Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Utarbeidelse av Neuronal Co-kulturer med Single Cell Precision

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

Protokoller for enkelt nevron microfluidic Oppstillings og vann maskering for i-chip plasma fordelingen av biomateriale belegg er beskrevet. Meget sammenhengende co-kulturer kan være forberedt på å bruke minimalt med celle innganger.

Abstract

Microfluidic utførelser av Campenot kammeret har tiltrukket seg stor interesse fra nevrovitenskap samfunnet. Disse sammenhengende co-kultur plattformer kan brukes til å undersøke en rekke spørsmål, som strekker seg over utviklingsmessige og funksjonelle nevrobiologi for smitte og sykdom forplantning. Men konvensjonelle systemer krever betydelige cellulære innganger (mange tusen per rom), utilstrekkelig for å studere lav overflod celler, slik som primær dopaminerge substantia nigra, spiral ganglier, og Drosophilia melanogaster nevroner, og upraktisk for høy gjennomstrømming eksperimentering. Den tette kulturer er også svært lokalt viklet, med noen utvekster (<10%) sammenhengende de to kulturene. I dette papiret enkle microfluidic og mønster protokoller er beskrevet som løse disse utfordringene: (i) en microfluidic enkelt nevron arraying metode, og (ii) en vann maskering metode for plasma mønster biomateriale belegg for å RegiSter nevroner og fremme utvekst mellom avdelinger. Minimalistic neuronale ko-kulturer ble fremstilt med høyt nivå (> 85%) intercompartment tilkobling og kan anvendes for høy gjennomstrømning neurobiology forsøk med enkeltcelle presisjon.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nevronale vev er svært sammensatt; en heterogen celle blanding som er romlig organisert innenfor definerte lag og avdelinger, og med plast tilkobling via celle kontakter og spesielt via axon og dendrite utvekster. Nye teknikker er nødvendig for å gi større eksperimentell frihet til å få dypere innsikt og avdekke mekanismene er sentrale for sykdom, utvikling og sunn funksjon. Den Campenot kammeret 1,2 og mer nylig microfabricated utførelses 3,4 kan anvendes for ex vivo fremstilling av nettverks neuronale ko-kulturer med evne til selektivt å forstyrre de forskjellige somatiske populasjoner og også deres neurite utvekster. Disse microfluidic enheter har for eksempel blitt brukt til å studere axon degenerasjon og regenerasjon følgende kjemiske 5,6 eller laser axotomy 6-8, tauopathy 9, viral spredning 10,11, og mRNA lokalisering i axons fire.

ent ">

For å utvide rekkevidden av nevrobiologer, er den teknologiske utviklingen som kreves for å forberede minimalis nevrale co-kulturer. Dette gjør det mulig floke av nevronale nettverk for etterforskningen av systemet med én celle og sub-cellulære presisjon. Kravet til minimale celletall åpner muligheten for å analysere sjeldne celletyper, inkludert substantia nigra dopaminerge celler som er relevante for Parkinsons sykdom, spiral ganglia fra øret, perifere nerveceller, og stamceller. Utover dette, er mobilnettet økonomi relevant for 3Rs initiativet. Ved hjelp av disse microfluidic plattformer, storskala toksisitets skjermer eller annen høy gjennomstrømning, kan data rik eksperimentelle serien krever dyre nevroner nå vurderes.

I dette papir protokoller for fremstilling og bruk av en mikrofluidenhet er beskrevet. Microfluidic Oppstillings i kombinasjon med en in situ biomaterial mønster metoden kan brukes for registrering av sterkt sammenhengende neuronale ko-kulturer ved bruk av minimale antall celler. Microfluidic oppstillings er basert på en differensialstrømnings tilnærming 12-15, idet mikrostrukturerte feller er plassert innenfor et fluidic krets (illustrert sammen med SEM-bilder i figur 1). Banen 0 → 1 har det nedre fluidic motstand (R 2> R 1) for transport av neuroner på en lineær oppstilling av mikrostrukturerte åpninger - inntakene til de neurite utvekst kanaler. Occupancy av fellen av en enkelt celle lokalt hindrer flyten å avlede strømlinjene for fangst påfølgende celler i nabo feller. Fullstendig belegg av fellene i matrisen kopler fluidic forholdet (R1> R 2) for å avlede strømlinjene i det serpentinbane (0 → 2) for å frembringe en bypass-modus for operasjonen for fjerning av overskytende neuroner.


Figur 1 Microfluidic Circuit.. A) Den differensielle motstand fluidic krets for enkelt neuron oppstillings, med flankekulturkamre sammen av neurite utvekst kanaler. B, C) ​​SEM bilder av bilayer compartmentalized neuron ko-kultur matrise med menisk låsing micropillars. Med denne designen, ble Trident-formet nevron fangst strukturer brukes til å fremme Fascikulasjoner av neurite utvekster. Figur og legende gjengitt med tillatelse fra Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Klikk her for å se større bilde.

Fremstillingen av micropatterned nevrale nettverk på plane underlag kan lett oppnås (for exampl es fra vår gruppe, se Frimat et al. 16 og Heike et al. 17). Men innkapsle bioaktive materielle mønstre innen PDMS-enheter og med kravet om mikrometer-skala justering av disse til microfluidic kanalene utgjør en stor teknisk utfordring. I avsnitt 3.1 en protokoll for i-chip, eller in situ, utarbeidelse av biomateriale mønstre presenteres. Disse mønstrene gjør at nervecellen registrering under langvarige kultur tidsrammer og fremme utvekster mellom avdelinger. Menisk-låsing mikrostrukturer brukes til å justere en såkalt vann maske med nervecellen arraying nettsteder og neurite utvekst kanaler. Vannet masken beskytter adhesjonsmolekyl belegg under plasmabehandling, mens det eksponerte overflater er oppløst for å definere biomateriale mønster. I tillegg er protokoller levert for cellekultur, og for fluidic isolasjon som er nødvendig for selektiv behandling av de forskjellige ko-kultur seksjonene.

ve_content "> er Protokollene utviklet for å utnytte brukervennlige prinsipper for myk litografi for replikering av poly (dimethylsiloxane) (PDMS) microfluidic enheter 18. Tilsvarende, i situ biomateriale mønster er grei, utnytte fordampning og overflatespenning fenomener, og bare krever en billig håndplasmakilde. microfluidic kretsen effektivt programmer celle lasting og kupé spesifikke behandlinger gjør disse operasjonene bare et spørsmål om dispensermaterialer inn i riktig bunn port og aspirere ovenfra. På denne måte er det til hensikt å gi neurobiologists frihet til å forberede og bruke microfluidic enheter i egne laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollene er ment for nevrologer, og er oppsummert i Figur 2. Som sådan er det anbefalt at microfabrication av SU-8 mestere som brukes for PDMS replikering er outsourcet til kommersielle eller institusjonelle fasiliteter. De to lag maske design er fritt tilgjengelig som tilleggsinformasjon (ZIP) på Royal Society of Chemistry nettside 12. Viktigere, bør den første SU-8 lag fremstilles til en dybde på 2,5 til 3,0 mikrometer, og den andre til en dybde på 25 til 30 mikrometer. Dette er sentrale dimensjoner som er nødvendige for effektiv nevron Oppstillings. Det 3 mikron høydebegrensningen er også nødvendig å forhindre at nerveceller som transporteres eller migrere mellom de to kamrene 12.

