Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Подготовка нейронных сопредседателей культур с одной клетки Precision

doi: 10.3791/51389 Published: May 20, 2014

Summary

Протоколы для одного нейрона микрофлюидных выстроив и воды маскировки для в-чипе плазмы паттерна биоматериала покрытий описаны. Тесно взаимосвязаны со-культуры могут быть получены с использованием входов минимальные клеток.

Abstract

Микрофлюидных варианты камеры Campenot привлекли большой интерес от нейронауки сообщества. Эти взаимосвязанные платформы со-культура может быть использован для исследования разнообразных вопросов, охватывающих с развитием и функциональный нейробиологии к инфекции и распространения заболеваний. Тем не менее, традиционные системы требуют значительных сотовой входы (многие тысячи в отсеке), неадекватные для изучения низкие клетки изобилии, такие как первичной дофаминергической черной субстанции, винтовая ганглиев и Drosophilia MELANOGASTER нейронов и непрактично для высокой пропускной экспериментов. Плотные культуры также весьма локально запутанными, с несколько выростов (<10%), соединяющих две культуры. В этой статье прямые микрофлюидных и паттерна протоколы описаны которые решения этих проблем: (я) микрофлюидных один нейрон метод выстроив, и (II) методом вода маскировка для плазмы паттерна биоматериала покрытия для Regiстер нейроны и способствовать вырост между отсеками. Минималистичные нейронов со-культуры были приготовлены с высокого уровня (> 85%) соединения intercompartment и может быть использован для высокой пропускной нейробиологии экспериментов с точностью одной ячейки.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Нервной ткани является весьма сложным; гетерогенная сотовой смесь, которая пространственно приказал в определенных слоев и отсеков и с пластиковой подключения через сотовые контактов и особенно через аксонов и дендритов выростов. Новые методы, необходимые для придания большей экспериментальной свободу, чтобы получить более глубокое понимание и разгадать механизмы центральные к болезни, развития и нормального функционирования. Campenot камера 1,2, а в последнее микроизготовленном варианты 3,4 могут быть использованы для экс виво подготовки сетевых нейронов совместных культурах с возможностью избирательно возмущают различные соматические популяции, а также их нейритов наростов. Эти микрофлюидных устройства например был использован для изучения аксонов дегенерации и регенерации следующие химической 5,6 или лазерного аксотомии 6-8 tauopathy 9, вирусного распространения 10,11 и мРНК локализации в аксонов 4.

ЛОР ">

Чтобы расширить сферу из нейробиологов, технологические разработки должны подготовить минималистичные нейронные совместно культур. Это позволяет распутывание нейронной сети для исследования системы с одной клетки и субклеточном точностью. Требование минимального количества клеток открывает возможность для анализа редких типов клеток, в том числе дофаминергических черной субстанции клеток, имеющих отношение к болезни Паркинсона, винтовая ганглиев от уха, периферических нейронах, и стволовые клетки. Помимо этого, сотовые экономика имеет отношение к инициативе 3Rs. Используя эти микрофлюидных платформы, крупномасштабные экраны токсичности или других высокую пропускную способность, данные богатых серии экспериментов, требующих нейроны животных теперь можно считать.

В данной работе протоколы для изготовления и использования микрожидкостных устройств описаны. Микрофлюидных выстроив в сочетании с в месте biomateriСпособ рисунка др. могут быть использованы для регистрации сильно взаимосвязанных нейронных совместных культурах с использованием минимального количества клеток. Микрофлюидных упорядоченный массив основан на подходе дифференциального потока 12-15, в результате чего микроструктурированных ловушки расположены внутри контура текучей (на примере вместе с изображениями SEM на фиг.1). Путь 0 → 1 имеет более низкую жидкостный сопротивление (R 2> R 1) для транспортировки нейронов к линейному массиву микроструктурированном отверстий - впускных отверстий на рост аксонов каналов. Заполняемость в ловушку одной клетки локально препятствует потоку, чтобы отвлечь линии тока для улавливания последующие клетки в соседних ловушек. Полное размещение ловушек в массиве переключает жидкостный коэффициент (R 1> R 2), чтобы отвлечь линии тока в волнообразной траектории (0 → 2) для получения обходного режима работы для удаления избыточных нейронов.


