colorazione anticorpo rapido (15 minuti) in immunofluorescenza SE non dipende diffusione passiva, ma richiede il drenaggio linfatico e funzionale il flusso del fluido interstiziale, quindi nessuna colorazione può essere osservata se i vasi linfatici sono occlusi 27. In linea con questo, vasi linfatici macchia forte poi perde vasi del sangue (navi feriti, arteriole) 5. La separazione della dorsale e ventrale lembi cutanei dell'orecchio è una procedura chirurgica lieve ma provoca lesioni ad alcuni capillari e morte cellulare in varie cellule dei tessuti. Questo potrebbe essere un problema quando si ha la necessità di indagare il tessuto completamente intatto, ad esempio guardando la lieve effetto dei farmaci sulla sopravvivenza delle cellule. Anche l'applicazione di antiossidante che serve a proteggere la pelle da fototossicità e photobleaching esclude l'utilizzo di tecniche di immunofluorescenza intravital studiare ad esempio lo stress ossidativo tessuto o ossido nitrico biology.
Infine, accecante di macrofagi residenti tessuto con immunocomplessi può attivare queste cellule e influenza ad esempio lo studio del tessuto risposta immunitaria e l'attivazione delle cellule dendritiche.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Per studiare stress ossidativo tessuto o ossido nitrico biologia, ascorbato deve essere sostituita con altri mezzi compatibili tessuto che non interferiscono con l'uscita sperimentale. Allo stesso modo, bloccando i recettori Fc sulle cellule immunitarie cutanee dovrebbero essere evitati se l'obiettivo dello studio è la funzione e l'attivazione della risposta immunitaria dei tessuti e l'attivazione delle cellule dendritiche e migrazione. Questo può essere fatto con l'uso di anticorpo secondario con frammento Fc spaccati (F (ab) 2 frammenti anticorpali) o l'uso di anticorpo biotinilato e streptavidina fluorescente come reagenti di rivelazione.
Le applicazioni future
Vi presentiamo un intra romanzo e unicovitale IF tecnica per immagini componenti non fibrillari della matrice extracellulare in tumori della pelle trapiantabili in combinazione con fibrillare SHG-rilevato e collagene maturati usando la microscopia a due fotoni. Uno dei vantaggi di utilizzare multi-fotone (o confocale) microscopia sopra di imaging in epifluorescenza è possibilità z-impilamento e di conseguenza spaziale co-localizzazione di eventi che si verificano all'interno della matrice extracellulare, ad esempio intravasation tumore in linfatica o vaso sanguigno, che nel caso di epifluorescenza standard può essere dedotto solo da variazioni morfologiche della cellula invasore. Questa tecnica ha un potenziale molto più ampia. Ad esempio, abbiamo utilizzato il intravital IF per indagare il meccanismo di occlusione linfatico specifica-linfatico terapia fotodinamica 27. Altri potenziali applicazioni di questo metodo includono ma non sono limitati a indagine dell'immunità pelle durante l'infiammazione, meccanismo di rifiuto o metodi di sangue e linfa trapianto la crescita dei vasi atic durante la tumorigenesi.
Passaggi critici nella procedura
Il passo più importante che ha implicazioni critiche per sostenere un ambiente tessuto fisiologica è una separazione chirurgica della pelle ventrale e cartilagine dal derma dorsali. Taglio o occludere l'arteria principale o vena porterà ad un eccessivo sanguinamento e ipossia tissutale locale, che interesserà risposta cellulare ai trattamenti e il movimento delle cellule 8. Immobilizzare l'orecchio con colla chirurgica dovrebbe essere fatto con cura, come si rovescia la colla sulla esporre tessuto causerà un danno permanente al tessuto da occlusione dei vasi sanguigni. La temperatura del mouse deve essere controllata e mantenuta a 37 ° C. Inoltre, ossigeno umidificato deve essere usato per il isoflurano, in modo che gli occhi e polmoni rimanere adeguatamente umidificati durante l'esperimento. Inoltre, ascorbato di sodio deve essere preparata al momento e il suo pH controllato prima dell'uso.
S copi "> In sintesi, questo immunofluorescenza intravital ponti in tempo reale, le misure locali di funzione fisiologica con imaging molecolare di eventi cellulari complessi in pelle mouse. Inoltre, questo metodo ha un grande potenziale in quanto può essere facilmente applicato ad esempio studio post-sviluppo meccanismi di sangue e la linfa-angiogenesi o per visualizzare le prime fasi di infezione della pelle da vari agenti patogeni. Con la sua flessibilità e il potenziale high-throughput, questa tecnica intravital possono contribuire significativamente a molteplici campi della biologia.The authors have nothing to disclose.
Gli autori sono grati a Jeremy CM Teo e S. Ryan Oliver per il loro contributo e Jolanta Kilarska aiuto per l'elaborazione delle immagini. Ringraziamo il core facility BIOP presso l'EPFL per il sostegno con la microscopia a due fotoni
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti della Commissione europea di ricerca (DC-Linfa, 206653-2), il Progetto Quadro europeo 7 (AngioScaff), il Fondo nazionale svizzero (31-135756), e la US National Institutes of Health (NIH) / NIH Cuore, Polmone, and Blood Institute (NHLBI) (RO1 HL096539). Inoltre, i fondi del Robert Wenner Award (Swiss Cancer League) ha permesso l'acquisto la stereomicroscopio Leica utilizzato in questo studio. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |