Summary
Приблизительно 3-8 миллионов человек в Соединенных Штатах страдают от интерстициального боли цистит / мочевого пузыря синдрома (IC / БТС), изнурительной состояние, характеризующееся частично тазовой боли. С целью изучения нервной системы вклад в состоянии, физиологический модель мочевого пузыря боли используется в мышей и крыс.
Abstract
Приблизительно 3-8 миллионов человек в Соединенных Штатах страдают от синдрома интерстициальный цистит / болевой мочевого пузыря (IC / BPS), ослабляющее состояние характеризуется повышенной срочности и частоты мочеиспускания, а также никтурия и общей боли в области таза, особенно при заполнении мочевого пузыря или мочеиспускания. Несмотря на годы исследований, причиной IC / BPS остается неуловимым и стратегии лечения не в состоянии обеспечить полное облегчение пациентам. С целью изучения нервной системы вклад в состоянии, многие животные модели были разработаны, чтобы имитировать боль и симптомы, связанные с IC / BPS. Одним из таких мышиной модели является недержание живота мочевого пузыря (UBD). В этой модели, сжатый воздух из определенным давлением поступает в мочевой пузырь легкой анестезии животного в течение заданного периода времени. Во время процедуры, провода, в улучшенных косой мышцы живота записать электрическую активность от мышцы. Эта деятельность известна как ответ висцеромоторный (VMR) и яса надежные и воспроизводимые мера ноцицепции. Здесь мы описываем шаги, необходимые для выполнения этой техники у мышей в том числе хирургических манипуляций, физиологического записи и анализа данных. С использованием этой модели, координация между первичных сенсорных нейронов, спинного мозга вторичных афферентов и высших областях центральной нервной системы, участвующих в боль в мочевом пузыре может быть разгадана. Это базовые знания наука может быть клинически переведена для лечения пациентов, страдающих от IC / BPS.
Introduction
Хроническая боль официально определяется как боль, которая сохраняется в течение примерно трех месяцев, или дольше, чем в обычное время заживления тканей 1. Этот тип боли является одним из главных причин, что люди которые приводятся обратиться к врачу 2 и может стоить до $ 635 млрд долларов в год 3. Текущий хроническая боль стратегии выживания считаются архаичными; после десятилетий медицинских достижений, НПВС (нестероидных противовоспалительных препаратов) и опиоидов по-прежнему являются основными лечения, предписанные врачами. Однако эти процедуры нацелены на все различные типы боли так же,, обеспечивая обезболивающее действие на все тело, в отличие от, акцентируя основное внимание на причине, что точное боли инцидента. Для того чтобы лучше помочь тем, кто страдает от хронических болей, исследования внимание следует сместился в сторону этиологии и возможных болевых конкретных процедур, связанных с наиболее распространенных причин хронической боли. Цель этого manuscriпт является описание модели, используемой, чтобы лучше понять состояние, известное как интерстициальный цистит / болезненного мочевого пузыря синдрома (IC / БТС).
IC / BPS является изнурительным состоянием, которое затрагивает миллионы людей, в первую очередь женщин в возрасте старше 40 4. Точные причины IC / BPS не известны, однако распространенность была связана с генетикой 5, конкретных диет, и высокий уровень стресса 6 . Симптомы IC / BPS включают, но не ограничиваются: более неотложном к мочеиспусканию, увеличение частоты мочеиспускания, боль, пирсинг, или жгучая боль во время наполнения мочевого пузыря и мочеиспускания, и никтурии 7. Пациенты, испытывающие эти условия имеют более высокий уровень стресса и больше озабочены 8. Это увеличило результаты стресс в усиление боли, которая увеличивает оригинальные уровень стресса. Исследования показали, что депрессия и тревога уровни уменьшения следующие процедуры, которые снимают мочевого боль, таким образом, эффективно разорвать этот круг положительной обратной связи С целью изучения нервной системы вклад в состоянии, многие животные модели были разработаны, чтобы имитировать боль и симптомы, связанные с IC / BPS. Традиционно, цистит был воссоздан у животных с введением различных химических веществ, таких как горчичное масло, ацетон, липополисахарид, соляная кислота, и циклофосфамид в мочевой пузырь. Однако никакие посторонние агенты не присутствуют в стерильной моче пациентов IC / BPS, тем самым сомнению законность этих моделей. Другой мышиной модели урологической боли мочевого пузыря живота (UBD) 10. В этой модели, сжатый воздух из определенным давлением поступает в мочевой пузырь активный или легкой анестезии животного в течение заданного периода времени. Во время процедуры, провода в превосходной косой мышцы живота записи электрической Activность от мышцы (с электромиограммы (ЭМГ)). Эта активность известен как ответ висцеромоторный (VMR) и является надежным, воспроизводимым мерой ноцицепции 10. Похожие полый орган живота (например, мочевого пузыря, прямой кишки) у здоровых людей-добровольцев производит чувства дискомфорта и значительное увеличение сообщили боли 11,12, черты, которые часто используются для диагностики IC / BPS. Таким образом, в сочетании с электрическими, фармакологических и optogenetic методов стимуляции или ингибирования, UBD является полезным и действует модель для понимания как периферической и центральной компоненты нервной системы ноцицепции мочевого пузыря и боли. Здесь мы описываем процедуру UBD как в настоящее время используется в нашей лаборатории в течение женских члены общей линии мышей, C57Bl/6J. В связи с трудностями в процессе катетеризации мужчин, эта процедура в основном выполняется в самок мышей. Этот протокол был адаптирован от разработанный Несс <EM> и др. ранее опубликована от нашей лаборатории 13. 10 и. Следующий протокол описывает четыре основные компоненты этой модели в наркозом животных: (1) катетер мочевого пузыря и записи электрод хирургия (2) частичный вводного наркоза (3) вздутие пузыря и записи VMR, и (4) анализа данных сырьевых следов VMR / EMG . Тонкие различия в процедуре UBD-VMR из-за выбора организма, глубины анестезии и индукции, и температуры тела, обсуждаются ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол был одобрен Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Duquesne University по и согласуется с руководящими принципами от Национальных Институтов Здоровья.
1. Хирургическое Имплантация проволочных электродов и мочевого пузыря катетер в стерильных (общее время 5-10 минут)
- Следующие пункты должны быть готовы до начала операции:
- Активно отслеживать и регулировать температуру тела до 37,5 ± 0,5 ° С с использованием системы мониторинга температуры с батарейным питанием грелку и тела животного датчика температуры (Список Материалы) Подключите систему автоматического к инфракрасной лампой низкого номинальной мощностью для дополнительного контроля температуры тела.
- Необходимое оборудование для анестезии изофлюраном включает сжатый воздух (например, 100% O 2), изофлюран испаритель, ИФ, ИФ индукции камеры (для начальной нокдаун), носовой конус, и система выпуска.
- Соберите тыс.е надлежащие хирургические инструменты, внутривенного катетера, и электроды (список Материалы)
- Вызвать состояния анестезии в индукции камеры на 2-3% изофлуран. Удалить мышь из камеры, когда рефлекса теряется (0-1 мин).
- Наведите мышь в носовом конусе с 2-2,5% изофлураном. Зажмите палец, чтобы проверить на полных анестезии. Там не должно быть никакого ответа от животного. Запуск таймера.
- Поместите 1 каплю глазной мази на каждый глаз мыши.
- Включите курсор так спинной стороны направлена вниз.
- Вставьте катетер через уретру в мочевой пузырь.
- Опустите катетер в хирургическом смазки для смазывания катетера.
- Аккуратно прижмите отверстие мочеиспускательного канала с острыми щипцами перпендикулярных к телу животного. Проведение катетер с 2-й набор щипцов, аккуратно вставьте катетера конец в уретру под углом перпендикулярно к телу животного.
- Когда катетер вошло в уретре ~ 1-2 мм, аккуратно регулировать катетер так, что теперь параллельно корпусунаправленный к голове. Это движение необходимо, чтобы избежать лобковой кости.
- Аккуратно нажмите катетер к телу мыши. Катетер должен скользить в полость тела плавно и без сопротивления. Не заставляйте катетер. Если катетер не входит плавно вернитесь в перпендикулярном положении катетера и начать все заново.
- С катетер вставлен в мочевом пузыре, мягко надавите на живот мыши изгнать содержимое мочевого пузыря. Удалите всю мочу из катетера, нажав небольшой кусочек бумажного полотенца в отверстие катетера. Если бумага полотенце смачивают с мочой, заменить. Удалить мочу непрерывно в течение всего оставшегося протокола в том числе во время живота пузырь экспериментов (см. Протокол 3 ниже.)
- Вставьте две серебряные провода на левую мышц брюшного пресса и один серебряной проволоки в груди (как на основание.)
- Используйте спирт или йод для дезинфекции площадь боковой справа от катетера (животного левая сторона тела.)
- Expose левую брюшной мышцы.
- Держите кожу около левой брюшной мышцы с щипцами. Сделайте небольшой 1-2 см разрез с средних хирургическими ножницами.
- Вставьте кончик ножниц в разрез и аккуратно расширить разрез до 2 см.
- Используйте пинцет для перемещения облегающего фасции выставить верхняя косая брюшной мышцы. Будьте осторожны, чтобы не порезать / копировать любой из крупных кровеносных сосудов, которые расположены в этом регионе.
- Согните три серебряные провода в два раза. Используйте острый 21 г иглы взять небольшой кусочек мышцы. Затем нажмите иглу через мышцы. При установке в мышцах быть осторожны, чтобы не проколоть любые внутренние органы и не побуждать ненужного повреждения мышцы.
- Палка свободный конец одной серебряной проволоки в отверстие 21 G иглу. Осторожно потяните иглу обратно через мышцы, чтобы привлечь серебряную проволоку через мышечных укуса. Когда игла свободен от мышц, осторожно потяните серебряную проволоку через мышцы, пока петля в проводе не находится на одном уровне смышцы укус.
- Повторите шаги 1.7.3-1.7.4 для второй мышечной проволоки. Этот провод должен быть помещен ~ 0,5 см от первой мышечной проволоки. Важно, что эти два провода не трогать после введения.
- Вставьте третий серебряной проволоки (земля) в грудь, ниже сердца.
- Используйте острый 21 г иглы взять небольшой кусочек кожи (не стоит надрезать или бритья кожу) и нажмите иглу через кожу.
- Вставьте серебряной проволоки, как описано выше, и тянуть через кожу.
- Поместите небольшое количество 37,5 ° C стерильный минерального масла над открытыми мышц, чтобы держать их влажной и тянуть за кожей, насколько открытой мышцы насколько это возможно.
- Введите 0,5 мл физиологического раствора подкожно, чтобы помочь сохранить уровень жидкости во время последующих шагов.
- Аккуратно свернуть животное на бок так, чтобы температура тела может быть легко поддерживать.
2. Частичное Анестезия Шаг вниз Процедура (Тотал Время ~ 75 мин)
Следующий протокол анестезии был одобрен Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Duquesne University по и согласуется с руководящими принципами от Национальных Институтов Здоровья.
- Сразу после раздела I (см. выше) будет завершена, нижняя изофлюран до 1,5%. Держите на этом уровне в течение 15 мин.
- Нижняя изофлуран таким образом, что животное частично под наркозом.
- Нижняя изофлюран на 0,125% каждые 15 мин до выставки животных ответом сгибание до ног крайнем случае, но не озвучить или иным двигаться.
- Как правило, уровень 0,8-1,0% изофлураном является оптимальным, однако уровни могут изменяться в зависимости от различий в анестезии установок. Вокализ и / или передвигаться очень редкие случаи, когда анестезия на должном уровне.
. 3 Электромиограмма (ЭМГ) Запись Во время пузыря живота с градуированных давлениях (15-75 мм рт.ст.) (общее время - переменная, в зависимости от эксперимента)
- Настройка усилитель, дигитайзер и программное обеспечение для записи. В таком случае, дигитайзер имеет один вход для усилителя и два входа для регулятора давления (давление и стимулом маркеров входов, см. ниже раздел 3.1.2). Точное оборудование и программное обеспечение установки настраивается (см. список материалов для конкретных инструкций).
- Настройка системы для доставки конкретные всплески давления воздуха к животному. Эта система называется "таймерной регулятора давления» в следующей методике. Это позволяет для автоматизированного поставки под давлением, включая цифровую форму давления воздуха, контроля пробного длины, в том следственном интервала автоматизации, контроля пробного числа, и начала стимула цифровой сигнал (см. Андерсон и др.. 14 для схемы из приурочен регулятора давления).
- Установите регулятор потока до 60 мм рт.ст. (проверка давления с использованием аналогового сфигмоманометром.)
