Urinblåsa Dilatation Evoked Visceromotor svar som en modell för smärtor i urinblåsan hos möss

Summary

Cirka 3 till 8.000.000 människor i USA lider av interstitiell cystit / blåsa smärtsyndrom (IC / BPS), en försvagande tillstånd som kännetecknas delvis av bäckensmärta. För att studera nervsystemet bidrag till tillstånd är en fysiologisk modell av urinblåssmärta används i möss och råttor.

Abstract

Cirka 3 till 8.000.000 människor i USA lider av interstitiell cystit / blåsa smärtsyndrom (IC / BPS), ett försvagande tillstånd som kännetecknas av en ökad brådska och miktionsfrekvens, samt nokturi och allmän smärta i bäckenet, särskilt vid blåsfyllning eller tömning. Trots år av forskning, orsaken till IC / BPS fortfarande instabil och behandlingsstrategier inte kan ge fullständig lindring till patienter. För att studera nervsystemet bidrag till tillståndet, har många djurmodeller har utvecklats för att efterlikna den smärta och symptom i samband med IC / BPS. En sådan musmodell är urinblåsan buk (UBD). I denna modell är tryckluft ett specifikt tryck som levereras till urinblåsan av en lätt sövda djur under en viss tidsperiod. Under hela förfarandet, trådar i den överlägsna sneda magmusklerna registrerar elektriska aktiviteten från muskeln. Denna aktivitet kallas visceromotor svar (VMR) och jagsa tillförlitliga och reproducerbara mått på nociception. Här beskriver vi de åtgärder som krävs för att utföra denna teknik i möss, inklusive kirurgiska manipulationer, fysiologisk inspelning och dataanalys. Med hjälp av denna modell, kan samordningen mellan primära sensoriska neuroner, ryggmärg sekundära afferenter och högre centrala nervsystemet områden som ingår i blåssmärta bli avslöjad. Denna grundläggande vetenskap kunskap kan sedan kliniskt översättas för att behandla patienter som lider av IC / BPS.

Introduction

Kronisk smärta är officiellt definieras som smärta som kvarstår i cirka tre månader, eller längre än den normala vävnaden läkningstiden ^1. Denna typ av smärta är en av de viktigaste anledningarna till att människor drivs att söka läkare ² och kan kosta upp till $ 635.000.000.000 dollar varje år ^3. Aktuell kronisk smärta copingstrategier anses ålderdomliga, efter årtionden av medicinska framsteg, NSAID (icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel) och opioider är fortfarande den primära behandling som ordinerats av läkare. Men dessa behandlingar är inriktade på alla olika typer av smärta på samma sätt, som ger smärtstillande effekter över hela kroppen i stället för att specifikt fokusera på orsaken till att exakt smärt incident. För att bättre kunna hjälpa dem som lider av kronisk smärta, bör forskningen uppmärksamhet förskjutas mot etiologi och eventuella smärtspecifika behandlingar i samband med de vanligaste orsakerna till kronisk smärta. Målet med denna manuscript är att beskriva en modell för att bättre förstå ett tillstånd som kallas Interstitiell cystit / Smärtsam blåsa (IC / BPS).

IC / BPS är ett försvagande tillstånd som drabbar miljontals människor, främst kvinnor över 40 års ålder ^4. De exakta orsakerna till IC / BPS är inte kända, men prevalensen har kopplats till genetik ^5, särskilda dieter, och höga stressnivåer ⁶ . Symtom på IC / BPS innefattar men är inte begränsade till: Ökad brådska att urinera, ökad miktionsfrekvens, värkande, stickande eller brännande smärta vid blås påfyllning och tömning, och nokturi ^7. Patienter som upplever dessa förhållanden har högre stressnivåer och är mer angelägna ^8. Detta ökad stress leder till ökad smärta, vilket förstärker den ursprungliga stressnivåer. Studier har visat att depression och ångest nivåer minskar efter behandlingar som lindrar urin smärta, vilket effektivt bryta denna positiva feedback-cykel <sup> 9. En av utmaningarna i att upptäcka nya behandlingar för IC / BPS har varit bristen på en grundläggande vetenskap förståelse för smärta i urinblåsan.

För att studera nervsystemet bidrag till tillståndet, har många djurmodeller har utvecklats för att efterlikna den smärta och symptom i samband med IC / BPS. Traditionellt har blåskatarr återskapats i djur med införandet av olika kemikalier såsom senapsolja, aceton, lipopolysackarid, saltsyra, och cyklofosfamid i urinblåsan. Men inga utländska agenter finns i den sterila urinen av IC / BPS patienter, alltså ifrågasätta giltigheten av dessa modeller. En annan musmodell av urologiska smärta är urinblåsan buk (UBD) ^10. I denna modell är tryckluft ett specifikt tryck som levereras till urinblåsan av en vaken eller lätt sövda djur under en viss tidsperiod. Under hela förfarandet, kablar i den överlägsna sneda magmusklerna rekord elektriska verkhet från muskeln (med en elektromyogram (EMG)). Denna aktivitet kallas visceromotor svar (VMR) och är pålitlig, reproducerbar mått på nociception ^10. Liknande ihålig orgel disten (t.ex. urinblåsa, ändtarm) hos friska frivilliga försökspersoner ger känslor av obehag och betydande ökningar av rapporterade smärta ^11,12, egenskaper som ofta används för att diagnostisera IC / BPS. Således, i samband med el, farmakologiska och optogenetic metoder för stimulering eller hämning, är UBD en användbar och giltig modell för att förstå både det perifera och centrala nervsystemet komponenter i urinblåsan nociception och smärta.

Här beskriver vi proceduren för UBD som för närvarande används i vårt laboratorium inom kvinnliga medlemmar av den gemensamma musstam, C57BL/6J. På grund av svårigheter i kateterisering processen av män, är detta förfarande utförs i honmöss. Detta protokoll har anpassats från den som utvecklats av Ness <em> et al. ¹⁰ och tidigare publicerade från vårt labb ^13. Följande protokoll beskriver fyra primära komponenterna i denna modell på sövda djur: (1) blåskateter och inspelningen elektroden kirurgi (2) partiell anestesi induktion (3) blåsdisten och VMR inspelning, och (4) dataanalys av råa VMR / EMG spår . Subtila skillnader i UBD-VMR förfarande på grund av valet av organism, anestesidjup och induktion, och kroppstemperatur diskuteras nedan.

Protocol

Följande protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Duquesne University och är i linje med riktlinjerna från National Institutes of Health. 1. Kirurgisk implantation av trådelektroder och urinblåsekateter Använda sterila tekniker (total tid 5-10 min) Följande punkter bör vara beredd före start kirurgi: Aktivt övervaka och justera kroppstemperaturen till 37,5 ± 0,5 ° C med användning av övervakningssystemet temperatur …

Representative Results

En illustration av den övergripande UBD-VMR konfiguration kan ses i figur 1A. Ökande trycksteg inducerar en ökning av rå VMR (dvs. EMG) (Figur 1B.) Rå VMR, tryck och stimulans markeringssignal som bör iakttas under inspelning med hjälp digitizer programvara kan ses i figur 2. Den översta kanalen ses i Figur 2 är ett EMG trace (i V). Bakgrundssignalen av EMG spår ska vara stadig och låg amplitud (<0,2 V). Om bakgrunden är hög ell…

Discussion

Hos människor, interstitiell cystit / blåsa smärtsyndrom (IC / BPS) utgör ett betydande kliniskt problem eftersom patienterna har invalidiserande smärta som ofta inte svarar på vanlig smärtbehandling ^15. En av de stora utmaningarna i att förstå och slutligen behandling av kronisk smärta i urinblåsan är att förstå de normala neurala processer som är involverade i svaret på skadliga blåsdisten. För att övervinna denna utmaning krävs en djurmodell av smärtor i urinblåsan. Denna modell bör …

Materials

Infrared heating blanket and monitoring system	Kent Scientific	Right-Temp System	This system is setup to monitor two separate temperatures.  This should include the animal and the heating blanket.  In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp.  However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off.  Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment.
Isoflurane vaporizer	Draeger	Vapor 19.1	Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has mutliple notches between 0 and 2% isoflurane.
Isoflurane	Multiple	n/a
100% Oxygen air tank	Multiple	n/a	For ventilation of animal
Air breathing grade	Multiple	n/a	For bladder distention
24GA 0.56inch IV catheter	BD biosciences	381411	For bladder catheterization
Surgilube (sterile)	Savage Laboratories	0281-0205-02	Any surgical grade lubricate would work fine.
Mineral oil (sterile)	Multiple	n/a
Saline (sterile)	Multiple	n/a
AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008") D, L, No Insulation	Warner Instruments	W4 64-1318	Any silver wire with these specifications will work.  Wire does not need to be "chlorinated."
opthalamic ointment	Multiple	n/a
Small surgical scissors	Multiple	n/a
Sharp forceps	Multiple	n/a
21 Ga needle	Multiple	n/a
Grass amplifier P511 with 3-lead input cable	Grass Instruments	P511 (F-P5IC3/REV1)	This is the "amplifier" used in the protocol.  Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in.
Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent)	Cambridge Electronic Design	1401 Plus	This is the "digitizer" used in the protocol.  Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal.
CED Spike2 software	Cambridge Electronic Design	Spike 2	This is the the "digitizer software" used in the protocol.  Should be from same manufacturer as digitizer.  Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range.
Flow chart from air tank to bladder catheter	n/a	n/a	Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder:  Air tank to 1/4 inch tubing to Gilmont flowmeter to Y connector.  Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer.  Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd Y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing  to a 3rd Y connector.  Branch 1 of Y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter.
Gilmont Flowmeter	Gilmont	GF8321-1401	Multiple brands of flowmeters will work.  For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter).  For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 cc/min (typical mouse rate is 500-1000 cc/min).
4-way gang valve	Elite		This is a specific piece of equipment.  The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures.  In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes.  Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg.
1/4 inch tubing	Multiple	n/a
3/32 inch tubing	Multiple	n/a
"Y" connectors (1/4 and 3/32 inch)	Multiple	n/a
Sphygmomanometer	CVS		Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application.
Timed Pressure Regulator	Custom		This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal.  However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch.   Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see below section 4).  In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis.
IGOR Pro	Wavemetrics	n/a	For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments.