Protocol
1，准备解的蜂窝pH校准
- 加入下列化合物五个单独的50ml锥形管中，制备5解决方案，以用于校准：
- 氯化钠（1毫升1M的NaCl）（1 M氯化钠=0.58克在10ml H 2 O）
- 氯化钾（6.75毫升1M的KCl）（1摩尔KCl =0.75克在10ml H 2 O）
- 葡萄糖（1毫升1 M D-葡萄糖）（1M D-葡萄糖=1.80克在10毫升H 2 O）
- 用MgSO 4（0.05毫升1M 硫酸镁 ）（1M，用MgSO 4 =1.20克在10ml H 2 O）
- 20毫米肝素钠（1毫升1M的HEPES）（1 M羟乙基=2.38克在10毫升H 2 O）
- 氯化钙 （0.05毫升，浓度1M氯化钙2）（1米氯化钙2 =1.47克在10毫升H 2 O）
准备好所有的解决方案在双蒸水 （双蒸2 O）。
- 完成每个溶液用35ml双蒸2 O中并用磁力搅拌器混合，直到这样率被实现。
- 调整各溶液的pH用1N KOH或1N HCl中，得到5.5，6.0，6.5，7.0和7.5的pH值。然后，调整与去离子水的体积为50毫升的最终体积。
- 措施5毫克尼日利亚菌素，并将其添加到670μL无水乙醇中制成10毫米尼日利亚菌素原液。
注意：尼日利亚菌素是剧毒的，必须非常小心（手套，安全眼镜和面罩）进行处理。通过倒置混合该溶液直到尼日利亚菌素完全溶解。 - 加0.05 10mM的尼日利亚菌素（终浓度10μM）ml到每个校准溶液。尼日利亚菌素是一种离子载体，增加细胞膜的通透性，并导致细胞内和细胞外pH值的平衡中的细胞外K +去极化浓度的存在。
- 校准解决方案，可存储长达1个月，在4℃
2，细胞的制备
- 下一个生物拉利Ý罩，种子细胞于35毫米×10毫米培养皿中的2ml补充有10％胎牛血清和抗生素的生长培养基。使用需要确保在24小时后约50％汇合的细胞的量。
注意：在我们的实验中，我们使用HT-1080细胞系和板每培养皿1×10 5个细胞。 - 确定所需要的实验和板用于校准5个额外的培养皿培养皿的数量。
- 地方培养皿在37℃/ 5％CO 2培养箱至少24小时。
pH值传感探头3。准备
- 在DDH 2 0准备荧光pH探头8 -羟基芘-1，3,6三磺酸三钠盐（HPTS /羟基芘磺酸）的1M贮存液。此解决方案必须存储在RT及避光。
- 准备1毫米5的原液 - （和6） - 羧基seminaphthorhodafluor乙酰氧基甲基醋酸酯（C-SNARF-1 AM;叫therea折后SNARF-1）通过在1.76毫升的DMSO中溶解1毫克SNARF-1。通过反复吹打调匀。 SNARF-1溶液必须储存在-20℃下并避光。
4。细胞标记
- 十六个小时之前活细胞成像，加入2微升1M HPTS原液（终浓度为1mM），以含2ml完全培养基中的每个培养皿中。
- 返回培养皿的孵化器。该HPTS探头是细胞透性，因此对标签的细胞器探头必须采取由胞饮作用。这个条件要求孵育细胞与HPTS在补充有血清的培养基中进行。
- 温育后用HPTS，用无菌PBS洗细胞两次，并加入2ml无血清培养基中至少2小时。孵育SNARF-1需要在无血清培养基中进行的，因为血清可以防止探针的吸收。
- 加入10μl1毫米SNARF-1原液获得自动对焦5微米INAL浓度，使细胞孵育20分钟，在37℃，在昏暗的灯光下。 C-SNARF-1浓度和孵育时间可根据细胞类型而有所不同。
- 在孵育结束时，在无菌PBS洗涤细胞两次，并加入2ml无血清培养基中。
5，加入pH值调节剂的
- 评估方法是否可以检测在细胞pH值的变化，可以使用该调节细胞内pH值不同的试剂：
- 巴弗洛霉素A1，V型ATP酶5的特异性抑制剂
- 的Na + / H +交换体的同种型1（NHE-1）6
- NH 4 Cl等 ，弱碱，增加细胞内pH值7
- 制备储备溶液上面提到的试剂：
- 巴弗洛霉素A1：加10微克巴弗洛霉素A1至160微升的DMSO中，得到100μm的原液
- EIPA：添加EIPA 25毫克至1.67 ml甲醇，obtai50毫米的Na终浓度
- NH 4 Cl等 ：溶解0.53克氯化铵在10毫升双蒸2 O，以获得1mM的终浓度。
注：所有股票的解决方案必须保持在4℃，惟必须保存在-20℃，避光巴弗洛霉素A1。 - 在单独的培养皿中，加入下述试剂之一：
- 2微升100μM的巴弗洛霉素A1（终浓度为100nM）
- 1微升的50mM EIPA（终浓度为25μM）
- 40微升1M 氯化铵 （终浓度为20毫摩尔）
- 于室温孵育30分钟，在37℃下
- 进行图像采集。
在活细胞成像显微镜6。规格及收购设置
- 使用进行活细胞成像的40X物镜安装在一个频谱倒置扫描共聚焦microscoPE配有电动XY载物台，其容纳玻璃底培养皿中的环境控制（温度，湿度，CO 2）的阶段培养箱的腔室。
- 这里所用的共聚焦仪（奥林巴斯FV1000）配备有：
- 二极管激光器405 nm处
- A 40毫瓦氩激光（458纳米，488纳米，515纳米）
