Protocol
携帯pHの校正のためのソリューションの1。準備
- キャリブレーションに使用される5溶液を調製するために5つの別々の50mlコニカルチューブに以下の化合物を追加します。
- 塩化ナトリウム（1MのNaClの1ミリリットル）（1MのNaCl = 10 mlのH 2 O中0.58グラム）
- 塩化カリウム（1 MのKCl 6.75ミリリットル）（1 M KClを10 mlのH 2 0で0.75グラム=）を
- グルコース（1 M D-グルコース1mlの（1M）の10ml H 2 O中のD-グルコース= 1.80 g）を
- 硫酸マグネシウム4（0.05ミリリットルの1M硫酸マグネシウム）（10ミリリットルのH 2 O中の1MのMgSO 4 = 1.20グラム）
- 20のHEPES（1MのHEPES 1ミリリットル）（1 M HEPES = 10 mlのH 2 O中2.38グラム）
- 塩化カルシウム（1M CaCl 2を 0.05ミリリットル）（10ミリリットルのH 2 O中の1MのCaCl 2 = 1.47グラム）
二重蒸留H 2 O（蒸留H 2 O）のすべてのソリューションを準備します。
- のddH 2 Oを35ミリリットルで、各ソリューションを完成させ、これまで磁気撹拌機で混ぜるlutionが達成される。
- 5.5、6.0、6.5、7.0および7.5のpH値を得るために、1 N KOHまたは1N HClで各溶液のpHを調整する。その後、50ミリリットルの最終容量を脱イオン水で音量を調整します。
- 対策5ニゲリシンのmgおよびストック溶液ナイジェリシン10 mMのを準備するために無水エタノールを670μLに追加します。
注意：ナイジェリシンは非常に毒性であり、細心の注意（手袋、保護メガネとマスク）で処理する必要があります。ナイジェリシンが完全に溶解するまで反転により溶液を混合する。 - 各校正液に10 mMのナイジェリシン（最終濃度10μM）の0.05ミリリットルを追加します。ニゲリシンは、細胞膜透過性を増加させ、細胞外K +濃度の脱分極の存在下で、細胞内および細胞外pHの平衡化を引き起こすイオノフォアである。
- 較正溶液は、4℃で1ヶ月まで保存することができる
2。細胞の調製
- 生物学的な職場の安全の下でyはフード、10％ウシ胎児血清および抗生物質を補充した増殖培地2mlにある35ミリメートル×10mmの培養皿中の種子細胞。 24時間後に約50％コンフルエンスを確実にするために必要な細胞の量を使用する。
注：我々の実験では、HT-1080細胞株およびプレート培養皿あたり1×10 5個の細胞を使用しています。 - キャリブレーションに使用する実験とプレート5追加の培養皿のために必要な培養皿の数を決定します。
- 少なくとも24時間、37℃/ 5％CO 2インキュベーターに置き培養皿。
3。のpHセンシングプローブの調製を
- のddH 2 0での蛍光pHプローブ8-ヒドロキシピレン-1,3,6トリスルホン酸三ナトリウム塩（HPTS /ピラニン）の1Mストック溶液を準備します。この溶液を室温で保存し、光から保護されなければならない。
- 1 mMの5のストック溶液を調製 - （および6） - カルボキシseminaphthorhodafluorアセトキシメチルエステル酢酸（C-SNARF-1 AM; therea呼ばれるFTER SNARF-1）のDMSO 1.76ミリリットルでSNARF-1 1mgを溶解することにより。徹底的に繰り返さピペッティングにより混和する。 SNARF-1溶液は-20℃で保存し、光から保護されなければならない。
4。細胞標識
- 16時間生細胞イメージングの前に、完全培地の2ミリリットルを含む各培養皿に1M HPTS原液2μL（最終濃度1 mm）を追加します。
- インキュベーターに培養皿を返します。 HPTSプローブは、したがって、ラベルにプローブはピノサイトーシスによって取り込まれなければならない小器官、細胞非透過性である。この条件は、HPTSによる細胞のインキュベーションは、血清添加培地中で行われることを必要とする。
- HPTSとのインキュベーション後、滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、少なくとも2時間、無血清培地2mlを加える。 SNARF-1とのインキュベーションは、血清は、プローブの取り込みを防ぐことができるため、無血清培地中で行う必要がある。
- AFを得るために、1 mMのSNARF-1のストック溶液10μlを追加inal 510μMの濃度と細胞は薄暗い光の下で、37℃で20分間インキュベートすることができます。 C-SNARF-1濃度およびインキュベーション時間は、細胞型に応じて変化し得る。
- インキュベーションの最後に、滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、無血清培地2 mlを加える。
pHの調節因子の5。追加
- 方法は、細胞内のpHの変化を検出することができるかどうかを評価するために、細胞内pHを調節する異なる試薬を使用することができる。
- フィロマイシンA1、V型ATPaseの5の特異的阻害剤
- + / H +交換アイソフォーム1（NHE-1）6 NA
- NH 4 Clで、細胞内のpHが7を増加弱塩基
- 上記の試薬のストック溶液を準備します。
- フィロマイシンA1：100μMの原液を得るために、DMSOを160μlにバフィロA1の10μgのを追加
- EIPA：obtaiメタノールの1.67ミリリットルにEIPA 25mgを追加50 mMの最終濃度はna
- NH 4 Cl を 1 mMの最終濃度を得るためのddH 2 O 10ml中の塩化アンモニウム0.53gを溶解する。
注：すべての原液を-20℃で保存し、光から保護しなければならないフィロマイシンA1を除いて4℃に保たれている必要があります。 - 後述するように別々の培養皿に、試薬の1つを追加します。
- 100μMのフィロマイシンA1（最終濃度100 nm）で2μL
- 50 mMのEIPA（最終濃度25μM）の1μL
- 1M 塩化アンモニウム（最終濃度20 mM）を40μlの
- 37℃で30分間、細胞をインキュベート
- 画像取得に進みます。
6。生細胞イメージング顕微鏡の仕様および取り込み設定
- 使用して生細胞イメージングを行う40Xの目的は、スペクトル反転走査型共焦点microscoに搭載された電動XYステージ、環境的に制御（温度、湿度、CO 2）ステージインキュベーターでガラス底培養皿を収容するチャンバを備えたPE。
- ここで使用した共焦点装置（オリンパスFV1000）が装備されている。
- ダイオードレーザーは405nm
- 40 mWのアルゴンレーザー（458 nmの、488 nmの、515 nm）を
- ヘリウムネオンレーザー（543 nm）と
- 蛍10X目標、NA0.4
- LUCPLFLN 40X目標、NA0.60
- PLAPONSC PLAN APO 60X油目標、NA1.4
- ダイクロイックミラーDM 405/458/488/543
- SDM 560およびSDM 640ダイクロイックフィルター
- BA655-755バリアフィルタ
- ビームスプリッタBS20/80
- 画像収集および分析のためのデータ解析ソフトウェア、
- ステージのインキュベーターを37℃に温めており、顕微鏡が設定されると、以前に共焦点ステージイメージング室にHPTSとSNARF-1とインキュベートした培養皿を置く。
- A関心領域の位置を押え上げは、ソフト取得の設定は、図1を調整する。
- 2仮想チャネルセットを設定します。
- 525 nmおよび570での543 nmおよび放射コレクションのSNARF-1の励起 - - 600 nmの505で405 nmおよび放射コレクションでHPTSの励起に対応している第一段階を開始する。
- 525 nmおよび640で543であり、発光のコレクションのSNARF-1の励起 - - 650 nmの505で458 nmおよび放射コレクションでHPTSの励起に対応している第二段階を開始します。
- 共焦点開口は、デフォルトでは175程度に設定し、最適な絞り値を手動で300程度に設定される必要がある。
- 0.4ミクロンの厚さの連続水平光学切片（800×800ピクセル）を積層して画像を撮影。
注：40Xの目的は、同時に複数のセルを観察することが有用であるとオルガネラの閲覧に適しています。しかしながら、空間分解能と信号強度があるベティrは、60X油対物レンズを用いて達成した。さらに、2つの色素の間には励起または発光のクロストークは存在しない。
pHのセンシングプローブの7。校正
- キャリブレーションの前に、以前にHPTSとSNARF-1とインキュベートした培養皿から培地を除去し、滅菌PBSで2回洗浄した後、5キャリブレーションソリューションの1の2ミリリットルを追加します。
- 共焦点段階室に培養皿を置きます。
- 以下の設定に応じてタイムラプス画像取得に進みます。
- 実験用の画像や間隔期間の回数を設定します。
注：私たちは通常、最大30分間の画像間の1分間のインターバルを使用しています。 - 各画像の取得との間で閉じるようにシャッターをプログラムします。
- 実験用の画像や間隔期間の回数を設定します。
- 表計算ソフトで分当たりの蛍光強度を記録し、蛍光強度が安定している時間を決定する。 20分 - 細胞内のpHは、15日以降は通常安定している。
- REPEATは、残りの各校正液のための新しい培養皿を用いて、7.4に7.1を繰り返します。
8。データ収集
- キャリブレーションが行われた後、フィールド当たり15〜20個の細胞を含む4-5ランダムに選択されたフィールドからのサンプルデータを取得する。 2つの画像は、フィールドごとに得られる。HPTS標識（小胞）とSNARF-1ラベル（細胞質ゾル）のための第二のために1。
- バックグラウンド蛍光（細胞外領域）をデジタル両方のプローブの蛍光画像から減算される。それぞれの保存された画像からの標識小胞および細胞質ゾルは、バイナリマスクを使用して選択される。各pH感知プローブは、蛍光強度を数値スケール（0-4,095階調スケール）で測定される。細胞小器官または細胞質内のすべてのピクセルの平均強度が計算され、値は、蛍光比を計算するために使用される。
9。データ解析