Рисунок 1. Микрофлюидных цепи. А) жидкостный контур дифференциальное сопротивление для одного нейрона выстроив, с фланговые культуры камер, соединенных между собой рост аксонов каналов. B, C) ​​СЭМ изображения двухслойной разобщенным нейрона массива сокультуры с мениска закрепления микростолбиков. При такой конструкции, Trident-образный нейрон захвата структуры были использованы для содействия пучками из нейритов наростов. Рисунок и легенда воспроизведена с разрешения Королевского химического общества (RSC) 12. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Подготовка micropatterned нейронных сетей на плоских подложек может быть легко достигнуто (для exampl эс из нашей группы, см. Frimat др.. 16 и Хайке и др.. 17). Тем не менее, инкапсуляции биоактивных материалов паттерны в устройствах PDMS и с требованием микронных выравнивания их с микроканалов создает серьезную техническую проблему. В разделе 3.1 протокол для в-чипе, или в месте, подготовка биоматериала моделей представлена. Эти модели можно было регистрировать нейронов во время длительных сроков культуры и продвижения выросты между отсеками. Мениска-пиннинга микроструктуры используют для выравнивания так называемую маску воды с нейрон упорядоченный массив сайты и нейритов каналов. Маска вода защищает молекул адгезии покрытий во плазменной обработки, в то время как открытые поверхности распадаются определить биоматериала шаблон. Кроме того, протоколы предназначены для культуры клеток и для текучей изоляции, необходимой для селективного лечения различных отсеках со-культуры.

ve_content "> Протоколы предназначены для привлечения в удобных принципов мягкой литографии для репликации поли (диметилсилоксанового) (PDMS) микрожидкостных устройств 18. Кроме того, в Ситу биоматериала паттерна проста, эксплуатируя испарения и поверхностные явления напряженности, и только требуя недорогой переносной источник плазмы. Микрожидкостных схема эффективно программы загрузки клеток и отсек конкретные процедуры делает эти операции просто вопрос выдачи материалов в правильное нижнему порту и аспирационных сверху. Таким образом, он предназначен, чтобы дать нейробиологов свобода получать и использовать микрожидкостных устройств в своих собственных лабораториях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протоколы предназначены для неврологов, и приведены на рисунке 2. Как таковое, это рекомендовать микротехнологий из СУ-8 мастеров, используемых для PDMS репликации на аутсорсинг в коммерческих или институциональных учреждений. Два слоя маски конструкции находятся в свободном доступе в качестве дополнительной информации (ZIP) на Королевского общества химии сайте 12. Важно отметить, что первый SU-8 слой должен быть изготовлен на глубину 2,5-3,0 мкм, а второй на глубину 25-30 мкм. Это ключевые размеры, необходимые для эффективного нейрона выстроив. 3 микрон предел высоты Также необходимо, чтобы предотвратить нейроны время транспортировки или переноса между двумя отсеками 12.

1. Микрофлюидных репликации устройств в PDMS

  1. Смешайте PDMS форполимера тщательно с отвердителем (184) в соотношении 10:01 и дегазации смеси в вакуумном эксикаторе в течение обычно 20 мин. С другой стороны, поставить смесьтуры в 50 мл трубки Сокол и использовать низкую г центрифугированию для дегазации.
  2. Поместите 2-слоя микроструктурированный СУ-8 пластины на 80 ° C плитой и выровнять полимерных кадры для каждого устройства на пластине. Налейте PDMS в рамках на глубину ≥ 5 мм и позволяют> 1 час, чтобы обеспечить полное термическое отверждение.
  3. После отверждения, удалить пластину из плиты и дать остыть на плоской поверхности.
  4. Носите защитные очки и работу от одного угла (подальше от СУ-8 микроструктур) с жесткой скальпеля к мягко приз раму и PDMS от пластины.
  5. Снимите плесень PDMS от рамы и использовать ножницы, чтобы урезать устройство избыточных PDMS. Этот так называемый мигает часто получают, когда тонкая пленка PDMS распространяется между рамой и полимерной поверхности пластины.
  6. Остальные PDMS может быть применен ко всей пластины и отверждены, чтобы защитить подложку во время хранения. Удалить это до последующего формования устройства, и при этом удалять любые рсформулировать загрязнений с поверхности.

2. Ассамблея устройства и межсоединений

  1. Подготовьте порты 6 интерфейса с помощью 3 мм биопсии диаметр удар. Работа по темной поверхности, в хороших условиях освещения и с микроструктурой особенностей стоящих перед вверх, чтобы помочь выравнивание портов с микроканалов.
  2. Прибор на твердых частиц. Удалите их, используя обратимое клейкую ленту.
  3. Микрожидкостных схема инкапсулируется с помощью тонкой PDMS слой, установленный на покровным стеклом: Их получают путем заливки небольшого объема (~ 0,5 мл) в PDMS-отвердителя смеси (10:1, 601) на базе гибкой, бактериологическое чашки Петри. Аккуратно нажмите покровное на слой PDMS, размещаем на электрической плитке и термически лечения в течение нескольких минут. Быстро после охлаждения, использовать скальпель, чтобы вырезать и приз бислой покровное-PDMS от чашки Петри. Обрезать ножницами в случае необходимости.
  4. Плазменные облигаций этом устройство PDMSи опорный слой для получения хорошего уплотнения: Оптимальные условия инструментом конкретных. Например, плазма печь работает на 70 Вт и 40 кГц в атмосфере кислорода 0,2 мбар в течение 40 сек производит отличную ПДМС-PDMS связь. После того, как с плазменной обработкой, нажмите обе части вместе и оставить на минуту к полностью облигаций.
  5. Используйте силиконовых трубок (1,6 мм ID, 3,2 мм OD) для взаимодействия с насосами и шприцев.

3. Биоматериала паттерна и Микрофлюидных Операции

Протоколы деятельности на местах по биоматериала паттерна, нейронов культуры и жидкостных обработок показано на рисунке 2.

Рисунок 2
Рисунок 2. Иллюстрированные микрофлюидных протоколы. А) PL и PLL-г-ПЭГ рисунка; добавление клеточной адгезии слоя (например,PL, зеленый), с испарением производству маску выровненный воды B) Атмосферное обработки воздуха в плазме открытой PL.; две выводы антенны используются, с введением плазмы антенны, показанной с розовым звезды. C) PBS (синий) стиральная стремлением используется, чтобы избежать загрязнения области плазмы обращению с PL. D) Доставка PLL-г-PEG (красный ) стремлением к пальто плазменные обработанных областей Е) Сотовый загрузки.; одновременное микрофлюидных выстроив нейронов в обоих фланговых отделений стремлением, F) СМИ (розовый) перфузии с помощью гидростатического приводом поток G) Изолированные струйные процедуры.; периферической лечение тестируемого агента (черный) поставляется с нижней фланговые входе стремлением и H) центральной лечения, поступающей из нижней центральной входе по аспирации. Рисунок и легенда воспроизведена с разрешения Королевского химического общества(РКК) 12. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Сразу же после плазменной склеивания микрофлюидных каналы PDMS очень гидрофильные (угол контакта ≤ 5 °). Такие поверхности являются подходящими для адгезии и культуры клеточных линий, таких как дифференцированные человека SH-SY5Y нейроноподобных клеток. Для экс естественных культуры первичных нейронов и культуре нейронов клеточных предшественником линий, таких как Лунда человеком Теменной клеточной линии (LUHMES) полиамина покрытием, либо полилизином (PL) или полиорнитином (PO), требуется в качестве электростатического якоря. Кроме того адгезии белки, такие как ламинин или фибронектин часто требуется, как интегрин-сопряжения покрытия. Тем не менее, PL и PO покрытия легко связать нейронов, препятствуя микрофлюидных доставку к местам массива, а также навязывания нежелательных напряжений сдвига. Для решения этой проблемы в чипе биоматериаластруктурирование требуется локализовать адгезионные материалы на ловушки сайтов и разрастание микроканалов. Это также способствует развитию между отделениями связи и снижает местный запутанности. Протокол также включает добавление ПЭГ материалов на соседних областей, чтобы обеспечить белки и нейроны ограничивается желаемых местах в течение длительного культуры. Следующий протокол описан в рисунке 3:

Рисунок 3
Рисунок 3. Вода маскировки для биоматериала паттерна с помощью плазменного трафарету. А) Иллюстрация процесса вода маскирующего с PDMS микростолбиков закрепления водных мениск на месте в течение плазмы трафарету. Кривизна мениска в вертикальной плоскости был пренебречь. B) Маска воды визуализировали с красным красителем и позиционируется мениска рнечего. C) узорной PL-FITC покрытие отображаемого после плазменной трафарету. D) Добавление белка отвергая и сотовый отталкивает PLL-г-ПЭГ-TRITC к плазменному узором PL-FITC покрытия. Это было использовано для регистрации SH-SY5Y клеток, а также для формирования паттерна дополнительный слой фибронектина для LUHMES клеток. Рисунок и легенда воспроизведена с разрешения Королевского химического общества (RSC) 12. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

  1. Вода Маскировка деятельности на местах по биоматериалов паттерна плазмой трафарету
    1. Вскоре после плазменной связующего пипетки объем 0,5 мкл PL или PO (100 мкг / мл в 1X PBS) в нижней центральной порта. В течение нескольких секунд вся микрофлюидных схема заполняется под действием капиллярных сил. Оставьте на несколько минут, чтобы полностью пальто гидрофильные PDMS поверхностей с Полнамины.
    2. Удалить несвязанных молекул полиаминовые по аспирации приводом промывки 1x PBS (см. рис 2С) в течение 1 мин.
    3. Удалите все PBS из портов и нагреть устройство при освещении с помощью микроскопа. Это увеличивает испарение из портов для быстрого формирования маски вода. Маска воды (показано на рисунке 3А и документально на фигуре 3В) устанавливается в пределах ~ 5 мин.
    4. Проверьте устройство с помощью микроскопа для обеспечения водой маскировки завершена. Обратите внимание, резервуар структуры выше сайта массива включены в конструкции маски, чтобы продлить устойчивость маски водой (~ 15 мин).
    5. Вставьте флажки из нержавеющей стали в порты (рис. 2В). Они используются для соединения плазмы, порожденная давления ручного коронного разряда атмосферного или Tesla генератора (например, работающий на частоте 2 МГц, сигнал 30 кВ) 19,20 в свободные микроканалов. Направьте кончик тон плазме источник, близкий к оконечности одного штифта и плазмы лечить микроканал для ≤ 1 сек. Используйте условия низкой освещенности наблюдать плазменный паттерна.
    6. Удалить маску воды с стадии промывки. Используйте параллельные стремление из верхних 3 портов. Используйте 4 равные длины силиконовой трубки, соединенные 4-х адаптер в аспирационной насоса для достижения параллельного стремление. Начните стремление и обойтись PBS в нижних 3 порта привлечь PBS через микрофлюидных цепи. Таким образом ПДМС-полиамин материал контраста производится (см. фиг.3С). Эвакуировать PBS от микрофлюидных цепи и оставить на несколько часов, чтобы восстановить родной, гидрофобный состояние. Это делает PDMS полностью запрещающей к клеточной адгезии.
    7. Если дополнительные адгезионные материалы, такие как ламинин или фибронектин, необходимо выполнить следующие шаги необходимы и должно быть сделано немедленно после снятия маски воды: Внесите объем 10 мкл трансплантата сополимер поли-L- Лизин-поли (этиленгликоль) (PLL-G-ПЭГ, 100 мкг / мл, в PBS) в обеих нижних фланкирующие каналов, с последующим отсасыванием с верхних фланкирующих каналов в течение 2 мин.
    8. Без прерывания потока, удалить излишки PLL-G-ПЭГ путем обмена с буфером PBS. Это выборочно покрывает не-полиаминовые покрытием регионах с остатком ПЭГ действует для предотвращения адсорбции белка и клеточную адгезию 17,21.
    9. Адгезионные белки, такие как ламинин или фибронектин может быть совместно локализованы с покрытием поли-амина: Пипетка 10 мкл объемы этих белков ЕСМ (обычно 10 мкг / мл) во все три нижних портов. Аспирируйте из трех лучших портов, пока устройство не наполнен раствора белка и инкубировать в течение 1 часа, чтобы произвести хорошее качество покрытия.
    10. Удалить лишние белки путем аспирации PBS с нижних 3 портов.
  2. Микрофлюидных одного нейрона выстроив
    1. Премьер устройства с Ассигноели СМИ. Добавьте 20 мкл в донных 3 портов и параллельным стремление из верхних трех портов быстро заполнить микрофлюидных цепь с СМИ. Используйте трубки разъем 4 направлениях для соединения 3 верхних портов через равной длины силиконовой трубки к аспирации насоса.
    2. Добавить 20 мкл дезагрегированном клеточной суспензии (1 х 10 6 клеток / мл) в каждый из фланговых входных отверстий (0, на рисунке 1).
    3. Одета при аспирации насос с регулятором расхода или использовать шприц для нежной стремление из верхних 3 портов. Полный нейрон выстроив обычно требуется 1 мин.
    4. Урожай лишние нейроны оставшиеся в 4 фланговые портов с помощью пипетки для выстроив в последующих микрожидкостных устройств.
    5. Снимите трубку. Заполните все порты со средствами массовой информации и поместить устройство в инкубаторе. В течение нескольких часов клетки становятся полностью приверженцем на биоматериала узором.
  3. Нейрон Культура, Селективный Пневмомускул лечение и иммунитетnostaining
    1. Замените СМИ периодическим перфузии с помощью гидростатического канал (2 мм разница высота колонны является надлежащим медленно).
    2. Кроме того, погрузите микрожидкостных устройств в средах, периодически обмениваясь СМИ (2-3 дня), как со стандартными клеточных культурах.
    3. Избирательные струйные процедуры по обе нейрона культуры отсеке или центральной рост аксонов отсеке достигаются следующим образом: Внесите 20 мкл испытуемого вещества в нижний порт канала, представляющего интерес, и аспирации от порта непосредственно выше. Для длительных процедур уменьшить скорость потока с помощью регулятора потока и пополнить исследуемое вещество по мере необходимости.
    4. Иммуноокрашивание протоколы изменяются для каждого молекулярной мишени и связанных реагентов. В целях противодействия потенциальный риск сдвига, вызванных повреждением нейронов, используемых медленный расход. Это приводит к увеличению времени приложений, чтобы полностью заливать систему, расширяя нормальные раз протокола. Hyростатического перфузии через порты с различной высоты столбцов (например, 2 мм) был использован для доставки реагентов. Более быстрое добавление реагента и удаление с помощью насоса может быть использован для уменьшения экспериментальные временные рамки. Подключите стремление насос на верхние 3 порта привлечь реагенты из нижних 3 портов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Вода маскирующие подвиги поверхностного натяжения. Допуск давление на границе раздела воздух-жидкость изменяется обратно пропорционально с радиусом кривизны [ , Создании высокостабильных интерфейсы на микрофлюидных размеров. В микростолбиков эффективно закрепить маску воды на месте. Формирование маска Вода движет испарения от микрофлюидных портов, со скоростью увеличился на отопление. Использование тепла от малом увеличении (4X - 10X) микроскопия освещения, маска вода обычно установления в ≤ 5 мин. Испарение также приводит в конечном итоге к коллапсу маски воды. Для увеличения срока службы маски водой до ~ 15 мин (практичным для плазменной трафарету), 18 NL резервуар структуры были расположены выше по течению от культуральных отсеков. Скорость образования маски вода и распада может меняться, и прерывистый наблюдение рекомендуется определить подходящий период для плазмы тreatment. Тем не менее, несколько устройств могут быть приготовлены одновременно.

Плазменные трафарету требуется ~ 1 сек. Использование длительных процедур испаряется маску воды, что приводит к чрезмерной плазменной распада полиаминов покрытием. В отдельных случаях недостаточных результатов лечения плазмы, оставляя нетронутыми полиаминовые покрытий на прилегающей стенки микроканала (см. рисунок 3D), что может поддерживать нейронов адгезию 12. Тем не менее, облеченные мыши нейроны коры была эффективность паттерна 89,5% 12 следующую культуру в течение 6 дней. Эта эффективность эквивалентна PL / ПЭГ узоры на плоских подложках. Биоматериала рисунка имеет дополнительное преимущество, содействие выросты в аксонов микроканалов. С биоматериала паттерна выросты продлен в пределах ~ 90% микроканалов, в то время как со сплошным полиаминных покрытия уровнях вырост сводились к ~ 70%. Использование корковых нейронов, 7 дней в чипе культуры была необходима для перерастаюттыс., чтобы охватить как отсеки (расстояние до 500 мкм). Дифференцированные человека нейроны SH-SY5Y имели более высокий уровень вырост, установление связей в 4-6 дней. Кортикальная, LUHMES и SH-SY5Y нейроны культивировали в течение до 2 недель. Это достаточно долго для спонтанного электрофизиологических функции должны быть достигнуты и можно косвенно измеряется Ca 2 + визуализации. Это проверки широкое применение в биоматериала паттерна и микрофлюидных методов выстроив для установления функциональных нейронных сетей.

Мениска-закрепления структуры, тем не менее, способствуют аксонов запутанности (см. рисунок 4C). Край вывод является общей чертой аксонов, культивируемых на микроструктурированном поверхностей 22. Для предотвращения такого запутывания и далее способствовать формированию между отделениями связи, мениск-закрепления колонны могут быть объединены с микроканального стене (то есть больше не свободно стоящая). Кроме того, выростовв центральной микрофлюидных канала может быть дезорганизована. Для проведения экспериментов, требующих линейного соединения, центральный канал могут быть удалены (см. маски конструкций в Динь и др.. 12, дополнительная информация). Эта схема требует последовательный упорядоченный массив из первого отсека, за которым следует период (например, 4 ч) на клеточной адгезии или так называемого сотового запорной арматуры 14 чтобы сделать схему для разрешающий упорядоченный массив ячеек во втором отсеке.

Микрожидкостных схема обеспечивает запрограммированные жидкостных операций. Различные функции определяются путем выбора порта для загрузки реагентов или интерфейс с трубками или советы. Это позволяет избежать необходимости в сложной, дорогостоящей и пространства с требованием управляемым обратной связью приборов, чтобы сделать этот метод весьма доступным для нейробиологов. Схемотехника критически зависит от оптимальных относительных размеров для достижения микрофлюидных выстроив 12-14. Небольшие изменения могут предотвратить CIRЗПИФ функционировать, и поэтому мы рекомендуем начальные усыновителей протоколов воспользоваться из находящихся в свободном доступе конструкций 12. С оптимальной схемы, микрофлюидных один нейрон выстроив быстрый, с ~ 100 нейронов, выстроенных в каждом культуры камере менее чем за 1 мин. Несмотря на ограниченное количество нейронов, локальная плотность по-прежнему эквивалентны стандартным культур, чтобы обеспечить достаточный уровень сигнализации жизнеобеспечения. Как отмечалось на фиг.4В этот подход эффективно дает 1 нейрон за ловушку (1,14 ± 0,09) 12. Однако, не все нейроны облеченные. Микрожидкостных схема генерирует параллельные линии тока, например, что нейроны, прибывающие во внешних регионах ламинарного течения продолжают змеиного канала. Тем не менее, представлены система в 10-100 раз более экономичны с клетками, чем существующие разобщенным систем. Исключенные клетки могут быть собраны из портов и трубопроводов. В будущих проектах, вверх по течению детерминированным боковое смещениеСтруктуры 23 могут быть использованы, чтобы отклонить все клетки в упорядоченный массив упрощает для абсолютного сотовой экономики.

Рисунок 4
Рисунок 4. Микрофлюидных нейрон выстроив. А) Руководство стремление с помощью шприца используется для нежной нейрона выстроив. Разъем трубки 4-х используется для взаимодействия шприц с верхних 3 портами для одновременного нейрона выстроив в обоих отсеках. Б) Дифференцированный нейроноподобных человека SH-SY5Y клетки и другие нейроны облеченные с одинарной точностью клеток (один нейрон в ловушку ). C) После 5 дней культуры, расширения нейритов соединить две культуры. Ядра окрашиваются DAPI и актин иммуноокрашивание был использован для визуализации выросты. Изменен рисунок и легенда воспроизведена с разрешения Королевского химического общества (RSC) Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Ключевой особенностью разобщенным систем является возможность избирательно относиться отдельные популяции клеток для исследования торговлей материала и сигнализации дальним. Тем не менее, методы, доступные в литературе либо недостаточны для жидкостного изоляции или плохо описываются. Способ жидкостный изоляция мы разработали позволяет быструю доставку (<1 мин) тестируемых веществ и длительного текучей изоляции (> 1 ч) 12. Результаты описаны на рисунке 5. Эта возможность становится возможным благодаря комбинации схемотехники и с помощью аспирации для доставки испытуемого вещества. Это в отличие от инъекции жидкости с использованием либо шприцевой насос из гидростатическим корма. Несмотря на высокую жидкостного сопротивления рост аксонов каналов, эти методы дают конвекционные пути ^шляпа быстро разогнать тестовые вещества и загрязняют все устройство. Стремление из верхнего порта также взаимодействует с жидкостью в течение всего контура (свойство центральное место в дифференциального сопротивления выстроив принцип). Тем не менее, в этом режиме работы, средства массовой информации взяты из других в цепи, чтобы разбавить исследуемое вещество вместо диспергирования. С учетом экстремальных жидкостный сопротивление (относительное) из нейритов каналов, уровень разбавления незначительна. Для экспериментов, влекущих создание диффузионных градиентов, метод аспирации может быть использован для селективного лечения один отсек, с прекращением потока, используемого для инициирования зависимое от времени эволюцию химического градиента.