- 氦氖激光（543纳米）
- 萤石10倍的目标，NA0.4
- 一个LUCPLFLN 40X客观，NA0.60
- 一个PLAPONSC计划APO 60X油浸物镜，NA1.4
- 二向色镜DM 405/458/488/543
- 一个SDM 560和640 SDM的二向色滤光片
- 一个BA655-755屏障过滤器
- 分束器BS20/80
- 数据分析软件进行图像采集和分析，
- 一旦孵化阶段已升温至37℃，并在显微镜设置，将以前与HPTS和SNARF-1孵育成共焦成像舞台腔培养皿。
- 一折后定位感兴趣的区域，调整软件采集设置图1。
- 设置了两个虚拟通道组。
- 启动对应于激发HPTS在505 405 nm，发射集合中的第一阶段 - 525 nm和SNARF-1在激发在570 543 nm，发射集合 - 600纳米。
- 启动对应于激发HPTS在505 458 nm，发射收集第二阶段 - 525 nm和SNARF-1在激发在640 543 nm，发射集合 - 650纳米。
- 共焦孔径设定为175微米的默认和最佳光圈需要手动设定为300微米。
- 取图像通过堆叠串行水平光学部分0.4微米厚（800×800像素）。
注：一个40X的目标是有用的同时观察几种细胞和行之有效的细胞器观看。然而，空间分辨率和信号强度是贝特使用60X石油目标Ř实现。此外，有两种染料之间没有激发或发射的串扰。
pH值传感探头7。校准
- 校准之前，从预先用HPTS和SNARF-1孵育的培养皿中除去培养基，用无菌PBS洗涤两次，然后加入2毫升5校准溶液之一。
- 将培养皿放入共焦载置台室。
- 按照下面的设置进行时间推移图像采集：
- 设置图像和间隔持续时间为实验的数目。
注意：我们通常使用的图像之间的1分钟时间长达30分钟。 - 程序快门关闭采集每幅图像之间。
- 设置图像和间隔持续时间为实验的数目。
- 记录每分钟的荧光强度在一个电子表格软件，并确定时间时，荧光强度稳定。细胞内pH值是15后通常稳定 - 20分钟。
- Ř使用新的培养皿中其余的每个校准的解决方案EPEAT步骤7.1至7.4。
8，数据采集
- 一旦校准已经完成，从4-5含每场15-20细胞随机选择的领域取得的样本数据。两个图像的每个字段获得：1为HPTS标记（小泡）和第二对SNARF-1标记（胞质溶胶）。
- 背景荧光（细胞外区域）的数字减去两个探针的荧光图像。标记的囊泡和细胞溶质从各自的存储图像是使用二进制掩码中选择。对于每个pH值传感探头，荧光强度的数值刻度（0-4,095灰度级规模）来测量。平均强度的细胞器或细胞浆的所有像素计算和值来计算荧光比率。
9。数据分析
- 各个软件包是市售的用于数据分析。 即Fluoview软件。
- 在电子表格中，记录值，并计算荧光比率如下：在HPTS的情况下，R =（F 458纳米 /女性405 nm）和，在SNARF-1，R =（F 644纳米 /女性584纳米的情况下）。
- 用科学绘图软件如的GraphPad棱镜绘制数据。情节应该描绘荧光比值（Y轴），pH值（X轴）的函数。曲线拟合使用非线性回归来实现。
- 采集样品的荧光强度如步骤8.2中所述，并计算荧光比值。使用校准曲线转换成比例的pH值。
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Representative Results
对于pH值在细胞内和细胞内体/溶酶体细胞区室的同时测量，SNARF-1的比率荧光pH值传感探头和HPTS被使用。 SNARF-1被限制在细胞内隔室而HPTS允许内体/溶酶体区室的成比例的pH测量。小区负荷与HPTS 16小时允许在内涵体/溶酶体4的选择性定位。荧光从装入的pH传感探头HT-1080细胞中记录的一个典型例子示于图2A中 。证据表明，HPTS标签既内涵体和溶酶体区室是由共染色得到的与Alexa 546缀合的转铁蛋白（胞内体）或荧光lysotrophic探针（Lysotracker深Reddye）。数据清楚地表明，HPTS染色的两个隔室图2A中 。
使用上述的方法，在活细胞中的细胞内pH值下使用，测定每个探针图2B和2C的校准曲线的基础上，各pH值敏感的染料的比例特性。五个校准溶液用于荧光强度转换为pH单位。从三个独立的校准数据报告每个pH值传感探头图2C。每个数据点代表荧光强度在四百〇五分之四百五十八纳米的HPTS或在给定的pH值五百八十四分之六百四十四纳米的SNARF-1的发射波长的激发波长的比值。校准曲线为两个探针显示出这是最好装有一个指数方程图2C非线性关系。该方法用于检测细胞区室相关的pH值的变化的效率，用NH 4 Cl等 ，弱碱，增加细胞内pH值，巴弗洛霉素A1，V型ATP酶和EIPA药理抑制剂，NHE-活HT-1080细胞的评价1抑制剂。 NH 4 Cl等触发囊内和胞质solic pH值增加从6.35至7.10和7.00至7.40，分别如图3A和3B。巴弗洛霉素A1诱导内体溶酶体车厢的碱化不改变细胞内pH值。与此相反，EIPA诱导的细胞溶质达到6.62的pH值相比，在未经处理的细胞图3A和3B 7.00的酸化。
图1为共聚焦激光扫描显微镜获得的设置图。 （一）第一阶段被设置为激发HPTS在405 nm和SNARF-1在543 nm处同时通过分色（DM405/488/543/633）镜子。荧光发射是利用分色镜（SDM560）首次录得HPTS在505-525纳米。 SNARF-1的荧光发射，然后通过一个bandpa监视SS干涉滤光片在570-600 nm范围内。（二）第二阶段设置为同时收集HPTS的荧光发射（EXC，458 nm）和SNARF-1（极好，543纳米）。由激光束产生的激励探头通过一个分束器（BS20/80）和荧光发射每个探头是通过在第一阶段使用的分色镜收集。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2 在 pH值传感探头的现场校准。 （一）HPTS和SNARF-1亚细胞定位在HT-1080纤维肉瘤细胞的代表性图像。上的图像显示，SNARF-1标记细胞质，而HPTS-相关的荧光显示囊内定位。 HT-1080细胞培养30分钟用Alexa 546标记的转铁蛋白（5微克/毫升）或lysotrophic染料（Lysotracker深Reddye）（100纳米），分别为。下部的图像显示，HPTS共定位与转铁蛋白和lysotrophic染料（60X）（B）两者的pH传感探头的细胞温育15分钟以校准溶液在pH 6.0和pH 7.5代表性图像（C）荧光强度的关系使用校准溶液pH值的函数确定HPTS和SNARF-1的比率。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3。调制nt的我racellular pH值通过巴弗洛霉素A1，EIPA与NH 4 Cl。药理抑制剂（巴弗洛霉素A1，EIPA）和细胞内pH值调节剂的NH 4 Cl等被用来验证的方法。图表显示记录在内涵体/溶酶体区室（A）或装有HPTS和SNARF-1，并孵育在氯化铵的存在或不存在（对照）30分钟HT-1080细胞的细胞质中（B）（pH值下20毫米），进出口许可证法（25微米）或巴弗洛霉素A1（100纳米）。数据表示为平均值±SEM（** P 0.005，*** P 0.0001）。
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Discussion
在不同的细胞区室的活细胞成像定量测量pH值是需要精确测量细胞对外部挑战pH值的变化。然而，这仍然是主要的障碍之一就是能够容易地和特异性靶向细胞区室。在这方面，很少有研究强调了使用的HPTS通过电穿孔或显微注射8-10导入细胞胞内pH指示剂。这些技术存在严重的缺点，即电穿孔引起广泛破坏细胞，显微注射法需要特殊的设备和技术技能。息的，Hinton 等人 ，以前曾报道说HPTS可以被细胞吸收通过胞饮作用的一个过程，SNARF-1和HPTS的组合可以被用来监视在细胞质和核内体/溶酶体区室3的pH值。我们已经使用这个属性来记录在溶酶体/内体compartm pH值的变化耳鼻喉科现场HT-1080细胞。证据表明，HPTS是位于该隔室，因此，可作为一种可靠的pH指示剂是由共染色用荧光团标记的转铁蛋白得到，溶酶体/核内体室的一个标记，或与嗜酸性染料大多标签溶酶体图2，另外，使用靶向不同的细胞区室的不同的细胞内pH值调节剂的表示，巴弗洛霉素A1特别增加囊内pH值，而不改变胞质pH值。与此相反，EIPA主要改变细胞内pH值，但对内涵体和溶酶体pH值很小或没有影响，而氯化铵的pH影响两个隔室中。这些结果提供了证据，SNARF-1和HPTS可以用于同时监测在这两种不同的细胞区室的pH值的变化。
这里描述的方法的一个重要特征是利用共焦激光扫描显微镜。大多数研究回购RTED在细胞内pH测量文学已经完成了荧光分光光度法。虽然易于使用，并提供快速的数据采集，这种方法不允许观察细胞的实验中。这个缺点可能成为重要意义，因为它一直是我们的经验，在校准步骤，在酸性条件下延长潜伏期（pH值5.5）或碱性（pH值8.0）条件下可能对不同细胞类型的影响，并触发细胞凋亡。在HT-1080细胞的情况下，细胞凋亡导致的红色自发荧光，从而与SNARF-1（数据未示出）的pH依赖性荧光干扰。为了解决这个问题，我们使用了不同的培养皿中每个校准和丢弃的实验中观察到细胞凋亡或其他细胞改变的迹象。利用共聚焦显微镜用于pH测量也使得数据分析更容易。例如，共聚焦荧光显微镜图像分析可以用于丢弃的工件，apoptotiC单元和背景噪音，使计算更容易，更准确。
尽管相对于其它方法这里描述的方法提供了许多优点，但是它有一些局限性。其中之一是涉及到需要为每个探针的不同加载条件。对于HPTS，染料，必须采取由胞饮作用。这种限制要求细胞必须维持一段延长的时期（ 例如 12小时），在无血清的培养基中，以促进胞饮作用，从而内吞室的标记。与此相反，细胞穿透物SNARF-1需要在无血清培养基中进行培养，以防止乙酰氧基甲酯（AM）的水解由含血清的非特异性酯酶的可能性。这些限制将排除那些需要加载不兼容的细胞培养条件的实验方法。此外，HPTS的酸性介质中的灵敏度是一个重要的限制。 如图2，F兴奋在458 nM的HPTS的luorescence强度显示的变化最小，在pH 6.0或更低，与接近背景值的比率。 HPTS的这种内在的属性应该被考虑的非常酸性的细胞区室，如具有的pH值低至4.0至5.0溶酶体研究的情况。然而，就我们所知，HPTS是唯一可用的染料比例可以被用来测量内体内的pH值。例如，常用的lysosensor染料将更加酸性溶酶体内大多分区。这种染料的分区的内涵体隔室中的程度将取决于pH值下这些囊泡内，这是一个主要的缺点测定膀胱内pH值在细胞中，其中内体pH平衡被改变时。
总之，我们在这里描述的方法在单细胞同时测量胞质和核内体的pH值。这是用于pH稳态的细胞中的研究尤为重要WHERË突变或药物可影响胞内体流出和质子的涌入。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions for calibration | |||
| Sodium chloride | Fischer | L-11621 | |
| Potassium chloride | Fischer | M-12445 | |
| D-Glucose (dextrose) | Fischer | D16-1 | |
| Magnesium sulfate | Fischer | M65-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fischer | M-1612 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| Nigericin | Calbiochem | 481990 | Toxic by inhalation or in contact with skin |
| Keep protected from the light at 4 °C | |||
| Culture dishes ∅ 35mm | BD Biosciences | 354456 | |
| pH-sensing probes | |||
| 8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) | Life technologies | H-348 | Keep away from the light at room temperature |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Life technologies | C-1271 | Keep away from the light and humidity at -20 °C |
| Dimethyl Sufoxide (DMSO) | Fischer | BP231-1 | Harmful |
| Phosphate buffered saline (PBS) 100X | |||
| Potassium chloride | Fischer | M-12445 | 20 g |
| Sodium phosphate monobasic | Fischer | S369-1 | 115 g |
| Potassium phosphate monobasic | J.T Baker | 3246-01 | 20 g |
| Deionized water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Autoclave and adjust pH to 7.4 | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) 1X | |||
| PBS 100X | N/A | N/A | 50 ml |
| Sodium chloride | Fischer | L-11621 | 40.5 g |
| Deoinized water | N/A | N/A | Bring to 5 L |
| pH modulators | |||
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B-1793 | |
| 5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) | Sigma-Aldrich | A3085 | |
| Ammonium chloride | Fischer | A649-500 | |
References
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