En. Microfluidic Device Replication i PDMS

  1. Bland PDMS forpolymer grundig med herdemidlet (184) i et forhold på 10:01, og avgassing av blandingen i en vakuum-eksikator for vanligvis 20 min. Alternativt, legg blandingenratur i 50 ml Falcon rør og bruke lav g sentrifugering for avgassing.
  2. Plasser to-lags Microstructured SU-8 wafer på en 80 ° C kokeplate og justere polymer rammer til hver enhet på wafer. Hell PDMS i rammene til en dybde på 5 mm og ≥ tillate> 1 time for å sikre fullstendig termisk herding.
  3. Når herdet, fjerner wafer fra kokeplaten og la den avkjøles på en flat overflate.
  4. Bruk vernebriller og arbeid fra ett hjørne (bort fra SU-8 mikrostrukturer) med en stiv skalpell til å forsiktig premien rammen og PDMS fra wafer.
  5. Fjern PDMS mold fra rammen og bruke en saks til å klippe enheten av overflødig PDMS. Denne såkalte blink blir ofte fremstilt ved en tynn film av PDMS forskjellene mellom polymerramme og skivens overflate.
  6. Gjenværende PDMS kan påføres på hele skiven og herdet for å beskytte skiven under lagring. Fjern dette før etterfølgende enhet molding, og dermed fjerne partikulere forurensninger fra overflaten.

2. Device Montering og samtrafikk

  1. Forbered de seks grensesnittporter ved hjelp av en 3 mm diameter biopsi punch. Arbeidet med en mørk overflate, i gode lysforhold og med de mikrostrukturerte funksjoner vendt oppover for å hjelpe til justering av portene med microfluidic kanaler.
  2. Inspiser enheten for partikler. Fjern disse ved hjelp av reversible teip.
  3. Den mikrofluidkretsen er innkapslet ved hjelp av et tynt sjikt PDMS montert på en glass dekkglass: Disse fremstilles ved å helle et lite volum (~ 0,5 ml) av PDMS-herdemiddel-blanding (10:01, 601) inn i bunnen av en fleksibel, bakteriologisk klasse petriskål. Trykk forsiktig et dekkglass på PDMS lag, legg på varmeplaten og termisk kur for noen få minutter. Raskt etter avkjøling, bruke en skalpell til å kutte ut og premien dekk-PDMS dobbeltlag fra petriskål. Trim med saks om nødvendig.
  4. Plasma obligasjon PDMS enhetog støttelaget for å gi en god tetning: Optimale betingelser er bestemt instrument. For eksempel frembringer en plasma ovnen opererer ved 70 V og 40 kHz i en 0,2 mbar oksygenatmosfære i 40 sekunder en utmerket PDMS-PDMS binding. Når plasma behandlet, trykk begge deler sammen og la stå i et minutt til fullt obligasjon.
  5. Bruk silikonslanger (1,6 mm ID, 3,2 mm OD) å grensesnitt med pumper og sprøyter.

Tre. Biomateriale Mønster og Microfluidic Operations

Protokollene for in situ biomateriale mønster, neuron kultur og fluidic behandlinger er illustrert i figur 2.

Fig. 2
Figur 2. Illustrert microfluidic protokoller. A) PL og PLL-g-PEG mønster; tilsetning av celleadhesjon sjikt (f.eksPL, grønn), med fordamping produsere justert vann maske B) Atmosfærisk luft plasma behandling av utsatt PL.; to antenne pinnene er brukt, med plasmaet innføring antennen illustrert med et rosa stjerne. C) PBS (blå) vasking ved aspirering blir brukt til å unngå forurensning av plasmabehandlet region med PL. D) Levering av PLL-g-PEG (rød ) ved aspirasjon å belegge plasmabehandlet regioner E) Cell lasting.; samtidig microfluidic oppstillings av neuroner til begge flankerende rom ved hjelp av aspirasjon, F) materiale (rosa) perfusjon ved hjelp av en hydrostatisk drevet strømning G) Isolerte fluidic behandlinger.; perifer behandling av et testmiddel (sort) levert fra bunnen flankerende innløp ved aspirasjon og H) sentrale behandlings levert fra bunnen sentralt innløp ved aspirasjon. Figur og legende gjengitt med tillatelse fra Royal Society of Chemistry(RSC) 12. Klikk her for å se større bilde.

Umiddelbart etter plasma liming av PDMS microfluidic kanalene er svært hydrofile (kontakt vinkel ≤ 5 °). Slike overflater er egnet for adhesjon og kultur av cellelinjer som differensierte SH-SY5Y humane nervelignende celler. For ex vivo-kultur av primære nerveceller og kulturen av neuronal forløper cellelinjer slik som Lund mesencephalic human cellelinje (LUHMES) et polyamin-belegg, enten polylysin (PL) eller polyornithine (PO), er nødvendig som en elektrostatisk anker. I tillegg adhesjonsproteiner som laminin eller fibronectin er ofte nødvendig som integrin-grensesnitt belegg. Men PL og PO belegg lett binde nevroner, hindrer microfluidic levering til tabellsider og også imponerende uønskede skjærspenninger. For å løse dette problemet i-chip biomaterialemønster er nødvendig for å lokalisere vedheft materialene til den felle nettsteder og utvekst microchannels. Dette fremmer også utviklingen av inter-kupé tilkoblinger og reduserer lokale forviklinger. Protokollen innebærer også tillegg av PEG materialer til nærområder å sikre proteiner og nevroner er begrenset til de ønskede steder under langvarig kultur. Er dokumentert Den følgende protokoll i figur 3:

Figur 3
Figur 3. Vann maskering for biomateriale mønster av plasma spraye. A) illustrasjon av vannet maskeringsprosess med PDMS micropillars låsing vann-menisken i stedet for plasma spraye. Krumning av menisken i vertikalplanet er blitt neglisjert. B) Vann maske visualisert med et rødt fargestoff, og posisjonert ved menisken pinning. C) Den mønstrede PL-FITC belegg fotografert etter plasma spraye. D) Tilsetting av protein avvise og celleavvisende PLL-g-PEG-TRITC til en plasma-mønstrede PL-FITC belegg. Dette ble anvendt for registrering av SH-SY5Y-celler, og også for mønster ytterligere fibronektin lag for LUHMES celler. Figur og legende gjengitt med tillatelse fra Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Klikk her for å se større bilde.