- 様々なソフトウェアパッケージは、データ分析のために市販されている。 すなわちFLUOVIEWソフトウェア。
- スプレッドシートでは、レコードの値と次のように蛍光比を計算する：HPTSの場合には、R =（458nmの F / F 405 nm）を、SNARF-1の場合、R =（F 644ナノメートル / F 584 nmの ）。
- このようなグラフパッドプリズムなどの科学的なグラフ作成ソフトウェアを使用してデータをプロットします。プロットは、pH（X軸）の関数としての蛍光比（Y-軸）を描くべきである。カーブフィッティングは、非線形回帰を使用して達成される。
- ステップ8.2で説明したように、サンプルの蛍光強度を収集し、蛍光比を計算する。 pH値に比率を変換するために較正曲線を使用する。
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Representative Results
細胞内のエンドソーム/リソソーム細胞区画の両方におけるpHの同時測定のために、レシオメトリック蛍光性pH感知プローブSNARF-1及びHPTSを用いた。 HPTSはエンドソーム/リソソーム区画のレシオメトリックpH測定を可能にするのに対し、SNARF-1は、細胞質ゾルコンパートメントに制限されています。 16時間HPTSとセル負荷は、エンドソーム/リソソーム4での選択的局在することができます。 pHが感知プローブを装填HT-1080細胞から記録された蛍光の典型的な例は、 図2Aに示されている。 HPTSはエンドソームやリソソームのコンパートメントの両方を標識することを示す証拠はアレクサ546コンジュゲートトランスフェリン（エンドソーム）または蛍光lysotrophicプローブ（リソトラッカーディープReddye）との共染色により得られた。データは明らかに、HPTSは両区画図2（a）に染色されたことを示した。
上述の方法を用いて、生きた細胞の細胞内pH値を用いて決定した各pH感受性色素のレシオメトリック特性に基づいて各プローブ図2Bおよび2Cの検量線。 5キャリブレーション溶液はpH単位に蛍光強度に変換するために使用した。 3独立したキャリブレーションからのデータは各pHセンシングプローブ図2cのために報告されています。各データポイントは、HPTS又は所与のpHでのSNARF-1の584分の644 nmの発光波長に対して405分の458 nmの励起波長における蛍光強度の比を表す。両方のプローブについての較正曲線は、最高の指数方程式図2Cを装着した、非直線関係を示した。細胞区画に関連したpH変化を検出するための方法の効率は、NH 4 Clで、細胞内pHを増加させる弱塩基、バフィロマイシンA1、V-ATPアーゼとEIPAの薬理学的阻害剤、NHEと、ライブHT-1080細胞で評価した1阻害剤。 塩化アンモニウムは、膀胱内にトリガとCYTO6.35から7.10と7.00から7.40 solic pHが増加すると、それぞれ図3Aおよび3Bに示す 。バフィロA1は、細胞質ゾルのpHを変化させることなく、エンドソームやリソソーム区画のアルカリ化を誘導した。対照的に、EIPAは、未処理細胞の、 図3Aおよび3Bの7.00と比較して6.62のpHに到達するサイトゾルの酸性化を誘導した。
図1の共焦点レーザ走査型顕微鏡の取得設定のブロック図。 （A）第一段階は、ダイクロイック（DM405/488/543/633）ミラーを介して同時に543で405 nmおよびSNARF-1でHPTSを励起するNM設定されています。蛍光発光は、第一のダイクロイックミラー（SDM560）を用いて505〜nmでHPTSについて記録される。 SNARF-1の蛍光放射は、次いでbandpaを通して監視される570から600ナノメートルの範囲内のss干渉フィルタ（B）は、第2の相を同時にHPTS（今まで、458 nm）でSNARF-1（今まで、543 nm）での蛍光発光を収集するように設定されている。レーザービームによって生成されたプローブの励起は、ビームスプリッタ（BS20/80）を通過し、各プローブの蛍光発光は、第1段階で使用されるダイクロイックミラーを介して収集されています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2のpH感知プローブのin situ較正する。 （A）、HPTSおよびHT-1080線維肉腫細胞におけるSNARF-1細胞内局在の代表的な画像。上段の画像は、SNARF-1はHPTのに対し、細胞質を標識することを示しているS関連蛍光は、膀胱内局在を示す。 HT-1080細胞を、アレクサ546共役トランスフェリン（5μg/ ml）をそれぞれ染料又はlysotrophic（リソトラッカーディープReddye）（100 nM）を、と30分間インキュベートした。下部の画像は、HPTSはトランスフェリンおよびlysotrophic色素（60X）と共局在することを示している。蛍光強度の（B）は、pH 6.0およびpH 7.5での較正溶液で15分間インキュベートされた細胞内の両方のpH感知プローブの代表的な画像（C）の関係HPTSとSNARF-1用の比率は、pHの関数としてキャリブレーション·ソリューションを使用して決定。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。私NTのモジュレーションフィロマイシンA1、EIPAおよびNH 4 CLで racellular pHが。薬理学的阻害剤（バフィロA1、EIPA）と細胞内pH調節因子のNH 4 Clでは方法論を検証するために使用された。グラフは、エンドソーム/リソソーム区画（A）またはHPTSおよびSNARF-1を負荷し、NH 4 Cl の存在下または非存在下（対照）で30分間インキュベートしたHT-1080細胞の細胞質（B）（に記録されたpH値を表示する20 mM）を、EIPA（25μM）またはバフィロA1（100nm）である。データは、平均±SEM（** P 0.005、*** P 0.0001）として表されます。
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Discussion
異なる細胞区画の生細胞イメージングで定量的なpH測定を正確に外部の課題に対する細胞応答におけるpH変化を測定するために必要とされる。しかしながら、残る主要なハードルの一つは、簡単かつ具体細胞区画を標的化することである。この点において、いくつかの研究は、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクション8-10によって細胞に導入する細胞内pH指示薬としてのHPTSの使用を強調している。これらの技術は重大な欠点がある、すなわち、エレクトロポレーションは、細胞に広範な被害が発生し、マイクロインジェクションは、特別な装置や技術的なスキルを必要とします。興味深いのは、ヒントンら 、以前にHPTSは、ピノサイトーシスのプロセスによって及びSNARF-1およびHPTSの組み合わせはサイトゾルおよびエンドソーム/リソソーム区画3のpHをモニターするために使用することができることを細胞に取り込まれ得ることを報告している。私たちは、リソソーム/エンドソームcompartm中のpHの変化を記録するために、このプロパティを使用しているライブHT-1080細胞のENT。 HPTSは、蛍光団結合トランスフェリンとの共染色により、リソソーム/エンドソーム区画のマーカーを取得し、またはほとんどリソソームの図にラベルを付ける好酸性染料とし、この区画内に位置していた、そのため、信頼性の高いpH指示薬として役立つ可能性があるという証拠（2）また、異なる細胞区画を標的化する別の細胞内pH調節剤の使用は、バフィロマイシンA1は、特に細胞質のpHを変化させることなく胞内のpHが増加することが示された。対照的に、EIPAは、主にサイトゾルのpHが変化するが、塩化アンモニウム、両方の区画のpHに影響を与えながら、エンドソームおよびリソソームのpHにほとんど又は全く効果がなかった。これらの結果は、SNARF-1及びHPTS同時にこの二つの異なる細胞区画のpH変化をモニターするために使用することができるという証拠を提供した。
ここで説明する方法の一つの重要な特徴は、共焦点レーザー走査顕微鏡の使用である。ほとんどの研究レポ細胞内pH測定に関する文献にRTED分光分析によって行われてきた。使いやすく、迅速なデータ収集を提供するが、このアプローチは、実験中に細胞の観察を可能にしない。それは、較正ステップ中に、酸性下で伸長インキュベーション液（pH5.5）またはアルカリ液（pH8.0）の条件に悪影響を様々な細胞型に影響を与え、アポトーシスを誘発できることを我々の経験であったので、この欠点は、重要でなってもよい。 HT-1080細胞の場合、アポトーシスは、このようにSNARF-1（データは示していない）のpH依存性蛍光を妨害する、赤色自己蛍光をもたらす。この問題を回避するために、我々は、アポトーシスまたは他の細胞の変化の徴候が観察された各校正し、廃棄実験のための別個の培養皿を使用している。 pH測定のための共焦点顕微鏡の使用はまた、データの分析が容易になる。例えば、共焦点蛍光顕微鏡画像の分析は、アーチファクトを破棄するために使用することができ、apoptotiC細胞および背景雑音、計算がより簡単かつ正確に行う。
ここで説明する方法は、他のアプローチに比べて多くの利点を提供していますが、それはいくつかの制限があります。これらの一つは、各プローブに必要な異なる荷重条件に関連する。 HPTSに対して、染料はピノサイトーシスによって取り込まれなければならない。この制限は、細胞が飲作用およびエンドサイトーシス区画のそれによってラベル付けを促進するための血清添加培地中で長時間（ 例えば 12時間）にわたって維持されなければならないことを要求する。対照的に、細胞浸透性SNARF-1は血清含有非特異的エステラーゼによってアセトキシメチルエステル（AM）は、加水分解の可能性を防止するために、無血清培地中でインキュベートする必要がある。これらの制限は、ロード·互換性のない細胞培養条件を必要とする実験プロトコルを除外します。また、酸性媒体へのHPTSの感度は重要な制限である。 図2はfに示すように、458 nmで励起さHPTSのluorescence強度はバックグラウンド値に近い比率でpH6.0以下で最小の変化を示している。 HPTSのこの固有の特性は、例えば、4.0〜5.0という低いpH値を有するリソソームのような非常に酸性細胞区画の研究の場合において考慮されるべきである。しかしながら、我々の知る限り、HPTSは、エンドソーム内pHを測定するために使用することができるのみ利用可能レシオメトリック色素である。例えば、一般に使用されるlysosensor色素は、主に、より酸性リソソーム区画内に分配される。エンドソーム区画内のこの染料の分配の程度は、エンドソームのpHホメオスタシスが変更された細胞における胞内のpHを測定する際の主な欠点である、これらの小胞内のpH値に依存するであろう。
結論として、我々は、本明細書に同時に単一細胞でサイトゾルおよびエンドソームのpH値を測定するためのアプローチを記載する。これは、細胞内のpHの恒常性の研究のために特に重要ですWHERE変異または薬物は、エンドソーム内のプロトンの流出と流入に影響を与えることができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions for calibration | |||
| Sodium chloride | Fischer | L-11621 | |
| Potassium chloride | Fischer | M-12445 | |
| D-Glucose (dextrose) | Fischer | D16-1 | |
| Magnesium sulfate | Fischer | M65-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fischer | M-1612 | |
| Deionized water | N/A | N/A | |
| Nigericin | Calbiochem | 481990 | Toxic by inhalation or in contact with skin |
| Keep protected from the light at 4 °C | |||
| Culture dishes ∅ 35mm | BD Biosciences | 354456 | |
| pH-sensing probes | |||
| 8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) | Life technologies | H-348 | Keep away from the light at room temperature |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Life technologies | C-1271 | Keep away from the light and humidity at -20 °C |
| Dimethyl Sufoxide (DMSO) | Fischer | BP231-1 | Harmful |
| Phosphate buffered saline (PBS) 100X | |||
| Potassium chloride | Fischer | M-12445 | 20 g |
| Sodium phosphate monobasic | Fischer | S369-1 | 115 g |
| Potassium phosphate monobasic | J.T Baker | 3246-01 | 20 g |
| Deionized water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Autoclave and adjust pH to 7.4 | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) 1X | |||
| PBS 100X | N/A | N/A | 50 ml |
| Sodium chloride | Fischer | L-11621 | 40.5 g |
| Deoinized water | N/A | N/A | Bring to 5 L |
| pH modulators | |||
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B-1793 | |
| 5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amiloride (EIPA) | Sigma-Aldrich | A3085 | |
| Ammonium chloride | Fischer | A649-500 | |
References
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- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
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