Протоколы для одного нейрона микрофлюидных выстроив и воды маскировки для в-чипе плазмы паттерна биоматериала покрытий описаны. Тесно взаимосвязаны со-культуры могут быть получены с использованием входов минимальные клеток.
Микрофлюидных варианты камеры Campenot привлекли большой интерес от нейронауки сообщества. Эти взаимосвязанные платформы со-культура может быть использован для исследования разнообразных вопросов, охватывающих с развитием и функциональный нейробиологии к инфекции и распространения заболеваний. Тем не менее, традиционные системы требуют значительных сотовой входы (многие тысячи в отсеке), неадекватные для изучения низкие клетки изобилии, такие как первичной дофаминергической черной субстанции, винтовая ганглиев и Drosophilia MELANOGASTER нейронов и непрактично для высокой пропускной экспериментов. Плотные культуры также весьма локально запутанными, с несколько выростов (<10%), соединяющих две культуры. В этой статье прямые микрофлюидных и паттерна протоколы описаны которые решения этих проблем: (я) микрофлюидных один нейрон метод выстроив, и (II) методом вода маскировка для плазмы паттерна биоматериала покрытия для Regiстер нейроны и способствовать вырост между отсеками. Минималистичные нейронов со-культуры были приготовлены с высокого уровня (> 85%) соединения intercompartment и может быть использован для высокой пропускной нейробиологии экспериментов с точностью одной ячейки.
Нервной ткани является весьма сложным; гетерогенная сотовой смесь, которая пространственно приказал в определенных слоев и отсеков и с пластиковой подключения через сотовые контактов и особенно через аксонов и дендритов выростов. Новые методы, необходимые для придания большей экспериментальной свободу, чтобы получить более глубокое понимание и разгадать механизмы центральные к болезни, развития и нормального функционирования. Campenot камера 1,2, а в последнее микроизготовленном варианты 3,4 могут быть использованы для экс виво подготовки сетевых нейронов совместных культурах с возможностью избирательно возмущают различные соматические популяции, а также их нейритов наростов. Эти микрофлюидных устройства например был использован для изучения аксонов дегенерации и регенерации следующие химической 5,6 или лазерного аксотомии 6-8 tauopathy 9, вирусного распространения 10,11 и мРНК локализации в аксонов 4.
ЛОР ">Чтобы расширить сферу из нейробиологов, технологические разработки должны подготовить минималистичные нейронные совместно культур. Это позволяет распутывание нейронной сети для исследования системы с одной клетки и субклеточном точностью. Требование минимального количества клеток открывает возможность для анализа редких типов клеток, в том числе дофаминергических черной субстанции клеток, имеющих отношение к болезни Паркинсона, винтовая ганглиев от уха, периферических нейронах, и стволовые клетки. Помимо этого, сотовые экономика имеет отношение к инициативе 3Rs. Используя эти микрофлюидных платформы, крупномасштабные экраны токсичности или других высокую пропускную способность, данные богатых серии экспериментов, требующих нейроны животных теперь можно считать.
В данной работе протоколы для изготовления и использования микрожидкостных устройств описаны. Микрофлюидных выстроив в сочетании с в месте biomateriСпособ рисунка др. могут быть использованы для регистрации сильно взаимосвязанных нейронных совместных культурах с использованием минимального количества клеток. Микрофлюидных упорядоченный массив основан на подходе дифференциального потока 12-15, в результате чего микроструктурированных ловушки расположены внутри контура текучей (на примере вместе с изображениями SEM на фиг.1). Путь 0 → 1 имеет более низкую жидкостный сопротивление (R 2> R 1) для транспортировки нейронов к линейному массиву микроструктурированном отверстий – впускных отверстий на рост аксонов каналов. Заполняемость в ловушку одной клетки локально препятствует потоку, чтобы отвлечь линии тока для улавливания последующие клетки в соседних ловушек. Полное размещение ловушек в массиве переключает жидкостный коэффициент (R 1> R 2), чтобы отвлечь линии тока в волнообразной траектории (0 → 2) для получения обходного режима работы для удаления избыточных нейронов.
<p claсс = "jove_content" FO: держать-together.within-страницу = "всегда">Подготовка micropatterned нейронных сетей на плоских подложек может быть легко достигнуто (для exampl эс из нашей группы, см. Frimat др.. 16 и Хайке и др.. 17). Тем не менее, инкапсуляции биоактивных материалов паттерны в устройствах PDMS и с требованием микронных выравнивания их с микроканалов создает серьезную техническую проблему. В разделе 3.1 протокол для в-чипе, или в месте, подготовка биоматериала моделей представлена. Эти модели можно было регистрировать нейронов во время длительных сроков культуры и продвижения выросты между отсеками. Мениска-пиннинга микроструктуры используют для выравнивания так называемую маску воды с нейрон упорядоченный массив сайты и нейритов каналов. Маска вода защищает молекул адгезии покрытий во плазменной обработки, в то время как открытые поверхности распадаются определить биоматериала шаблон. Кроме того, протоколы предназначены для культуры клеток и для текучей изоляции, необходимой для селективного лечения различных отсеках со-культуры.
ve_content "> Протоколы предназначены для привлечения в удобных принципов мягкой литографии для репликации поли (диметилсилоксанового) (PDMS) микрожидкостных устройств 18. Кроме того, в Ситу биоматериала паттерна проста, эксплуатируя испарения и поверхностные явления напряженности, и только требуя недорогой переносной источник плазмы. Микрожидкостных схема эффективно программы загрузки клеток и отсек конкретные процедуры делает эти операции просто вопрос выдачи материалов в правильное нижнему порту и аспирационных сверху. Таким образом, он предназначен, чтобы дать нейробиологов свобода получать и использовать микрожидкостных устройств в своих собственных лабораториях.Микрожидкостных техника выстроив является первым в своем роде, который позволяет точности одного обращения нейронов для установления минималистичные культур. В сочетании с месте биоматериала методом структуризации в, мощный подход к выравнивания моделей сотовых с микрофл?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарны Ульрих Маргграф (МСА) для СУ-8 изготовление и Мария Беккер (МСА) для работы с изображениями SEM. Исследование было при финансовой поддержке Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), в Bundesministerium für Bildung унд Forschung гранта (BMBF 0101-31P6541) и по Ministerium für Innovation, Wissenschaft унд Forschung де Ланды Северный Рейн-Вестфалия. Хайке Hardelauf благодарит Международный Лейбниц Высшая школа "Системная биология Лаборатории-на-чипе" за финансовую поддержку.
PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
PDMS Elastosil RT 601 | Wacker | ||
Coverslips | VWR | 630-1590 | 130-160 mm thick |
3 mm Biopsy Punches | Kai Medical | Handle with care – extremely sharp | |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | S-50-HL | 1.65 mm ID; 3.35 mm OD |
1 mL Syringe (Inkjekt and Omnifix) | Braun | 6064204 | |
4-Way Tubing Connector | VWR or Fisher Scientific | ||
Flow Regulator | Harvard Apparatus | 722645 | |
0.5 mm Pins | Dressmaking Departments | ||
PLL-g-PEG | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Stability in storage can be an issue |
poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
poly-lysine-FITC | Sigma-Aldrich | P3069 | |
poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | |
fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Inverted Fluorescent Microscope | |||
Example Aspiration Pump | KNF Neuberger, Laboport | N811KVP | |
Hand Held Corona Discharge Device | Leybold-Heraeus, USA | VP23 | May not comply with your country's safety standards |
Femto Plasma Oven | Diener Electronic | ||
Vacuum Dessicator or Centrifuge |