कैद यौगिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री - उपन्यास सी-डि-जीएमपी effector के प्रोटीन की पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण
Summary
The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.
Abstract
काफी प्रगति दूसरा दूत सी-डि-जीएमपी के संश्लेषण (diguanylate cyclases) और गिरावट (phosphodiesterases) में शामिल एंजाइमों की पहचान और लक्षण वर्णन की दिशा में पिछले दशक के दौरान किया गया है। इसके विपरीत, कम जानकारी इस संकेत अणु सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विविध रेंज को नियंत्रित करता है, जिसके माध्यम से आणविक तंत्र और सेलुलर घटकों के बारे में उपलब्ध है। नाम से जाना जाता प्रेरक प्रोटीन के अधिकांश PILZ परिवार के हैं या कटैलिसीस पर दे दिया है और प्रेरक समारोह को अपनाया है कि diguanylate cyclases या phosphodiesterases degenerated कर रहे हैं। इस प्रकार, बेहतर प्रयोगात्मक विधियों सिलिको भविष्यवाणियों में विश्वसनीय असफल जिसके लिए उपन्यास प्रभावोत्पादक की पहचान करने और मान्य करने के लिए आवश्यक हैं बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला में सेलुलर सी-डि-जीएमपी नेटवर्क को परिभाषित करने के लिए।
हमने हाल ही में करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में एक उपन्यास कैद यौगिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CCMS) आधारित तकनीक विकसित की हैbiochemically की पहचान करने और सी-डि-जीएमपी बंधनकारी प्रोटीन की विशेषताएँ। इस तकनीक को पहले से जीवों 1 की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू होने की सूचना दी गई है। यहाँ हम हम इस तरह के संकेत घटकों की जांच के लिए उपयोग कि प्रोटोकॉल का विस्तृत विवरण देते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम Pseudomonas aeruginosa, सी-डि-जीएमपी डाह और biofilm नियंत्रण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें एक अवसरवादी रोगज़नक़ का उपयोग करें। CCMS सी-डि-जीएमपी नेटवर्क के नाम से जाना जाता है या भविष्यवाणी घटकों के 74% (38/51) की पहचान की। इस अध्ययन में विस्तार से CCMS प्रक्रिया बताते हैं, और छोटे अणु संकेतन में शामिल उपन्यास घटकों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली और बहुमुखी उपकरण के रूप में स्थापित करता है।
Introduction
सी-डि-जीएमपी उनके विकास और व्यवहार के विभिन्न पहलुओं को नियंत्रित करने के लिए सबसे बैक्टीरिया द्वारा इस्तेमाल के लिए एक चाबी दूसरे के दूत है। उदाहरण के लिए, C-डि-जीएमपी कोशिका चक्र प्रगति, गतिशीलता और exopolysaccharides और सतह adhesins 2-4 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। ऐसी प्रक्रियाओं के समन्वय के माध्यम से सी-डि-जीएमपी biofilm गठन, रोगजनक बैक्टीरिया 5 की एक सीमा के जीर्ण संक्रमण के साथ जुड़ा हुआ है जो एक प्रक्रिया को बढ़ावा देता है। सी-डि-जीएमपी एक उत्प्रेरक GGDEF डोमेन 4 बंदरगाह कि diguanylate cyclases (DGCs) नामक एंजाइमों द्वारा synthetized है। कुछ DGCs नीचे सी-डि-जीएमपी बाध्यकारी पर साइक्लेस गतिविधि को नियंत्रित करता है कि एक निरोधात्मक साइट के पास है। सी-डि-जीएमपी की गिरावट एक उत्प्रेरक EAL या HD-ढकोसला या तो डोमेन 6,7 शरण phosphodiesterases की दो अलग-अलग वर्गों (PDEs) द्वारा उत्प्रेरित कर रहा है।
सीधे सी-डि-जीएमपी कि बाँध में जाना जाता प्रेरक प्रोटीन का बहुमत प्रोटीन की केवल तीन वर्गों में से एक हैं: उत्प्रेरकसहयोगी निष्क्रिय GGDEF या EAL डोमेन और PILZ डोमेन, सी-डि-जीएमपी 8 बाध्यकारी पर गठनात्मक परिवर्तन से गुजरना है कि छोटे आणविक स्विच। DGCs, PDEs और PILZ प्रोटीन अच्छी तरह से विशेषता है और उनकी डोमेन के अपेक्षाकृत सुरक्षित रूप से सिलिको में भविष्यवाणी की जा सकती है। एक विशेष रुचि अब सी-डि-जीएमपी effectors के नए वर्गों की पहचान पर केंद्रित है। विभिन्न बाध्यकारी रूपांकनों के साथ कुछ सी-डि-जीएमपी प्रभावोत्पादक Burkholderia cenocepacia में सीआरपी / एफ एन आर प्रोटीन परिवार Bcam1349 या पी में ट्रांसक्रिप्शनल नियामक FleQ के रूप में हाल ही में इस तरह वर्णित किया गया aeruginosa 9,10। इसके अलावा, सी-डि-जीएमपी-विशिष्ट riboswitches हाल ही में पहचान की है और एक सी-डि-जीएमपी-निर्भर तरीके से 11 में जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया था। विभिन्न effectors के सी-डि-जीएमपी बाध्यकारी रूपांकनों ही खराब संरक्षित ऐसे प्रोटीन की पहले से पंजीकृत भविष्यवाणियों मुश्किल बना रहे हैं। इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम एक सी-डि-जीएमपी spe के उपयोग पर आधारित है, जो एक जैव रासायनिक विधि विकसित की है,cific कैद यौगिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री 1,12,13 के साथ संयुक्त।
हमने हाल ही में (CDG-सीसी, चित्रा 1) एक उपन्यास त्रिसंयोजक सी-डि-जीएमपी कैद यौगिक इंजीनियर है 1। इस रसायन पाड़ से बना है: प्रोटीन बाध्यकारी सी-डि-जीएमपी कब्जा करने के लिए चारे के रूप में प्रयोग किया जाता है 1) एक सी-डि-जीएमपी आधा भाग, 2) एक यूवी photoactivatable प्रतिक्रियाशील समूह लिंक को पार करने के लिए इस्तेमाल के लिए बाध्य प्रोटीन के लिए CDG-सीसी और 3) एक बायोटिन streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर लिया प्रोटीन को अलग-थलग करने के लिए। CDG-सीसी सीधे और विशेष रूप से सेल lysates के रूप में अणुओं की जटिल मिश्रण से सी-डि-जीएमपी प्रभावोत्पादक कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कैद यौगिक आधारित हैं और रासायनिक प्रोटिओमिक्स आधारित दृष्टिकोण पहले से जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू होने की सूचना दी गई है, जैसे Caulobacter crescentus, सैल्मोनेला एन्ट्रिका serovar ताकि और पी aeruginosa 1,14।
इस पद्धति पत्र में,हम पी के अर्क का उपयोग कर CCMS प्रक्रिया का गहराई से वर्णन में एक प्रदान एक उदाहरण के रूप aeruginosa। इस अध्ययन को biochemically छोटे अणु संकेतन में शामिल उपन्यास घटकों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली और बहुमुखी उपकरण के रूप में CCMS स्थापित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विशेष देखभाल प्रोटोकॉल के कई चरणों में लिया जाना चाहिए। प्रोटीन एकाग्रता 10 मिलीग्राम की एक एकाग्रता के साथ एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है / एमएल कोशिकाओं विशिष्ट विकास की स्थिति (जैसे biofilms या छोटे कॉलोन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.
Materials
| caproBox | caprotec bioanalytics | 1-5010-001 (220 V) | UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation |
| caproMag | caprotec bioanalytics | included in the CCMS Starter Kit | For easy handling of magnetic particles without pipetting |
| c-di-GMP caproKit | caprotec bioanalytics | upon request | The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| 12-tube PCR strips | Thermo Scientific | AB-1114 | |
| UIS250v sonicator with VialTweeter | Hielscher ultrasound technology | UIS250v and VialTweeter | |
| Miniature French Pressure Cell | Thermo Electron Corporation | FA-003 |
References
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Hengge, R. Principles of c-di-GMP signalling in bacteria. Nature reviews. Microbiology. 7, 263-273 (2009).
- Sondermann, H., Shikuma, N. J., Yildiz, F. H. You’ve come a long way: c-di-GMP signaling. Curr. Opin. Microbiol. 15, 140-146 (2012).
- Schirmer, T., Jenal, U. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signalling. Nature reviews. Microbiology. 7, 724-735 (2009).
- Furukawa, S., Kuchma, S., O’Toole, G. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J. Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., Jenal, U. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J. Biol. Chem. 280, 30829-30837 (2005).
- Ryan, R. P., Fouhy, Y., Lucey, J. F., Dow, J. M. Cyclic di-GMP signaling in bacteria: recent advances and new puzzles. J. Bacteriol. 188, 8327-8334 (2006).
- Habazettl, J., Allan, M. G., Jenal, U., Grzesiek, S. Solution structure of the PilZ domain protein PA4608 complex with cyclic di-GMP identifies charge clustering as molecular readout. J. Biol. Chem. 286, 14304-14314 (2011).
- Fazli, M., et al. The CRP/FNR family protein Bcam1349 is a c-di-GMP effector that regulates biofilm formation in the respiratory pathogen Burkholderia cenocepacia. Molecular Microbiology. 82, 327-341 (2011).
- Hickman, J. W., Harwood, C. S. Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as a c-di-GMP-responsive transcription factor. Molecular Microbiology. 69, 376-389 (2008).
- Sudarsan, N., et al. Riboswitches in eubacteria sense the second messenger cyclic di-GMP. Science. 321, 411-413 (2008).
- Lenz, T., et al. Profiling of methyltransferases and other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS). J Vis Exp. , (2010).
- Köster, H., et al. Capture compound mass spectrometry: a technology for the investigation of small molecule protein interactions. Assay Drug Dev Technol. 5, 381-390 (2007).
- Düvel, J., et al. A chemical proteomics approach to identify c-di-GMP binding proteins in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Microbiological Methods. 88, 229-236 (2012).
- Christen, B., et al. Allosteric control of cyclic di-GMP signaling. J. Biol. Chem. 281, 32015-32024 (2006).
- Balasubramanian, D., Mathee, K. Comparative transcriptome analyses of Pseudomonas aeruginosa. Human genomics. 3, 349-361 (2009).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Stat Appl Genet Mol Biol. 3 (3), (2004).
- Baraquet, C., Harwood, C. S. Cyclic diguanosine monophosphate represses bacterial flagella synthesis by interacting with the Walker A motif of the enhancer-binding protein FleQ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18478-18483 (2013).
- Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins. J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).
- Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15528-15533 (2011).
- DeSantis, K., Reed, A., Rahhal, R., Reinking, J. Use of differential scanning fluorimetry as a high-throughput assay to identify nuclear receptor ligands. Nuclear receptor signaling. 10, e002 (2012).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59, 301-315 (2013).
- Merighi, M., Lee, V. T., Hyodo, M., Hayakawa, Y., Lory, S. The second messenger bis-(3‘-5’)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 65, 876-895 (2007).
- Qi, Y., et al. Binding of cyclic diguanylate in the non-catalytic EAL domain of FimX induces a long-range conformational change. J. Biol. Chem. 286, 2910-2917 (2011).