  1. Vann Maske for In situ Biomateriale Mønster av Plasma Spraye
    1. Kort tid etter at plasmabinding pipette et 0,5 ul volum av PL-eller PO (100 pg / ml i 1 x PBS) inn i bunnmidtporten. I løpet av få sekunder hele mikrofluidkretsen er fylt ved kapillærvirkning. La stå i noen minutter på en fullstendig strøk den hydrofile PDMS overflater med polyagruver.
    2. Fjern ubundne polyamin-molekyler ved inhalering drevet vasking med 1 x PBS (se Figur 2C) i 1 min.
    3. Fjern alle PBS fra havnene og varme enheten ved belysning med et mikroskop. Dette øker fordampningen fra portene for hurtig vannmaskedannelsen. Vannet maske (illustrert i figur 3A og dokumentert i figur 3B) er etablert i ~ 5 min.
    4. Inspiser enheten ved mikroskopi for å sikre vannmaskering er fullført. Legg merke til reservoarstrukturer oppstrøms i matrisen område inngår i masken utforming til å forlenge stabiliteten av vann maske (~ 15 min).
    5. Sett rustfritt stål pinner inn i portene (figur 2B). Disse brukes til å feste plasmaet genereres ved en atmosfæretrykk håndholdt koronautladning eller Tesla generator (som opererer ved 2 MHz, 30 kV signal) 19,20 inn i de ledige microfluidic kanaler. Pek tuppen av tHan plasmakilde nær spissen av en pinne-og plasma behandle microchannel for ≤ 1 sek. Bruk dårlige lysforhold for å observere plasma mønster.
    6. Fjern vann maske med et vasketrinn. Bruk parallell aspirasjon fra de øverste tre porter. Bruk 4 like lengder av silikonslange forbundet med en fire-veis-adapter til en aspirasjonspumpe å oppnå parallell aspirasjon. Begynn aspirasjon og dispensere PBS inn de nederste tre porter for å trekke PBS gjennom microfluidic krets. På denne måte kan en PDMS-polyamin materiale kontrastfremstilles (se figur 3C). Evakuer PBS fra microfluidic krets og la stå i flere timer for å gjenopprette den opprinnelige, hydrofobe tilstand. Dette gjengir PDMS fullt ikke-permissive til celleadhesjon.
    7. Skulle ytterligere adhesjons materialer, slik som laminin og fibronektin, være nødvendig følgende trinn er nødvendige og bør gjøres umiddelbart etter fjerning av vann maske: Pipetter en 10 ul volum av den podede ko-polymer poly-L- Lysin-poly (etylenglykol) (PLL-g-PEG, 100 mikrogram / ​​ml i PBS) i begge bunnflankerende kanaler, etterfulgt av aspirasjon fra øvre flankerende kanaler for 2 min.
    8. Uten å forstyrre flyten, fjerne overflødig PLL-g-PEG ved utveksling med en PBS buffer. Dette selektivt strøk de ikke-polyamin-belagte områder med PEG-gruppen som opptrer for å hindre protein adsorpsjon og celleadhesjon 17,21.
    9. Adhesjonsproteiner slik som laminin eller fibronectin kan da være co-lokalisert med poly-amin-belegg: Pipetter 10 ul volumer av disse ECM-proteiner (typisk 10 mikrogram / ml) i alle de tre nedre porter. Sug fra de tre porter til enheten er fylt med proteinoppløsningen og inkuberes i 1 time for å gi en god kvalitet belegg.
    10. Fjern overflødig proteiner ved å aspirere PBS fra de nederste tre porter.
  2. Microfluidic Enkelt Neuron arraying
    1. Prime enhetene med hensiktsmessigspiste medier. Legg 20 mL volumer til de nederste tre porter og ved parallell aspirasjon fra de øverste tre porter raskt fylle microfluidic krets med media. Bruk en 4-veis rør-kontakt til å koble de tre øvre porter via lik lengde silikonslange til en aspirasjonspumpe.
    2. Tilsett 20 pl av en disaggregert cellesuspensjon (1 x 10 6 celler / ml) til hver av de flankerende innløpsporter (0, i figur 1).
    3. Utstyre en aspirasjonspumpe med en strømningsregulator eller bruke en sprøyte for forsiktig aspirasjon fra de øverste tre porter. Komplett nevron Oppstillings krever vanligvis en min.
    4. Høste overflødig nevroner igjen i de fire flankerer porter med en pipette for arraying i senere microfluidic enheter.
    5. Fjern slangen. Fyll alle porter med media og plassere enheten i inkubatoren. I løpet av noen få timer cellene blir fullt vedheftende til biomateriale mønster.
  3. Neuron Kultur, Selective Fluidic behandling, og-immunnostaining
    1. Utveksle media ved periodisk perfusjon hjelp hydrostatisk fôr (en 2 mm kolonne høydeforskjell er hensiktsmessig treg).
    2. Alternativt, senk microfluidic enheten i media, utveksling av media med jevne mellomrom (2-3 dager) som med vanlige cellekulturer.
    3. Selektive behandlinger fluidic til hver neuron kultur rommet eller den sentrale neurite utvekst rommet er oppnådd som følger: Tilsett 20 ul av forsøksstoffet inn i den nederste port av kanalen av interesse, og aspireres fra porten direkte ovenfor. For langvarige behandlinger reduserer strømningshastigheten ved hjelp av en strømningsregulator og fylle testsubstans som er nødvendig.
    4. Immunostaining protokoller variere for hver molekylære mål og tilhørende reagenser. For å motvirke den potensielle risikoen for skjær-indusert skade på nervecellene en langsom strømningshastighet ble benyttet. Dette resulterer i økt anvendelse ganger for å fullt perfuse systemet, som strekker normale protokoll ganger. Hydrostatic perfusjon ved hjelp av porter med ulik kolonne høyder (for eksempel ved 2 mm) ble brukt til å levere reagenser. Raskere reagens addisjon og fjerning ved hjelp av en pumpe kan benyttes for å redusere eksperimentelle tidsrammer. Koble en aspirasjonspumpe på de øvre tre porter for å trekke reagenser fra de nederste tre porter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Overflatevann maske utnytter spenningen. Trykket toleranse i den luft-væske-grensesnittet skalaer inverst med krumningsradius [ , Produserer svært stabile grensesnitt på microfluidic dimensjoner. De micropillars effektivt forankre vann maske på plass. Vann maskedannelsen er drevet ved fordampning fra microfluidic porter, med frekvensen økes ved oppvarming. Ved hjelp av varmen fra lav forstørrelse (4X - 10X) mikros belysning, ble vannet maske typisk etablering i ≤ 5 min. Fordampning fører også til at eventuell kollaps av vann maske. For å øke levetiden på vann maske til ~ 15 min (praktisk for plasma spraye), 18 nl reservoarstrukturer har blitt plassert oppstrøms av kultur avdelinger. Satsen vann maske dannelse og kollaps av kan variere, og intermitterende observasjon anbefales å identifisere en passende periode for plasma treatment. Likevel kan flere enheter være forberedt samtidig.

Plasma spraye krever ~ 1 sek. Bruken av langvarige behandlinger fordamper vannet maske, som fører til overdreven plasma oppløsning av polyaminet belegg. Noen ganger utilstrekkelige plasma behandlingsresultater, forlater intakte polyaminpolymerer belegg på tilstøtende microchannel veggen (se figur 3D) som kan støtte nevron vedheft 12. Likevel, kledd mus kortikale nevroner hadde et mønster virkningsgrad på 89,5% 12 følgende kultur for 6 dager. Denne effektivitet er ekvivalent med PL / PEG mønstre på plane substrater. Biomateriale mønster har ytterligere fortjeneste av å fremme utvekster inn i neurite microchannels. Med biomateriale mønster utvekster forlenget innenfor ~ 90% av mikrokanaler, mens med en kontinuerlig polyamin belegg utvekst ble redusert til ~ 70%. Ved hjelp av kortikale neuroner, ble 7 dager etter in-chip kultur som kreves for vokseths å strekker seg over to avdelinger (en distanse på 500 mikrometer). Differensiert menneskelige SH-SY5Y nevroner hadde høyere utvekst priser, etablere forbindelser i 4-6 dager. Kortikal, LUHMES og SH-SY5Y nevroner har blitt dyrket i opptil to uker. Dette er tilstrekkelig lang for spontan elektrofunksjon skal oppnås, og kan indirekte målt av Ca 2 +-avbildning. Dette vil validere den utbredte anvendelsen av biomateriale mønster og microfluidic oppstillings metoder for å etablere funksjons nevrale nettverk.

Menisken-låsing strukturer gjør, men fremmer neurite filtring (se figur 4C). Edge funnet er et felles trekk ved axons dyrket på mikrostrukturerte overflater 22. For å hindre slike forviklinger og videre fremme dannelsen av inter-compartment tilkoblinger, kan menisk-låsing pilarer bli slått sammen med microchannel veggen (dvs. ikke lenger frittstående). I tillegg utveksteri den sentrale microfluidic kanal kan være uorganisert. For eksperimenter som krever lineær tilkobling, kan den sentrale kanalen fjernes (se masken design i Dinh et al. 12, utfyllende informasjon). Denne kretsen krever serieoppstillings av det første kammer, etterfulgt av en periode (f.eks, 4 timer) for celleadhesjon, eller så-kalt celle ventiler 14 for å gjengi kretsen givende for arraying celler i det andre kammer.

Microfluidic kretsen gir forhåndsprogrammerte fluidic operasjoner. De ulike funksjonene er bestemmes av valg av porten for å laste reagenser eller grensesnitt med slange eller tips. Dette unngår behovet for komplekse, kostbare og plasskrevende tilbakekoplet instrumentering for å gjøre teknikken svært tilgjengelig til neurobiologists. Kretsdesign er kritisk avhengig av optimale relative dimensjoner for å oppnå microfluidic arraying 12-14. Små endringer kan hindre sirkulaCUIT fra å fungere, og vi derfor anbefalte innledende adopters av protokoller å gjøre bruk av de fritt tilgjengelige design 12. Med en optimal krets, er microfluidic enkelt nevron Oppstillings rask, med ~ 100 nevroner kledd i hver kultur kammer på mindre enn 1 min. Til tross for det begrensede antall av neuroner, er den lokale tettheten fremdeles tilsvarer standardkulturer for å gi tilstrekkelig livsbevarende signalnivåer. Som dokumentert i figur 4B denne tilnærmingen effektivt gir en nervecelle per felle (1,14 ± 0,09) 12. Imidlertid er ikke alle nevroner kledd. Den mikrofluidkretsen genererer parallelle strømlinjene, slik at nerveceller som ankommer i de ytre regioner av laminær strømning fortsetter å serpentin-kanalen. Likevel presenterte systemet er 10-100 ganger mer økonomisk med celler enn eksisterende compartmentalized systemer. Utvist celler kan høstes fra havnene og tubing. I fremtidige design, oppstrøms determinissideveis forskyvningstrukturer 23 kan brukes for å avlede alle celler i oppstillingsstrømlinjeformer for absolutt cellulær økonomi.

Figur 4
Figur 4 Microfluidic nevron Oppstillings.. A) Manuell aspirasjon ved hjelp av en sprøyte brukes for skånsom nevron Oppstillings. En 4-veis rør kontakten brukes til grensesnitt sprøyten med de øverste tre porter for samtidig nevron oppstillingsanordninger i begge avdelinger. B) Differensiert nervelignende menneske SH-SY5Y celler og andre nerveceller er kledd med enkelt celle presisjon (en nervecelle per felle ). C) Etter 5 dagers dyrking, neurite utvidelser forbinde de to kulturer. Atomkjerner er farget med DAPI og aktin farging ble brukt til å visualisere utvekster. Modifisert figur og legende gjengitt med tillatelse fra Royal Society of Chemistry (RSC) Klikk her for å se større bilde.

Et viktig trekk ved compartmentalized systemer er muligheten til å selektivt behandle enkelte cellepopulasjoner for å undersøke materialet trafficking og langtrekkende signalering. Imidlertid, fremgangsmåter som er tilgjengelige i litteraturen er enten utilstrekkelig for fluidic isolering eller er dårlig beskrevet. Den fluidic isolasjon metoden vi har utviklet muliggjør rask levering (<1 min) av teststoffer og langvarig fluidic isolasjon (> 1 time) 12. Resultatene er dokumentert i figur 5.. Denne evnen er muliggjort ved kombinasjonen av kretsteknikk og ved hjelp av aspirasjon for å gi forsøksstoffet. Dette er i motsetning til fluidinjeksjon ved hjelp av enten en sprøytepumpe for mating av hydrostatisk. Til tross for den høye fluidic motstanden i neurite utvekst kanaler, disse metodene produsere konveksjon stier that raskt spre teststoffer og forurense hele enheten. Innåndings fra den øvre port kommuniserer også med væske gjennom kretsen (en funksjon av typen av differensialmotstand arraying prinsippet). Men i denne operasjonsmodus, blir mediene trekkes fra et annet sted i kretsen for å fortynne testsubstans i stedet for å dispergere den. Gitt den ekstreme fluidic motstand (relativ) av neurite utvekst kanaler, er graden av fortynning ubetydelig. Ved forsøk som innebærer etablering av diffusjon gradienter kan metoden aspirasjon brukes til selektivt å behandle en kupé med strømnings avslutning som brukes til å sette i gang den tidsavhengige utvikling av den kjemiske gradient.

Figur 5
Figur 5. Selektive fluidic behandlinger. A) Suge drevet selektive behandlinger av than sentral og B) flankerer avdelinger. Pilen viser den eneste porten som brukes for aspirasjon. Behandlinger ble etablert i 1 min (rød linje) og ble opprettholdt under hele forsøket; 60 min (blå linjer). Modifisert figur og legende gjengitt med tillatelse fra Royal Society of Chemistry (RSC) 12. Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Microfluidic formerings teknikken er den første av sitt slag som gjør presisjon enkelt nevron håndtering for å etablere minimalistiske kulturer. Sammen med in situ biomateriale mønster metode, en kraftig tilnærming for å justere celle mønstre med microfluidic strukturer, disse minimalistiske kulturer har høy intercompartment tilkoblings nivåer med redusert lokal forviklinger. Disse funksjonene kan benyttes for effektiv undersøkelse av inter-transmisjonsseksjonen, og med enkle design modifikasjoner har potensial til å isolere individuelle aksoner for visualisering og kvantitativ analyse. For eksempel, i neste generasjon utformer Trident strukturer kan bli erstattet med en utvekst kanal per nevron å redusere sannsynligheten for flere aksoner danner bunter. Disse egenskapene kan ha stor nytte en rekke nevrovitenskap programmer, inkludert; nanopartikulær toksisitet 24 og mangan forplantning 25, aktivitets synsjons i epilepsi, spredning av smittestoffer som prioner 26, amyloid beta (Ab) overføring ved Alzheimers sykdom ni, og alfa synuclein i Parkinsons sykdom 27.

En annen innlysende fordel med mikrofluidoppstillings metoden er muligheten til å foreta undersøkelser med lav overflod neuron sub-populasjoner i stedet komplekse heterogene kulturer. For eksempel, dopaminerge substantia nigra nevroner egnet for Parkinsons forskning eller perifere nerveceller som bare kan isolert i små tall er likevel tilstrekkelig for replikere studier med microfluidic plattform. Andre sjeldne celle brukseksempler inkluderer etterforskningen av grunnlaget for hørselstap ved hjelp av en eksperimentell arrangement av hårceller co-dyrkede med spiral ganglia nevroner, eller studier ved hjelp av indusert pluripotent stamceller fra mennesker. Likeledes er de lave celle krav til systemet gjør detlett mulig å foreta eksperimenter med nerveceller fra miniatyr Drosophilia melanogaster hjernen 28 og dermed utnytte fordelene av dette kraftige genetiske modellen.

Det andre perspektivet er det pragmatisme av mobilnettet økonomi og liten enhet som gjør høy gjennomstrømming forskning håndterlig. Hver tilstand og replikere krever minimalt med nevroner, en funksjon som kan brukes til enormt redusere dyrenumre i tråd med den pågå 3Rs initiativ. Eksempelvis kan doseresponsanalyse av et stort panel av forbindelser foretas ved hjelp av et enkelt dyr. Typer av skjermen inkludere toksisitetstesting og etterforskningen av biblioteker av siRNA eller farmakologiske midler for deres effekt på langtrekkende menneskehandel og signaltransduksjon. Oppsummert de beskrevne protokoller forlenge den eksperimentelle avstand fra neuroscientist, tilbyr muligheten for å levere høy gjennomstrømning, kvantitative og statistikkalliert kraftige data med singel og subcellulære oppløsning. Dette og mange andre store utbygginger innen nevrovitenskap vil føre til ny innsikt i mekanismene bak neuronal utvikling og funksjon, samt patologiske prosesser som forårsaker sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for Ulrich Marggraf (ISAS) for SU-8 fabrikasjon og Maria Becker (ISAS) for SEM bildebehandling. Forskningen ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), en Bundesministerium für Bildung und Forschung stipend (BMBF 0101-31P6541) og ved Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf takker International Leibniz Graduate School "Systems Biology Lab-on-a-Chip" for økonomisk støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74, (10), 4516-4519 (1997).
  2. Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93, (1), 1-12 (1982).
  3. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
  4. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 559-565 (2005).
  5. Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
  6. Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84, (15), 6444-6453 (2012).
  7. Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
  8. Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10, (16), 2083-2092 (2010).
  9. Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108, (9), 2241-2245 (2011).
  10. Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3, (6), (2008).
  11. Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85, (13), 6220-6233 (2011).
  12. Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13, (7), 1402-1412 (2013).
  13. Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, (4), 1146-1151 (2007).
  14. Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11, (2), 231-237 (2011).
  15. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78, (14), 4925-4930 (2006).
  16. Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
  17. Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11, (16), 2763-2771 (2011).
  18. Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
  20. Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395, (3), 601-609 (2009).
  21. Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
  22. Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311, (2), 307-316 (2005).
  23. Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304, (5673), 987-990 (2004).
  24. Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
  25. Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169, (3), 238-248 (2000).
  26. Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25, (21), 5207-5216 (2005).
  27. Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32, (34), 11750-11762 (2012).
  28. Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8, (5), 958-965 (2013).
Utarbeidelse av Neuronal Co-kulturer med Single Cell Precision
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter