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Neuroscience

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

Protokolle für die einzelnen Neurons mikrofluidischen Anordnungs und Wasser für die Maskierung in dem Chip Plasma Strukturierung der Biomaterial-Beschichtungen beschrieben. Sehr verbunden Co-Kulturen können mit minimalem Ein-Zelle hergestellt werden.

Abstract

Mikrofluidik-Ausführungsformen der Campenot Kammer haben großes Interesse aus der Neurowissenschaften angezogen. Diese miteinander verbundenen Co-Kultur-Plattformen verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen zu untersuchen, Spanning Entwicklungs-und Funktions Neurobiologie, um Infektionen und Krankheiten Ausbreitungs werden. Herkömmliche Systeme benötigen jedoch erheblichen Zell Eingänge (viele Tausende pro Fach), für das Studium geringer Menge Zellen unzureichend, wie primäre dopaminergen Substantia nigra, Spiralganglien und Drosophila melanogaster Neuronen und unpraktisch für die Hochdurchsatz-Experimente. Die dichten Kulturen sind auch sehr lokal verstrickt, mit wenigen Auswüchse (<10%), die die beiden Kulturen. In diesem Papier einfach mikro-und Musterprotokolle beschrieben, die diese Herausforderungen anzugehen: (i) eine mikrofluidische einzelnen Neurons Anordnungsverfahren, und (ii) eine Wassermaskierungsverfahren für Plasma-Strukturierung Biomaterial Beschichtungen auf register Neuronen und fördern Auswuchs zwischen den Abteilen. Minimalistische neuronalen Co-Kulturen wurden mit High-Level (> 85%) intercompartment Konnektivität bereit und kann für hohe Durchsatz Neurobiologie Experimente mit einzelnen Zelle Präzision verwendet werden.

Introduction

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Nervengewebe ist sehr komplex; eine heterogene Zellmischung, die räumlich in definierten Schichten und Fächer und mit Kunststoff-Konnektivität über Zell-Kontakte und vor allem über Axon und Dendriten Auswüchse bestellt wird. Neue Techniken sind erforderlich, um mehr experimentelle Freiheit, tiefere Einblicke und entwirren zentralen Mechanismen der Krankheit, Entwicklung und gesunde Funktion gewinnen verleihen. Die Campenot Kammer 1,2 und kürzlich mikroAusführungs 3,4 kann für die ex vivo Herstellung von vernetzten neuronalen Co-Kulturen mit der Fähigkeit, ihre Neuriten Auswüchse selektiv stören die verschiedenen somatischen Populationen und auch verwendet werden. Diese mikrofluidischen Bauteilen haben beispielsweise verwendet, um Axon-Degeneration und Regeneration zu studieren folgenden chemischen 5,6 oder Laser-Axotomie 6-8, Tauopathie 9, virale Verbreitung 10,11, und mRNA-Lokalisierung in Axone 4.

ent ">

Um die Reichweite der Neurobiologen erstrecken, sind technologische Entwicklungen erforderlich, um minimalistische neuronalen Co-Kulturen vorzubereiten. Dies ermöglicht die Herauslösung des neuronalen Netzes für die Ermittlung des Systems mit einzelnen Zelle und subzellulären Präzision. Die Anforderung für eine minimale Zellzahlen eröffnet die Möglichkeit, seltenen Zelltypen, einschließlich dopaminergen Substantia nigra-Zellen relevant Parkinson, Spiralganglien aus dem Ohr, peripheren Neuronen zu analysieren, und Stammzellen. Darüber hinaus ist Mobilwirtschaft, die für die 3R-Initiative. Mit Hilfe dieser Mikrofluidik-Plattformen, große Bildschirme Toxizität oder andere Hochdurchsatz, können die Daten reichen Versuchsreihen, die Tier Neuronen betrachtet.

In diesem Papier Protokolle für die Herstellung und Verwendung einer Mikrofluid-Vorrichtung beschrieben. Mikrofluidik-Anordnungs in Kombination mit einem in situ Biomaterialienal Musterungsverfahren können für die Registrierung von hochvernetzten neuronalen Co-Kulturen mit minimalem Zellzahlen verwendet werden. Mikrofluidik-Anordnungs auf einem Differenzstrom-Ansatz 12-15, wobei mikro Traps in einem Fluidkreis (mit REM-Bildern in Fig. 1 dargestellt) auf der Basis positioniert. Der Pfad 0 → 1 die untere fluidische Widerstand (R 2> R 1) zum Transportieren Neuronen zu einer linearen Anordnung von mikrostrukturierten Öffnungen - die Einlässe zu den Neuriten-Auswuchs-Kanälen. Belegung der Falle durch eine einzelne Zelle lokal behindert den Durchfluss auf die Stromlinien zum Einfangen nachfolgenden Zellen in benachbarten Fallen abzulenken. Vollständige Belegung der Fallen in der Anordnung schaltet das fluidische Verhältnis (R 1> R 2), um die Stromlinien in den Serpentinenpfad (0 → 2) umzuleiten, um eine Bypass-Betriebsmodus für die Entfernung von überschüssigem Neuronen zu erzeugen.


Abbildung 1. Mikrofluidik-Circuit. A) Die differentielle Widerstand Fluidkreis für einzelnes Neuron Anordnungs, mit flankierenden Kulturkammern von Neuritenwachstum Kanäle miteinander verbunden. B, C) ​​SEM-Bilder der Doppelschicht compartmentalized Neuron Co-Kultur-Array mit Meniskus Pinning Mikrosäulen. Mit diesem Entwurf wurden Dreizack-förmigen Neuron Fangstrukturen verwendet, um Faszikulation der Neuriten Auswüchse zu fördern. Abbildung und Legende mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry (RSC) wiedergegeben 12. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Die Herstellung von mikro neuronaler Netzwerke auf ebenen Substraten kann leicht erreicht werden (exampl es aus unserer Gruppe finden Frimat et al. 16 und Heike et al. 17). Allerdings Verkapselung bioaktiven Material Muster in PDMS-Geräten und mit der Anforderung des Mikrometer-Skala Ausrichtung der diese den mikrofluidischen Kanälen stellt eine große technische Herausforderung. In Abschnitt 3.1 wird ein Protokoll für die in dem Chip oder in situ Herstellung von Biomaterial-Muster dargestellt. Diese Muster ermöglichen Neuron Anmeldung bei längeren Zeitskalen und Kultur zu fördern Auswüchse zwischen Fächern. Meniskus-Pinning Mikrostrukturen verwendet werden, um eine so genannte Wasser-Maske mit dem Neuron Anordnen Sites und Neuritenwachstum Kanälen auszurichten. Das Wasser Maske schützt Adhäsionsmolekül Beschichtungen während der Plasmabehandlung, während exponierten Flächen werden aufgelöst, das Biomaterial Muster definieren. Zusätzlich sind Protokolle für die Zellkultur und für die fluidische Trennung für die selektive Behandlung der verschiedenen Co-Kultur Kammern notwendig ist.

ve_content "> Die Protokolle sind auf die benutzerfreundliche Prinzipien der Softlithographie für die Replikation von Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) mikrofluidischen Vorrichtungen 18 zu nutzen. Auch in situ Biomaterial Musterung ist einfach, die Nutzung Verdunstung und Oberflächenspannung Phänomene und nur erfordern eine preiswerte Hand-Plasmaquelle. Mikrofluidik-Schaltung effektiv Programme Zelle Laderaum und spezielle Behandlungen machen diese Operationen nur eine Frage der Abgabe von Materialien in die richtige unteren Anschluss und Absaugen von oben. Auf diese Weise beabsichtigt ist, die Neurobiologen geben die Freiheit, in den eigenen Labors herzustellen und zu verwenden mikrofluidischen Bauteilen.

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Protocol

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Die Protokolle werden für Neurowissenschaftler bestimmt, und sind in Abbildung 2 zusammengefasst. Als solche ist sie empfehlen, die Mikro der SU-8-Master für PDMS-Replikation verwendet wird, um gewerbliche oder institutionelle Einrichtungen ausgelagert. Die beiden Ebenenmaske Entwürfe sind als ergänzende Information (ZIP) auf der Royal Society of Chemistry 12 Website frei verfügbar. Wichtig ist, dass die erste SU-8-Schicht bis zu einer Tiefe von 2,5-3,0 um hergestellt, und die zweite zu einer Tiefe von 25-30 &mgr; m. Dies sind wichtige Dimensionen für eine effektive Neuron Anordnungs erforderlich. Das 3 Mikron Höhenbegrenzung ist auch notwendig, um zu verhindern Neuronen transportiert oder Migration zwischen den beiden Kammern 12.

1. Mikrofluidikvorrichtung Replikation in PDMS

  1. Mischen die PDMS-Präpolymer gründlich mit dem Härtungsmittel (184) in einem Verhältnis von 10:1 und entgast die Mischung in einem Vakuum-Exsikkator für typischerweise 20 min. Alternativ dazu können Sie den Mixtur in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und benutzen niedrigen g Zentrifugation zur Entgasung.
  2. Platzieren Sie die 2-Schicht mikrostrukturiert SU-8-Wafer auf einer 80 ° C Kochplatte und richten Polymerrahmen auf jeder Vorrichtung auf dem Wafer. Gießen PDMS in die Rahmen bis zu einer Tiefe von ≥ 5 mm und ermöglichen> 1 h, um eine vollständige thermische Aushärtung zu gewährleisten.
  3. Einmal ausgehärtet, entfernen Sie die Wafer von der Kochplatte und lassen Sie auf einer flachen Oberfläche zu kühlen.
  4. Schutzbrille tragen und die Arbeit von einer Ecke (weg von der SU-8-Mikrostrukturen) mit einem starren Skalpell vorsichtig Preis des Rahmens und PDMS aus dem Wafer.
  5. Entfernen Sie die PDMS-Form aus dem Rahmen und verwenden Sie eine Schere, um das Gerät von überschüssigem PDMS trimmen. Diese so genannte Blinken wird oft erzeugt werden, wenn ein dünner Film aus PDMS erstreckt sich von der Polymer-Rahmen und der Waferoberfläche.
  6. Rest PDMS kann auf den gesamten Wafer aufgebracht und gehärtet, um den Wafer während der Lagerung zu schützen. Entfernen Sie diese vor der nachfolgenden Geräteformen, und damit entfernen Sie alle partikulieren Verunreinigungen von der Oberfläche.

2. Geräte-Aufbau-und Verbindungs

  1. Bereiten Sie die 6-Schnittstellenanschlüsse mit einem Durchmesser von 3 mm Biopsie Punch. Arbeiten auf einer dunklen Oberfläche, bei guten Lichtverhältnissen und mit den mikrostrukturierten Merkmale nach oben, um die Ausrichtung der Häfen mit den mikrofluidischen Kanälen unterstützen.
  2. Überprüfen Sie das Gerät Partikel. Mit umkehrbarer Klebeband entfernen diese.
  3. Mikrofluidschaltung unter Verwendung eines Dünn PDMS-Schicht auf einem Deckglas montiert eingekapselt: Diese werden durch Gießen einer kleinen Volumen (~ 0,5 ml) der PDMS-Härter-Gemisch (10:1, 601) auf der Basis eines flexiblen hergestellt, bakteriologische Klasse Petrischale. Drücken Sie vorsichtig ein Deckglas auf die PDMS-Schicht, legen Sie auf der Herdplatte und thermisch Heilung für ein paar Minuten. Schnell nach dem Abkühlen mit einem Skalpell aus der Petrischale ausgeschnitten und das Deckglas Preis-PDMS-Doppelschicht. Schneiden mit der Schere, wenn nötig.
  4. Plasma Bindung der PDMS-Gerätund Trägerschicht, eine gute Abdichtung zu produzieren: Optimale Bedingungen sind gerätespezifischen. Beispielsweise ein Plasmaofen, der bei 70 W und 40 kHz in einer Sauerstoffatmosphäre 0,2 mbar für 40 Sekunden erzeugt eine ausgezeichnete PDMS PDMS-Bindung. Sobald Plasma behandelt, drücken Sie beide Teile zusammen und lassen für eine Minute, um vollständig Bindung.
  5. Verwenden Sie Silikonschlauch (1,6 mm ID, 3,2 mm AD), um mit Pumpen und Spritzen-Schnittstelle.

3. Biomaterial Strukturierung und Mikrofluidik-Operationen

Die Protokolle für die In-situ-Biomaterial Strukturierung Neuronenkultur und fluidischen Behandlungen sind in Fig. 2 dargestellt.

Figur 2
2. Illustrated mikrofluidischen Protokolle. A) PL und PLL-g-PEG Strukturierung; Zugabe des Zellhaftschicht (z. B.PL, grün), mit der Verdampfung ausgerichtet Herstellung der Wasser Maske B) Atmosphärische Luft Plasmabehandlung der PL ausgesetzt. zwei Antennenstifte verwendet werden, mit der mit einem rosa Stern. C) PBS (blau) Waschen durch Aspiration wird verwendet, um eine Kontaminierung des plasmabehandelten Region mit PL. D) Lieferung von PLL-g-PEG (rot dargestellt Plasma Einführung Antenne ) durch Aspiration zum Beschichten der plasmabehandelten Bereiche E) für Zellen. gleichzeitige mikrofluidischen Anordnungs von Neuronen zu beiden flankierenden Fächer durch Aspiration, F) Medien (pink) Perfusion mit der hydrostatischen getriebenen Strömung G) Isolierte fluidischen Behandlungen. Behandlung von peripheren einem Testmittel (schwarz) von der Unterseite flankierenden Einlass geliefert durch Aspiration und H) zentrale Behandlung von unten zentralen Einlass durch Aspiration ausgeliefert. Abbildung und Legende wiedergegeben mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry(RSC) 12. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Unmittelbar nach der Plasma Verbinden der PDMS mikrofluidischen Kanälen stark hydrophil sind (Kontaktwinkel ≤ 5 °). Solche Oberflächen sind für die Adhäsion und die Kultur von Zelllinien, wie differenziert menschlichen SH-SY5Y-Neuronen-ähnliche Zellen. Für die ex vivo-Kultur von primären Neuronen und die Kultur von neuronalen Vorläuferzelllinien, wie der menschliche Lund Mesencephalon-Zelllinie (LUHMES) einem Polyamin Beschichtung entweder Polylysin (PL) oder Polyornithin (PO), wird als eine elektrostatische Anker erforderlich. Neben Haftproteine ​​wie Laminin oder Fibronectin werden oft als Integrin-Schnittstelle Beschichtung erforderlich. Allerdings sind die PL-und PO-Beschichtungen binden leicht Neuronen behindern die mikrofluidischen Lieferung an den Array-Sites und auch imposante unerwünschte Scherspannungen. Um dieses Problem zu lösen, in dem Chip BiomaterialStrukturierung erforderlich ist, um die Haftung Materialien an den Fangstellen und den Auswuchs Mikrokanäle zu lokalisieren. Dies fördert auch die Entwicklung von inter-Fach-Verbindungen und reduziert die lokale Verschränkung. Das Protokoll schließt auch die Zugabe von PEG-Materialien zu benachbarten Bereichen zu gewährleisten, Proteine ​​und Neuronen während längerer Kultur zu den gewünschten Stellen beschränkt. Das folgende Protokoll ist in Fig. 3 dokumentiert:

Fig. 3
Abbildung 3. Wasser Maskierung für Biomaterial Strukturierung durch Plasma Schablonieren. A) Illustration des Wasser Maskierung mit den PDMS Mikrosäulen Pinning die Wassermeniskus im Ort für Plasma-Schablonieren. Krümmung des Meniskus in der vertikalen Ebene vernachlässigt wurde. B) Wasser Maske mit einem roten Farbstoff sichtbar gemacht und durch Meniskus p positioniertInning. C) Die strukturierte PL-FITC Beschichtung nach der Plasma Schablonieren. D abgebildet) Zugabe von Protein-und Zell Ablehnung abweisend PLL-g-PEG-TRITC einem Plasma-gemusterten PL-FITC-Beschichtung. Dies wurde für die Registrierung von SH-SY5Y-Zellen und auch zur Strukturierung eine zusätzliche Schicht für Fibronektin LUHMES Zellen verwendet. Abbildung und Legende mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry (RSC) wiedergegeben 12. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

  1. Wasser Maskierung für In-situ-Biomaterial Strukturierung von Plasma Stenciling
    1. Kurz nach der Plasmabindungs ​​Pipette eine 0,5 ul Volumen von PL oder PO (100 ug / ml in 1x PBS) in der unteren Mitte-Port. Innerhalb weniger Sekunden die gesamte Mikrofluid-Kreislauf wird durch Kapillarwirkung gefüllt. Lassen für ein paar Minuten vollhydrophile Beschichtung der Oberflächen mit dem PDMS polyAMinen.
    2. Entfernen ungebundenen Polyaminmoleküle durch Aspiration getriebenen Waschen mit 1x PBS (siehe Abbildung 2C) für 1 min.
    3. Entfernen Sie alle PBS von den Häfen und erhitzen Sie das Gerät durch die Beleuchtung mit einem Mikroskop. Dies erhöht die Verdunstung aus den Ports für schnelle Wassermaskenbildung. Das Wasser-Maske (in 3A dargestellt und dokumentiert in 3B) in ca. 5 Min. etabliert.
    4. Überprüfen Sie das Gerät durch Mikroskopie, um sicherzustellen, Wasser Maskierung abgeschlossen ist. Bitte beachten Sie, Reservoir-Strukturen vor der Array-Website werden in der Masken-Design enthalten, um die Stabilität des Wasser Maske (~ 15 min) zu verlängern.
    5. Edelstahlstifte in den Häfen (2B). Diese werden von einem Paar der Atmosphärendruck-Handkoronaentladung oder Tesla-Generator erzeugte Plasma (zB, die bei 2 MHz, 30-kV-Signal) 19,20 in die leeren mikrofluidischen Kanälen. Richten Sie die Spitze von Ter Plasma-Quelle in der Nähe der Spitze der ein Stift-und Plasma-Behandlung für den Mikrokanal ≤ 1 sek. Verwenden schlechten Lichtverhältnissen an Plasma Strukturierung beobachten.
    6. Entfernen Sie den Wasser Maske mit einem Waschschritt. Verwenden Sie parallel Aspiration von den oberen drei Ports. Verwenden Sie 4 gleich langen Silikonschlauch mit einer 4-Wege-Adapter an eine Absaugpumpe angeschlossen, um parallel Aspiration zu erreichen. Starten Anspruch und verzichten PBS in die unteren 3 Ports zu PBS durch den mikrofluidischen Schaltkreis zu ziehen. Auf diese Weise ein PDMS-Polyamin Materialkontrast erzeugt wird (siehe Abbildung 3C). Evacuate PBS von mikrofluidischen Kreis und für mehrere Stunden, um die native, hydrophoben Zustand wiederherzustellen. Dies macht die PDMS vollständig nicht-permissiven Zellhaftung.
    7. Sollten zusätzliche Haftmaterialien, wie Laminin oder Fibronectin, benötigt die folgenden Schritte erforderlich sind und unmittelbar nach der Entfernung des Wassers Maske sollte getan werden: Pipette 10 ul Volumen der Pfropfcopolymer Poly-L- Lysin-poly (ethylenglykol) (PLL-g-PEG, 100 ug / ml in PBS) in die beiden unteren flankierenden Kanäle und anschließend durch Absaugen von der oberen flankierenden Kanäle für 2 min.
    8. Ohne Unterbrechung des Flow, überschüssige PLL-g-PEG durch Austausch mit einem PBS-Puffer. Diese Schichten selektiv die nicht-Polyamin-beschichteten Bereiche mit der PEG-Einheit wirkt, um die Proteinadsorption und Zelladhäsion 17,21 verhindern.
    9. Haftproteine ​​wie Laminin oder Fibronectin kann dann co-lokalisiert mit dem Poly-Amin-Beschichtung werden: Je 10 ul-Volumina dieser ECM-Proteine ​​(typischerweise 10 ug / ml) in allen drei unteren Ports. Absaugen aus den Top drei Ports, bis das Gerät mit der Proteinlösung gefüllt und Inkubation für 1 Stunde, um eine gute Qualität Beschichtung herzustellen.
    10. Entfernen Sie überschüssige Proteine ​​durch Absaugen PBS von den unteren 3 Ports.
  2. Mikrofluidik-Einzel Neuron Arraying
    1. Prime die Geräte mit entspreaß Medien. In 20 ul-Volumina zu den unteren 3 Ports und durch parallele Streben von den oberen drei Ports schnell füllen die Mikrofluidik-Schaltung mit Medien. Mit einem 4-Wege-Rohrverbinder zum Koppeln der oberen Ports über 3 gleich langen Silikonschlauch mit einer Saugpumpe.
    2. Mit 20 &mgr; l einer Zellsuspension aufgeschlüsselte (1 x 10 6 Zellen / ml) in jede der flankierenden Einlassöffnungen (0, in Fig. 1).
    3. Anlegen einer Absaugpumpe mit einem Durchflussregler oder verwenden Sie eine Spritze für leichtes Ansaugen von den oberen drei Ports. Komplette Neuron Anordnungs erfordert in der Regel 1 min.
    4. Ernten Sie überschüssige Neurone in den vier flankierenden Ports mit einer Pipette zum Ordnen in nachfolgenden mikrofluidischen Systemen bleiben.
    5. Entfernen Sie die Schläuche. Füllen Sie alle Häfen mit Medien und stellen Sie das Gerät in den Inkubator. Innerhalb weniger Stunden werden die Zellen voll haft auf dem Biomaterial-Muster.
  3. Neuron Kultur, Selective Treatment Fluidic und Immunostaining
    1. Tauschen Sie die Medien durch regelmäßige Durchblutung mit hydrostatischen Versorgungs (a 2 mm Säulenhöhe Unterschied ist entsprechend langsam).
    2. Alternativ tauchen die Mikrofluidik-Vorrichtung in Medien, periodisch Austausch der Medien (2-3 Tage) wie bei Standard-Zellkulturen.
    3. Selektive Fluid Behandlungen entweder Neuron Kulturabteil oder der zentralen Neuritenwachstum Raum werden wie folgt erreicht: Dosiernadel 20 &mgr; l der Testsubstanz in die untere Öffnung des Kanals von Interesse und Aspirat vom Port direkt über. Für langwierige Behandlungen reduzieren die Durchflussrate mit einem Durchflussregler und füllt die Testsubstanz als erforderlich.
    4. Immunfärbung Protokolle sind für jeden molekulare Ziel und zugehörigen Reagenzien. Um die potentielle Gefahr der scherinduzierten Schädigung der Neuronen eine langsame Strömungsgeschwindigkeit verwendet entgegenzuwirken. Dies führt zu erhöhten Verarbeitungszeiten vollständig durchströmen die Anlage, die sich normal Protokoll Zeiten. Hystatischen Perfusion über Ports mit unterschiedlichen Höhen Spalte (z. B. von 2 mm) wurde verwendet, um Reagenzien zu liefern. Mehr schnelle Zugabe von Reagenzien und Entfernung mit Hilfe einer Pumpe kann zur experimentellen Zeitskalen zu reduzieren. Schließen Sie eine Saugpumpe zu den oberen 3 Ports Reagenzien von den unteren 3 Ports zu ziehen.

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Representative Results

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Wasser Maskierung Exploits Oberflächenspannung. Die Drucktoleranz an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche skaliert invers mit dem Krümmungsradius [ , Herstellung hochstabiler Schnittstellen an mikrofluidischen Dimensionen. Die Mikrosäulen das Wasser effektiv zu verankern Maske an Ort und Stelle. Wassermaskenbildung wird durch Verdunstung aus den mikrofluidischen Häfen getrieben, mit der Rate erhöht durch Erhitzen. Mit der Wärme aus geringer Vergrößerung (4X - 10X) Mikroskopie Beleuchtung wurde das Wasser in der Regel Maske Gründung in ≤ 5 min. Die Verdampfung führt auch zu den späteren Zusammenbruch der Wasser-Maske. Um die Lebensdauer des Wasser Maske zu erhöhen, um ~ 15 min (praktisch für Plasma Schablonieren), 18 nl Reservoir Strukturen vor den Fächern Kultur positioniert. Die Rate der Wassermaskenbildung und reduzieren können variieren und intermittierende Beobachtung wird empfohlen, einen geeigneten Zeitraum für Plasma-t identifizierenEHANDLUNG. Dennoch können mehrere Geräte gleichzeitig hergestellt werden.

Plasma Schablonen erfordert ~ 1 sek. Die Verwendung von längeren Behandlungen verdampft das Wasser Maske, was zu übermäßigen Plasma Zerfall der Polyamin-Beschichtung. Anlässlich unzureichend Plasmabehandlungsergebnisse, so dass intakte Polyamin Beschichtungen auf der angrenzenden Wand des Mikrokanals (siehe Abbildung 3D), die Haftung Neuron 12 unterstützen können. Trotzdem hatte angeordnet Maus kortikalen Neuronen eine Strukturierung Wirkungsgrad von 89,5% 12 folgenden Kultur für 6 Tage. Diese Effizienz entspricht PL / PEG-Muster auf planaren Substraten. Biomaterial Strukturierung hat den weiteren Vorteil der Förderung der Auswüchse in die Mikrokanäle Neuriten. Biomaterial mit Muster Auswüchse in ~ 90% der Mikrokanäle verlängert, während mit einer kontinuierlichen Beschichtung Auswuchs Polyamin-Spiegel wurden auf ~ 70%. Mit kortikalen Neuronen wurde von 7 Tagen nach In-Chip-Kultur für den entwachsen erforderlichths beide Abteile (ein Abstand von 500 &mgr; m) umfassen. Differenzierte menschlichen SH-SY5Y-Neuronen hatten höhere Auswuchs Raten, Verbindungsaufbau in 4-6 Tagen. Cortical, LUHMES und SH-SY5Y-Neuronen für bis zu 2 Wochen kultiviert. Dies ist ausreichend lang für spontane elektrophysiologische Funktion erreicht werden soll und kann indirekt durch Ca 2 +-Imaging gemessen werden. Dies würde die weit verbreitete Anwendbarkeit des Biomaterials Strukturierung und Anordnungs mikrofluidischen Methoden zur Festlegung funktioneller neuronaler Netzwerke validieren.

Die Meniskus-Pinning Strukturen haben jedoch Neuriten fördern Verstrickung (siehe Abbildung 4C). Edge-Befund ist ein gemeinsames Merkmal der Axone auf mikrostrukturierten Oberflächen 22 kultiviert. Um solche Verheddern zu verhindern und die Bildung von inter-Fach-Verbindungen weiter zu fördern, können Meniskus-Pinning Säulen mit der Mikrokanalwand (dh nicht mehr freistehend) zusammengeführt werden. Zusätzlich Auswüchsein der zentralen mikrofluidischen Kanal kann desorganisiert werden. Für Experimente erfordern lineare Zusammenhang, kann der zentrale Kanal entfernt werden (siehe die Maske Entwürfe in Dinh et al. 12. Zusatzinformation). Diese Schaltung erfordert Serienanordnungs der ersten Kammer, gefolgt von einem Punkt (z. B. 4 Stunden) für die Zelladhäsion oder sogenannte zellulare Ventilschaltung 14, die permissiv für die Anordnungszellen in der zweiten Kammer übertragen.

Die Mikrofluidik-Schaltung bietet vorprogrammierte fluidischen Operationen. Die unterschiedlichen Funktionen werden durch die Wahl der Port entschlossen, Reagenzien oder Schnittstelle mit Schlauch oder Tipps zu laden. Damit entfällt die Notwendigkeit für komplexe, kostspielige und Raum anspruchsvolle Rückkopplung gesteuert Instrumentierung die Technik sehr zugänglich für die Neurobiologen zu machen. Schaltungsentwicklung hängt entscheidend von optimalen relativen Abmessungen für die Erreichung mikrofluidischen Anordnen 12-14. Kleine Veränderungen können die Kreis verhinderncuit aus funktioniert, und wir daher empfohlene Anfangs Adopters der Protokolle zur Verwendung der frei verfügbaren Designs 12 zu machen. Mit einem optimalen Schaltungs ist mikrofluidischen einziges Neuron Anordnungs schnelle, mit ~ 100 Neuronen in jeder Kulturkammer in weniger als 1 min angeordnet. Trotz der begrenzten Anzahl von Neuronen, die lokale Dichte noch entspricht Standardkulturen ausreichende Lebensgrundsignalpegel bereitzustellen. Wie in 4B dokumentiert dieser Ansatz effektiv ergibt ein Neuron pro Falle (1,14 ± 0,09) 12. Allerdings sind nicht alle Neuronen angeordnet. Mikrofluidische Schaltung erzeugt parallele Stromlinien derart, daß Neuronen in den äußeren Bereichen der laminaren Strömung der Ankunft auf dem Serpentinenkanal fortzusetzen. Dennoch ist die vorgestellte System ist von 10 bis 100-fach mehr wirtschaftlich mit Zellen als bestehende teilten Systemen. Vertrieben Zellen können von den Anschlüssen und Leitungen geerntet werden. In Zukunft entwirft, stromaufwärts deterministische seitliche VerschiebungStrukturen 23 kann verwendet werden, um alle Zellen in der Anordnungs abzulenken optimiert für absolute Mobilwirtschaft.

Fig. 4
4. Mikrofluidische Neuron Anordnungs. A) Manuelle Aspiration mit der Spritze wird zur schonenden Neuron Anordnungs verwendet. Ein 4-Wege-Schlauchanschluss wird verwendet, um die Spritze mit den oberen 3 Anschlüsse für die gleichzeitige Neuron Anordnen in beiden Fächern zu verbinden. B) Differenzierte Neuron-ähnlichen menschlichen SH-SY5Y-Zellen und anderen Neuronen sind mit Einzelzellengenauigkeit (ein Neuron pro Falle aufgereiht ). C) folgenden 5 Tagen Kultur Neuriten Erweiterungen verbinden die beiden Kulturen. Kerne mit DAPI gefärbt und Aktin-Immunfärbung wurde verwendet, um die Auswüchse visualisieren. Geändert Figur und Legende wiedergegeben mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry (RSC) Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Ein Schlüsselmerkmal des teilten Systemen ist die Fähigkeit, selektiv zu behandeln einzelne Zellpopulationen, um Material Handel und Langstrecken-Signalisierung zu untersuchen. , Methoden in der Literatur sind aber entweder unzureichend für fluidische Trennung oder schlecht beschrieben. Der fluidische Trennung Methode, die wir entwickelt haben, ermöglicht die schnelle Lieferung (<1 min) von Testsubstanzen und anhalt fluidische Trennung (> 1 Stunde) 12. Ergebnisse sind in Fig. 5 dokumentiert. Diese Fähigkeit wird durch die Kombination der Schaltungsentwurf und Aspiration unter Verwendung der Prüfsubstanz liefern ermöglicht. Dies steht im Gegensatz zu Fluidinjektions Verwendung entweder einer Spritzenpumpe durch hydrostatischen Versorgungs. Trotz der hohen Strömungswiderstand der Neuritenauswuchs Kanäle, produzieren diese Methoden Konvektion Pfade tHut schnell zerstreuen Testsubstanzen und verunreinigen das gesamte Gerät. Aspiration aus dem oberen Port interagiert auch mit Flüssigkeit in der gesamten Schaltung (eine Funktion im Mittelpunkt der differentiellen Widerstand Anordnungsprinzip). In dieser Betriebsart sind Medien von anderswo in der Schaltung gezogen wird, um die Testsubstanz anstelle von Dispergiermittel zu verdünnen. Angesichts der extremen Strömungswiderstand (relativ) der Neuritenwachstum Kanälen ist das Niveau der Verdünnung unbedeutend. Für Experimente BRINGT die Einrichtung von Diffusionsgefälle kann die Aspiration Verfahren zur selektiven Behandlung von einem Fach, mit Durchflusseinstellung verwendet werden, um die zeitabhängige Entwicklung der chemischen Gradienten zu initiieren.

Figur 5
Abbildung 5. Selektive fluidische Anwendungen. A) Aspiration gesteuerte selektive Behandlungen von ter zentrale und B) flankieren Fächern. Der Pfeil gibt die Single-Port zum Absaugen verwendet. Die Behandlungen wurden in 1 min (rote Linie) etabliert und wurden für die Dauer des Experiments gehalten wird; 60 min (blaue Linien). Geändert Figur und Legende mit Genehmigung der Royal Society of Chemistry (RSC) 12 wiedergegeben. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Discussion

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Die mikrofluidische Anordnungs Technik ist die erste ihrer Art, die Präzision einzelnen Neurons Handhabung für die Einrichtung minimalistisch Kulturen ermöglicht. Mit der in-situ-Biomaterial-Strukturierungsverfahren, einem leistungsfähigen Ansatz zur Zellmuster mit mikrofluidischen Strukturen auszurichten Gekoppelt sind diese minimalistischen Kulturen Hoch intercompartment Connectivity-Level mit eingeschränkter lokale Verschränkung. Diese Merkmale können für die effiziente Untersuchung von interFach Übertragung verwendet werden, und mit einfachen Konstruktionsänderungen haben das Potenzial, einzelne Axone zur Visualisierung und quantitativen Analyse zu isolieren. Zum Beispiel, in der nächsten Generation entwirft die Dreizack-Strukturen können mit einem Auswuchs Kanal pro Neuron ersetzt werden, um die Wahrscheinlichkeit von Mehrfach Axone bilden Bündel reduzieren. Diese Fähigkeiten können erheblich profitieren eine Vielzahl von neurowissenschaftlichen Anwendungen, darunter; nanopartikulären Toxizität 24 und Mangan Ausbreitungs 25, Tätigkeit synnisa in der Epilepsie, der Verbreitung von Infektionserregern wie Prionen 26, Beta-Amyloid (Ab)-Übertragung in der Alzheimer-Krankheit 9, und alpha-Synuclein bei der Parkinson-Krankheit 27.

Eine weitere offensichtliche Vorteil des mikrofluidischen Anordnungsverfahren ist die Möglichkeit, die Forschung mit geringer Häufigkeit Neuron Sub-Populationen statt komplexen heterogenen Kulturen zu unternehmen. Zum Beispiel sind dopaminergen Substantia nigra-Neuronen für Parkinson-Forschung oder peripheren Neuronen, die nur in geringen Mengen isoliert werden kann, immer noch ausreichend für die Replikation Studien mit dem Mikrofluidik-Plattform. Andere seltene Zellanwendungsbeispiele sind die Untersuchung der Grundlage von Hörverlust Verwendung einer experimentellen Anordnung der Haarzellen co-kultiviert mit Spiralganglienneuronen oder Studien mit induzierten pluripotenten Stammzellen von Menschen. Auch die niedrige Zell Anforderungen des Systems machen esohne weiteres möglich, Experimente mit Neuronen aus dem Miniatur Drosophila melanogaster Gehirn 28 verpflichten und so nutzen die Vorteile dieser leistungsstarken genetisches Modell.

Die andere Perspektive ist der Pragmatismus von Mobilwirtschaft und dem kleinen Gerät Platzbedarf, hohe Durchsatzforschung überschaubar macht. Jeder Zustand und erfordert nur minimale Wiederholungs Neuronen, eine Funktion, die verwendet werden können, enorm reduzieren Tierzahlen im Einklang mit dem laufenden 3R-Initiative. Zum Beispiel können Dosis-Antwort-Analyse einer großen Gruppe von Verbindungen mit einer einzigen Tieres angewandt werden. Wandtypen sind Toxizitätstests und die Untersuchung von Bibliotheken von siRNA oder pharmakologische Wirkstoffe auf ihre Wirkung auf Langstreckenhandel und Signaltransduktion. Zusammenfassend sind die beschriebenen Protokolle erweitern die Reichweite des experimentellen Neurowissenschaftler und bietet das Potenzial, hoher Durchsatz, quantitative und Statistik liefernVerbündeter leistungsfähige Daten mit Einzel-und subzellulärer Auflösung. Diese und die vielen anderen großen Entwicklungen auf dem Gebiet der Neurowissenschaften werden neue Einblicke in die Mechanismen der neuronalen Entwicklung und Funktion, sowie pathologischen Prozesse, die zu Krankheit führen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Die Autoren sind dankbar, dass Ulrich Marggraf (ISAS) für SU-8-Herstellung und Maria Becker (ISAS) für SEM-Bildgebung. Die Forschung wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), ein Bundesministerium für Bildung und Forschung Zuschuss (BMBF 0101-31P6541) und vom Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen unterstützt. Heike Hardelauf dank der Internationale Leibniz Graduate School "Systems Biology Lab-on-a-Chip" für finanzielle Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

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References

  1. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74, (10), 4516-4519 (1997).
  2. Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93, (1), 1-12 (1982).
  3. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
  4. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 559-565 (2005).
  5. Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
  6. Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84, (15), 6444-6453 (2012).
  7. Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
  8. Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10, (16), 2083-2092 (2010).
  9. Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108, (9), 2241-2245 (2011).
  10. Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3, (6), (2008).
  11. Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85, (13), 6220-6233 (2011).
  12. Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13, (7), 1402-1412 (2013).
  13. Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, (4), 1146-1151 (2007).
  14. Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11, (2), 231-237 (2011).
  15. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78, (14), 4925-4930 (2006).
  16. Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
  17. Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11, (16), 2763-2771 (2011).
  18. Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
  20. Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395, (3), 601-609 (2009).
  21. Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
  22. Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311, (2), 307-316 (2005).
  23. Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304, (5673), 987-990 (2004).
  24. Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
  25. Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169, (3), 238-248 (2000).
  26. Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25, (21), 5207-5216 (2005).
  27. Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32, (34), 11750-11762 (2012).
  28. Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8, (5), 958-965 (2013).
Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision
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Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

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