एक न्यूरॉन microfluidic arraying और biomaterial कोटिंग्स में चिप प्लाज्मा patterning के लिए पानी मास्किंग के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. अत्यधिक परस्पर सह संस्कृतियों न्यूनतम सेल आदानों का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है.
Campenot चैंबर के microfluidic embodiments तंत्रिका विज्ञान समुदाय से महान ब्याज को आकर्षित किया है. इन परस्पर सह संस्कृति प्लेटफार्मों संक्रमण और बीमारी प्रचार करने के लिए विकास और कार्यात्मक तंत्रिका जीव विज्ञान फैले, सवालों की एक किस्म की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, पारंपरिक प्रणालियों महत्वपूर्ण सेलुलर ऐसे प्राथमिक डोपामिनर्जिक substantia nigra, सर्पिल ganglia, और Drosophilia मेलानोगास्टर न्यूरॉन्स के रूप में कम बहुतायत कोशिकाओं के अध्ययन के लिए अपर्याप्त आदानों (डिब्बे प्रति कई हजारों),,, और उच्च throughput प्रयोग के लिए अव्यावहारिक आवश्यकता होती है. घने संस्कृतियों भी अत्यधिक स्थानीय स्तर पर दो संस्कृतियों के परस्पर कुछ outgrowths (<10%) के साथ, उलझ रहे हैं. (मैं) एक microfluidic न्यूरॉन विधि arraying, और प्लाज्मा patterning biomaterial कोटिंग्स regi करने के लिए (द्वितीय) एक पानी मास्किंग विधि: इस पत्र में सीधा microfluidic और patterning प्रोटोकॉल इन चुनौतियों से निपटने के जो वर्णन किया गया हैंन्यूरॉन्स ster और डिब्बों के बीच परिणाम को बढ़ावा देने. न्यूनतर neuronal सह संस्कृतियों उच्च स्तर (> 85%) intercompartment कनेक्टिविटी के साथ तैयार थे और एकल कक्ष परिशुद्धता के साथ उच्च throughput तंत्रिका जीव विज्ञान के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Neuronal ऊतक अत्यधिक जटिल है; स्थानिक सेल संपर्क और विशेष रूप से अक्षतंतु और dendrite outgrowths के माध्यम से के माध्यम से परिभाषित परतों और डिब्बों के भीतर और प्लास्टिक कनेक्टिविटी के साथ आदेश दिया है कि एक विषम सेलुलर मिश्रण. नई तकनीक गहरी अंतर्दृष्टि और रोग, विकास, और स्वस्थ समारोह के लिए केंद्रीय सुलझाना तंत्र हासिल करने के लिए अधिक से अधिक प्रयोगात्मक स्वतंत्रता प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं. Campenot कक्ष 1,2 और अधिक हाल ही में microfabricated embodiments 3,4 चुनिंदा विभिन्न दैहिक आबादी उपद्रव और भी उनके neurite outgrowths करने की क्षमता के साथ नेटवर्क neuronal सह संस्कृतियों के पूर्व vivo तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये microfluidic उपकरणों उदाहरण के लिए रासायनिक 5,6 या लेजर axotomy 6-8, tauopathy 9, वायरल प्रसार 10,11, और axons 4 में mRNA स्थानीयकरण निम्नलिखित अक्षतंतु अध: पतन और उत्थान अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
ईएनटी ">Neurobiologists की पहुंच का विस्तार, तकनीकी विकास न्यूनतर neuronal सह संस्कृतियों तैयार करने के लिए आवश्यक हैं. इस एकल कक्ष और उप सेलुलर परिशुद्धता के साथ प्रणाली की जांच के लिए neuronal नेटवर्क के सुलझाव सक्षम बनाता है. न्यूनतम सेल नंबर के लिए आवश्यकता पार्किंसंस रोग, कान से सर्पिल ganglia, परिधीय न्यूरॉन्स के लिए प्रासंगिक डोपामिनर्जिक substantia nigra कोशिकाओं सहित दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं, विश्लेषण, और स्टेम कोशिकाओं के लिए संभावना को खोलता है. इस के अलावा, सेलुलर अर्थव्यवस्था 3Rs पहल के लिए प्रासंगिक है. इन microfluidic प्लेटफार्मों, बड़े पैमाने पर विषाक्तता स्क्रीन या अन्य उच्च throughput का प्रयोग, पशु न्यूरॉन्स की आवश्यकता डेटा अमीर प्रयोगात्मक श्रृंखला अब माना जा सकता है.
इस पत्र में एक microfluidic डिवाइस के निर्माण और उपयोग के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. सीटू biomateri में एक साथ संयोजन में microfluidic arrayingअल patterning विधि न्यूनतम सेल नंबर का उपयोग अत्यधिक परस्पर neuronal सह संस्कृतियों के पंजीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Microfluidic arraying एक अंतर प्रवाह दृष्टिकोण microstructured जाल एक fluidic सर्किट (चित्र 1 में SEM छवियों के साथ सचित्र) के भीतर तैनात हैं जिससे 12-15, पर आधारित है. neurite परिणाम चैनलों को inlets – पथ 0 → 1 microstructured apertures की एक रैखिक सरणी के लिए न्यूरॉन्स के परिवहन के लिए कम fluidic प्रतिरोध (नि. 2> आर 1) है. एक एकल कोशिका से जाल की रिहाइश स्थानीय स्तर पर पड़ोसी जाल में बाद में कोशिकाओं को फँसाने के लिए सुव्यवस्थित हटाने के प्रवाह में बाधा उत्पन्न करती. सरणी में जाल की पूरी अधिभोग अतिरिक्त न्यूरॉन्स को हटाने के लिए ऑपरेशन का एक बाईपास मोड के उत्पादन के लिए चक्करदार पथ (0 → 2) में सुव्यवस्थित हटाने की fluidic अनुपात (आर 1> आर 2) स्विच.
<p claएस एस = "jove_content" के लिए: रखने together.within पृष्ठ = "हमेशा">तलीय substrates पर micropatterned neuronal नेटवर्क की तैयारी आसानी exampl के लिए (प्राप्त किया जा सकता है हमारे समूह से तों, Frimat एट अल. 16 और Heike एट अल. 17) देखें. हालांकि, PDMS उपकरणों के भीतर और microfluidic चैनलों के लिए इनमें से सुक्ष्ममापी पैमाने संरेखण की आवश्यकता के साथ bioactive सामग्री पैटर्न encapsulating एक प्रमुख तकनीकी चुनौती बन गया है. खंड 3.1 में के लिए एक प्रोटोकॉल में चिप, या बगल में, biomaterial पैटर्न की तैयारी में प्रस्तुत किया है. इन नमूनों लंबा संस्कृति timescales दौरान न्यूरॉन पंजीकरण सक्षम और डिब्बों के बीच outgrowths को बढ़ावा देने. Meniscus-लगाए microstructures न्यूरॉन साइटों और neurite परिणाम चैनलों arraying साथ एक तथाकथित पानी मुखौटा संरेखित करने के लिए उपयोग किया जाता है. सतहों उजागर biomaterial स्वरूप को परिभाषित करने के लिए विघटित कर रहे हैं, जबकि पानी का मुखौटा, प्लाज्मा उपचार के दौरान आसंजन अणु कोटिंग्स की रक्षा करता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल सेल संस्कृति के लिए और विभिन्न सह संस्कृति डिब्बों के चुनिंदा उपचार के लिए आवश्यक fluidic अलगाव के लिए प्रदान की जाती हैं.
ve_content "> प्रोटोकॉल इसी तरह, सीटू biomaterial patterning में वाष्पीकरण और सतह तनाव घटना का शोषण, सीधा है. पाली की प्रतिकृति (dimethylsiloxane) (PDMS) microfluidic उपकरणों 18 के लिए नरम लिथोग्राफी के उपयोगकर्ता के अनुकूल सिद्धांतों का लाभ उठाने के लिए तैयार है, और कर रहे हैं केवल एक सस्ती हाथ से आयोजित प्लाज्मा स्रोत की आवश्यकता होती है. microfluidic सर्किट इन आपरेशनों बनाने को प्रभावी ढंग से कार्यक्रमों सेल लदान और डिब्बे विशिष्ट उपचार बस सही नीचे पोर्ट में सामग्री वितरण और ऊपर से aspirating की बात है. इस तरीके में, यह neurobiologists देने का इरादा है उनकी अपनी प्रयोगशालाओं में microfluidic उपकरणों को तैयार करने और उपयोग करने के लिए स्वतंत्रता.microfluidic arraying तकनीक न्यूनतर संस्कृतियों की स्थापना के लिए सटीक एक न्यूरॉन से निपटने में सक्षम बनाता है कि अपनी तरह का पहला है. Microfluidic संरचनाओं के साथ सेल पैटर्न के लिए पंक्ति में सीटू biomaterial patterning विधि में, ?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों SEM इमेजिंग के लिए SU-8 निर्माण और मारिया बेकर (ISAs) के लिए Ulrich Marggraf (ISAs) के लिए आभारी हैं. अनुसंधान आर्थिक रूप से ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), एक Bundesministerium फर Bildung und Forschung अनुदान (BMBF 0101-31P6541) द्वारा और Ministerium फर अभिनव, Wissenschaft und Forschung डेस लैंडेस Nordrhein-Westfalen द्वारा समर्थित किया गया. Heike Hardelauf धन्यवाद अंतर्राष्ट्रीय लाइबनिट्स ग्रेजुएट स्कूल "सिस्टम्स बायोलॉजी लैब पर एक चिप" वित्तीय सहायता के लिए.
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
3 mm Biopsy Punches | Kai Medical | Handle with care – extremely sharp | |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
4-Way Tubing Connector | VWR or Fisher Scientific | ||
Flow Regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
0.5 mm Pins | Dressmaking Departments | ||
PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
poly-lysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Inverted Fluorescent Microscope | |||
Example Aspiration Pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
Hand Held Corona Discharge Device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
Femto Plasma Oven | Diener Electronic | ||
Vacuum Dessicator or Centrifuge |