Рисунок 5
Рисунок 5. Избирательные струйные лечения. A) Стремление приводом селективные методы лечения тон центральный и Б) фланговые отделения. Стрелка указывает один порт, используемый для аспирации. Лечение были созданы в 1 мин (красные линии) и поддерживались в течение всего срока эксперимента; 60 мин (синие линии). Изменен рисунок и легенда воспроизведена с разрешения Королевского химического общества (RSC) 12. Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Микрожидкостных техника выстроив является первым в своем роде, который позволяет точности одного обращения нейронов для установления минималистичные культур. В сочетании с месте биоматериала методом структуризации в, мощный подход к выравнивания моделей сотовых с микрофлюидных структур, эти минималистичные культуры имеют уровни подключения высокого intercompartment с уменьшенной локальной запутанности. Эти особенности могут быть использованы для эффективного изучения между отсека передачи, и с простой модификации конструкции имеют потенциал, чтобы изолировать отдельные аксоны для визуализации и количественного анализа. Например, в следующем поколении проектирует трезубец структуры могут быть заменены одним вырост канала на нейрон, чтобы уменьшить вероятность нескольких аксонов, образующих пучки. Эти возможности могут извлечь большую пользу разнообразные нейронауки приложений, в том числе; наночастиц токсичность 24 и распространения марганца 25, активность синхронизации при эпилепсии, распространение инфекционных агентов, таких как прионы 26, бета-амилоид (Ab) передачи в болезни Альцгеймера 9 и альфа-синуклеина в болезни Паркинсона 27.

Еще одним очевидным преимуществом метода микрофлюидных выстроив является возможность проводить исследования с низкими обилие нейронных групп населения, а не сложных гетерогенных культур. Например, дофаминергические нейроны черной субстанции, пригодные для исследовательских или периферических нейронах Паркинсона, которые могут быть выделены только в небольшом количестве все еще ​​достаточно для повторных исследований с использованием микрожидкостных платформы. Другие редкие примеры применения клеток включают расследование основе потерю слуха с помощью экспериментальной установки волосковых клеток совместно культивируемых с нейронов спирального ганглиев, или исследования, используя индуцированные плюрипотентные стволовые клетки от людей. Кроме того, требования низкие сотовые системы сделать этолегко можно предпринять эксперименты с нейронами из миниатюрной Drosophilia MELANOGASTER мозга 28 и, таким образом использовать преимущества этого мощного генетической модели.

Другой перспективным является прагматизм сотовой экономики и небольшие размеры устройства, что делает высокая пропускная исследования управляемым. Каждое условие и репликации требует минимальных нейроны, функция, которая может быть использована для чрезвычайно сократить численность животных в соответствии с 3Rs инициативе на постоянной основе. Например, анализ реакции от дозы большого панели соединений могут быть осуществлены с использованием одного животного. Виды экрана включают проверки токсичности и расследование библиотек миРНК или фармакологических агентов для их влияния на торговлю на большие расстояния и передачи сигнала. Таким образом, описанные протоколы расширить экспериментальную охват невролог, предлагая потенциал для обеспечения высокой пропускной способности, количественный и статистикасоюзником мощные данные с одного и субклеточном резолюции. Это и многие другие великие события в области неврологии приведет к новому взглянуть на механизмы, лежащие развития нейронов и функции, а также патологических процессов, вызывающих заболевание.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Авторы благодарны Ульрих Маргграф (МСА) для СУ-8 изготовление и Мария Беккер (МСА) для работы с изображениями SEM. Исследование было при финансовой поддержке Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), в Bundesministerium für Bildung унд Forschung гранта (BMBF 0101-31P6541) и по Ministerium für Innovation, Wissenschaft унд Forschung де Ланды Северный Рейн-Вестфалия. Хайке Hardelauf благодарит Международный Лейбниц Высшая школа "Системная биология Лаборатории-на-чипе" за финансовую поддержку.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Sylgard 184 Dow Corning
PDMS Elastosil RT 601 Wacker
Coverslips VWR 630-1590 130-160 mm thick
3 mm biopsy punches Kai Medical Handle with care - extremely sharp
Tygon tubing Fisher Scientific S-50-HL 1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml syringe (Inkjekt and Omnifix) Braun 6064204
4-Way tubing connector VWR or Fisher Scientific
Flow regulator Harvard Apparatus 722645
0.5 mm pins Dressmaking Departments
PLL-g-PEG SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Stability in storage can be an issue
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407
Polylysine-FITC Sigma-Aldrich P3069
Polyornithine Sigma-Aldrich P4957
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Laminin Sigma-Aldrich L2020
PBS Sigma-Aldrich P4417
Inverted fluorescent microscope
Example aspiration pump KNF Neuberger, Laboport N811KVP
Hand held corona discharge device Leybold-Heraeus, USA VP23 May not comply with your country's safety standards
Femto plasma oven Diener Electronic
Vacuum dessicator or centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campenot, R. B. Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 74, (10), 4516-4519 (1997).
  2. Campenot, R. B. Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor. Dev Biol. 93, (1), 1-12 (1982).
  3. Taylor, A. M., et al. Microfluidic multicompartment device for neuroscience research. Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).
  4. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, (8), 559-565 (2005).
  5. Kilinc, D., et al. Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip. Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).
  6. Li, L., et al. Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics. Anal. Chem. 84, (15), 6444-6453 (2012).
  7. Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons. Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).
  8. Hellman, A. N., et al. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab Chip. 10, (16), 2083-2092 (2010).
  9. Kunze, A., et al. Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies. Biotechnol. Bioeng. 108, (9), 2241-2245 (2011).
  10. Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus. PLoS One. 3, (6), (2008).
  11. Markus, A., et al. Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection. J. Virol. 85, (13), 6220-6233 (2011).
  12. Dinh, N. D., et al. Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures. Lab Chip. 13, (7), 1402-1412 (2013).
  13. Tan, W. H., Takeuchi, S. A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, (4), 1146-1151 (2007).
  14. Frimat, J. -P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab Chip. 11, (2), 231-237 (2011).
  15. Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays. Anal. Chem. 78, (14), 4925-4930 (2006).
  16. Frimat, J. P., et al. The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening. Lab Chip. 10, 701-709 (2010).
  17. Hardelauf, H., et al. High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes. Lab Chip. 11, (16), 2763-2771 (2011).
  18. Whitesides, G. M., et al. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
  20. Frimat, J. P., et al. Plasma stencilling methods for cell patterning. Anal. Bioanal. Chem. 395, (3), 601-609 (2009).
  21. Huang, N. P., et al. Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption. Langmuir. 17, 489-498 (2001).
  22. Li, N., Folch, A. Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates. Exp. Cell Res. 311, (2), 307-316 (2005).
  23. Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304, (5673), 987-990 (2004).
  24. Yang, Z., et al. A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system. J. R. Soc. Interface. 7, (2010).
  25. Brenneman, K. A., et al. Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model. Toxicol. Appl. Pharm. 169, (3), 238-248 (2000).
  26. Magalães, A. C., et al. Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells. J. Neurosci. 25, (21), 5207-5216 (2005).
  27. Diogenes, M. J., et al. Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation. J Neurosci. 32, (34), 11750-11762 (2012).
  28. Egger, B., et al. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nat. Protoc. 8, (5), 958-965 (2013).
Подготовка нейронных сопредседателей культур с одной клетки Precision
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).More

Dinh, N. D., Chiang, Y. Y., Hardelauf, H., Waide, S., Janasek, D., West, J. Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision. J. Vis. Exp. (87), e51389, doi:10.3791/51389 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter