Tek bir nöron mikroakışkan arraying ve biyomalzeme kaplamaların içinde-çip plazma desenlendirme için su maskeleme için protokoller anlatılmıştır. Yüksek birbirine eş hücre kültürleri en az girişler kullanılarak hazırlanabilir.
Campenot odasının mikrofluidik düzenlemeleri nörobilim eden büyük ilgi çekmiştir. Bunlar birbirine ko-kültür platformları enfeksiyon ve hastalık yayılması için gelişimsel ve fonksiyonel nörobiyoloji kapsayan, çeşitli sorular araştırmak için kullanılabilir. Ancak, geleneksel sistemleri önemli hücresel primer dopaminerjik substantia nigra, spiral ganglionlar ve Drosophilia melanogaster nöronlar gibi düşük bolluk hücrelerini inceleyerek yetersiz girdileri (bölmesi başına binlerce), ve yüksek verimlilik deney için pratik gerektirir. Kültürler de son derece yoğun yerel olarak iki kültür birbirine az çıkıntılar (<% 10) ile, dolanmış edilir. (I) microfluidic tek nöron yöntemi arraying ve plazma desenlendirme biyomateryal kaplamalar REGI için (ii) bir su maskeleme yöntemi: Bu yazıda basit mikroakışkan ve desenlendirme protokoller bu sorunları ele tarif edilmiştirnöronlar ster ve bölmeler arasında gelişimini teşvik eder. Minimalistik nöronal ko-kültürler yüksek düzeyde (> 85%) intercompartment bağlantısı ile hazırlandı ve tek bir hücre hassasiyet ile yüksek verimli neurobiology deneyleri için de kullanılabilir.
Nöronal doku oldukça karmaşıktır; uzaysal hücre kişiler ve özellikle akson ve dendrit çıkıntılar aracılığı ile tanımlanan katmanları ve bölmeler içinde ve plastik bağlantı ile sipariş heterojen bir hücre karışımı. Yeni teknikler derin anlayışlar ve hastalık, gelişme ve sağlıklı fonksiyonu merkezi unravel mekanizmaları kazanmak için daha fazla deneysel özgürlüğünü engellemediği için gereklidir. Campenot odası 1,2 ve daha yakın zamanda mikrofabrike düzenlemeleri 3,4 seçici olarak farklı somatik popülasyonları karıştırmayı ve aynı zamanda nörit çıkıntılar yeteneği ile ağ nöronal ko-kültürler ex vivo hazırlanması için kullanılabilir. Bu mikroakışkan cihazlar, örneğin kimyasal 5,6 ya da lazer axotomy 6-8, tauopathy 9, viral yayılması 10,11 ve akson 4 mRNA lokalizasyonu aşağıdaki akson dejenerasyon ve rejenerasyon incelemek için kullanılmıştır.
ent ">Neurobiologists ulaşmak uzatmak için, teknolojik gelişmeler minimalist nöronal co-kültürler hazırlamaları gerekmektedir. Bu, tek hücre ve hücre altı hassas sistemin soruşturma için nöronal ağ çözülmesini sağlar. Minimal hücre sayıları için gereklilik, Parkinson hastalığı, kulak spiral gangliyon, periferik dopaminerjik nöronlar için ilgili substantia nigra hücreleri dahil seyrek hücre tipleri, analiz etmek ve kök hücreler imkanı açar. Bunun ötesinde, hücresel ekonomi 3R'si girişimi alakalı. Bu mikroakışkan platformları, büyük ölçekli toksisite ekranları veya diğer yüksek verim kullanma, hayvan nöronlar gerektiren veri zengin deneysel serisi şimdi kabul edilebilir.
Bu yazıda mikroakışkan cihazın imalatı ve kullanılması için protokolleri açıklanmıştır. In situ biomateri bir kombinasyon halinde mikroakışkan arrayingal desenleme yöntemi minimal hücre numaralarını kullanarak son derece birbirine bağlı nöronal ortak kültürlerin kayıt için kullanılabilir. Mikroakışkan arraying bir diferansiyel akış yaklaşım mikro yapılı pnömatik gevşetmeli bir yapı trans devresi (Şekil 1 'de SEM görüntüleri ile birlikte gösterilmiştir) içinde yer alan bu sayede 12-15, dayanmaktadır. Nörit gelişimi kanal girişleri – yol 0 1 → mikrostrüktürlü delik doğrusal bir dizi nöronlar taşınması için alt akışkan bir direnç (R2> R 1) sahiptir. Tek bir hücre tarafından tuzak doluluk yerel komşu tuzakları sonraki hücreleri yakalama için akıcılık aktarmak akışını engellemektedir. Dizideki tuzakları tam doluluk fazla nöron uzaklaştırılması için işlemin bir bypass moduna üretmek için kavisli bir yolda (0 → 2) içine akıcılık aktarmak için akışkan oranını (R 1> R 2) geçer.
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always">Düzlemsel alt-tabakalar üzerinde micropatterned nöronal ağların hazırlanması kolayca exampl için (elde edilebilir Bizim gruptan es, Frimat vd. 16 ve Heike ve diğ. 17) bkz. Ancak, PDMS cihazlar içinde ve microfluidic kanalları bu mikrometre çaplı uyum şartı ile biyoaktif malzeme desen özetleyen bir büyük bir teknik sorun teşkil etmektedir. Bölüm 3.1 'de bir protokol in-çip ya da in situ olarak, biyo-malzeme desen hazırlanması sunulmuştur. Bu desenler uzun kültür timescales sırasında nöron kayıt etkinleştirmek ve bölmeler arasında çıkıntılar teşvik. Menisküs-çivileme mikro nöron siteleri ve nörit gelişimi kanalları arraying ile adlandırılan bir su maske hizalamak için kullanılır. Maruz kalan yüzeyleri, biyo materyal bir modelin oluşturulması için parçalandı oysa su maskesi, plazma muamelesi esnasında yapışma molekülü kaplamalar korur. Buna ek olarak, protokoller, hücre kültürü için ve farklı ko-kültür bölmelerin seçici tedavisi için gerekli olan akışkan izolasyonu için temin edilmiştir.
ve_content "> protokoller Benzer şekilde, yerinde biyomalzeme desenleme buharlaşma ve yüzey gerilimi olayları istismar, basittir. poli çoğaltma (dimetilsiloksan) (PDMS) mikroakışkan cihazlar 18 için yumuşak litografi kullanıcı dostu ilkelerini güçlendirmek için tasarlanmıştır ve yalnızca ucuz bir el plazma kaynağı gerektiren. microfluidic devre bu operasyonları yapma etkili programlar hücre yükleme ve kompartman spesifik tedaviler sadece doğru alt portuna maddelerin dağıtımı ve yukarıdan aspire meselesi. Bu şekilde, bu neurobiologists vermek için tasarlanmıştır kendi laboratuarlarında microfluidic cihazlar hazırlamak ve kullanmak için özgürlük.Mikroakışkan arraying teknik minimalist kültürleri kurulması için hassas tek bir nöron kullanım sağlar türünün ilk. Mikroakışkan yapılarla hücre desen hizalamak için in situ biyomateryal-yapıya model verme yöntemi, güçlü bir yaklaşım ile birleştiğinde, bu minimalistik kültürler azaltılmış yerel dolanması ile yüksek düzeyde intercompartment bağlantısı vardır. Basit bir tasarım değişiklikleri görselleştirme ve kantitatif analiz için tek tek aksonlar izole etmek…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar SEM görüntüleme için SU-8 üretimi ve Maria Becker (ISAS) Ulrich Marggraf (ISAS) müteşekkiriz. Araştırma mali Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), bir Bundesministerium für Bildung und Forschung hibe (Bmbf 0101-31P6541) tarafından ve Ministerium für Yenilik, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen tarafından desteklenmiştir. Heike Hardelauf sayesinde Uluslararası Leibniz Enstitüsü "Systems Biology Lab-on-a-Chip" mali destek için.
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
3 mm Biopsy Punches | Kai Medical | Handle with care – extremely sharp | |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
4-Way Tubing Connector | VWR or Fisher Scientific | ||
Flow Regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
0.5 mm Pins | Dressmaking Departments | ||
PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
poly-lysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Inverted Fluorescent Microscope | |||
Example Aspiration Pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
Hand Held Corona Discharge Device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
Femto Plasma Oven | Diener Electronic | ||
Vacuum Dessicator or Centrifuge |