- Установите регулятор приурочен давления доставить 20 секундный интервал prepressure (это будет стимулом сигнал 2В записан в дигитайзер программного обеспечения), а затем растяжения полости матки давление импульса 20 сек.
- Запустите суда (prepressure интервал + живота давление триал). Когда суд фактическое давление начинает, дважды проверьте давление с помощью 3 сфигмоманометры, подключенных к системе.
- В ходе судебного разбирательства растяжения полости матки давление, сильный сигнал ЭМГ (> 0,5 В) должны соблюдаться во время и, возможно, после сек живота 20. Животное может проявлять abdomiНАЛ движение, но животное не должно озвучить или иным двигаться. Хотя и редко, если наблюдаются аномальные движения или вокализации, повысить уровень ИФ.
- Многие исследования использовать градуированные distensions начиная при низком давлении (10-15 мм рт.ст.) и работает до вредных давлениях (75-80 мм рт.ст.) в 10-15 шагом мм рт. Смотреть репрезентативные результаты ниже Например следов при различных давлениях.
- Типичные испытания включают в себя интервал 20 сек prepressure, вздутие давление испытание 20 сек, и 1-2 мин Интервал между.
- Выполните три Вспучивания на каждом давлении, а затем в среднем по трем испытаний (для получения одного ответа висцеромоторный для каждого давления). В альтернативном способе, сerform пять distensions на каждом давлением, отказаться от высоких и низких испытания, а затем в среднем оставшиеся три ответа.
4. Анализ сырье ЭМГ Следы
- Анализ ответов висцеромоторный (т.е. EMG записи) легко сделать с помощью бортового программного обеспечения дигитайзер или через программу стороннего (Список Материалы) Следующие инструкции приведены общие инструкции, которые могут быть использованы для анализа этих данных с помощью нескольких программ или с помощью ручного анализа .
- Чтобы экспортировать EMG, давление, и сигнальные стимулом данные дигитайзер программного обеспечения выполните следующие действия:
- Откройте экспериментальный файл.
- Нажмите кнопку "Файл", "Экспорт в".
- Изменить тип файла на "таблица текст (. TXT)," имя файла и нажмите кнопку "Сохранить".
- В рор-окно, изменить выходную частоту сэмплов "1000," изменить время начала сбора данных момент начала и изменить время окончания, чтобы "MaxTime ()". Установите флажок маркировку "выход временного сдвига так первая строка 0.0 сек, "и нажмите" ОК ".
- Данные теперь будут экспортированы в текстовый файл, который можно открыть в различных программах. Файл должен содержать четыре столбца (таймер, VMR (ЭМГ), давление, Стимул).
- Для каждого подопытного животного испытания, выполните следующие математические операции.
- Устранить сигнал EMG для всего набора данных путем вычисления абсолютного значения каждого момента времени.
- Определить среднюю реакцию ГРП в разделе о предпосылках эксперимента.
- Вычтите эту среднюю фона EMG ответ от всех ректификованного точки данных в эксперименте для получения фона исправленный набор данных.
- Определить площадь под кривой (AUC) для каждого 20 с предварительноИнтервал давления в фоновом режиме скорректированного набора данных.
- Определите AUC для каждого 20 сек суда живота давление в фоновом скорректированного набора данных.
- Разделите каждый живота давление пробную AUC (полученного на стадии 4.3.5) по самой низкой интервала prepressure AUC от всего эксперимента (полученного на стадии 4.3.4.). Это нормированные и фоновая скорректированная AUC за каждый полный суда растяжения полости матки давление.
- Для каждого подопытного животного, в среднем несколько нормированные испытания от одного давлении с получением нормализованное VMR в вольтах * сек (VSEC).
- Выполните соответствующие статистические данные о данных в зависимости от эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Иллюстрация общей установки UBD-VMR можно видеть на фиг.1А. Шаги Повышение давления вызывают увеличение сырьевого VMR (т.е. ЭМГ) (рис. 1В). Сырой VMR, давление, и стимулом маркер сигнал, что следует соблюдать во время записи с помощью дигитайзер программного обеспечения можно увидеть на рисунке 2. Верхний канал видели в Рисунок 2 является следом ЭМГ (в V). Фоновый сигнал следа EMG должна быть устойчивой и низкой амплитуде (<0,2 В). Если фон является высоким или содержит спорадические большие шипы (> 0,5 В) провода и настроек усилителя может нуждаться в корректировке. В некоторых случаях оберточной провода (от мыши к усилителю и / или усилитель к дигитайзер) в фольге может уменьшить шум. Середина канала на рисунке 2 показывает сигнал давления как количественно приурочен регулятора давления в мм рт. Следует отметить, что сигнал начала представляет собой кривую. Это происходит потому, полная вздутиемочевой пузырь не мгновенно. После того, как сигнал давления достигает максимального значения для этого судебного разбирательства (например, 75 мм рт.ст. на рисунке 2), давление должно оставаться на этом максимального значения. В отдельных случаях, воздух может вытекать из уретры вокруг катетера. Это происходит чаще всего при высоких давлениях (например.> 60 мм рт.ст.), можно наблюдать по изменению амплитуды сигнала давления, и может быть уменьшена путем добавления небольшого количества смазочного материала вокруг хирургического отверстие мочеиспускательного канала. Окончательный канал (в нижней части рисунке 2) показывает канал маркера стимула. Маркер канала стимулом показаны два отдельных сигналов. В начале интервала prepressure существует мгновенный сигнал маркер 2 V. Этот сигнал может быть использован для автоматизации процесса анализа данных для данного эксперимента. В частности, можно запрограммировать систему анализа данных для сканирования через файл данных в поисках стимула маркеров, которые возвышаются над 1,5 В. Это позволяет системе анализа данных для quicklу найти каждый полный суда. Второй компонент стимула канала является сигналом V 1, что происходит в течение всего процесса растяжения полости матки давление. Опять же, наличие этого второго сигнала может быть использована для облегчения анализа данных.
Репрезентативные данные из одного экспериментального животного можно видеть на фиг.3 и в таблице 1 животное было растянутый три раза на каждой из следующего давлением. (. Фиг.3А; табл. 1) 15, 30, 45, 60, и 75 мм рт.ст. три Вспучивания усредняются и представлен в виде одной точки данных на графике. Обратите внимание, что нормированные сигнал увеличивается постепенно с увеличением мочевого пузыря давление живота. После этого первого набора живота, это животное получил два дополнительных комплектов градуированной живота мочевого пузыря. Как видно на фигуре 3В, второй и третий наборы Вспучивания производится подобные VMRs (на каждом давления.) Эти три комплекта Вспучивания произошло свыше 2,5 ч. периодическуюод демонстрируя стабильность настройки записи и воспроизводимость стимула UBD и VMR ответ в одного животного. Важно отметить, что долгосрочная стабильность этого преп происходит только тогда, когда изофлуран анестезии постепенно вышел вниз в течение 1 часа. Короче процедура анестезия может привести к прогрессирующей потере в сигнале UBD VMR с каждым набором Вспучивания (неопубликованные наблюдения, Садлер и Kolber.) Другим важным фактором в стабильности системы UBD VMR является поддержание стабильной температуры тела. Как видно на рисунке 4, UBD VMR (в ответ на 60 мм рт живота) значительно ниже в 33,5 ° C температуры тела по сравнению с 37,5 ° С.
Рисунок 1. Ответы висцеромоторный (VMR) от UBD. (А) схематическис из установки UBD. Сжатый воздух поступает в мочевой пузырь через уретральный катетер. Во distensions, электроды в животе записи мышц EMG. На протяжении всей процедуры, температура поддерживается с помощью батарейках грелку и накладные лампы. (В) Пример ЭМГ прослеживает во UBD. По мере увеличения давления, электрическая мощность от брюшных мышц увеличивает конгруэнтно.
Рисунок 2. Скрин-шот с указанием данных, во время UBD судебное разбирательство. Три канала показаны. Верхний канал показывает сырой EMG след (в V.) Средний канал показывает давление (в мм рт), что в настоящее время доставлены в мочевой пузырь. Нижняя линия показывает канал маркера стимул, который указывает на начало интервала prepressure и всего процесса растяжения полости матки давление. Изображение для 40 сек полного судебного разбирательства (20 сек интервал prepressure плюс 20 живота давление сек суд.)
Рисунок 3. Характерные данные, показывающие, дифференцированный VMR. (А) Нормированные VMR постепенно увеличивается с ростом давления (15-75 мм рт.ст.) доставлены в мочевом пузыре мыши. (В) Последующие наборы Вспучивания мочевого пузыря (15-75 мм рт.ст. = 1 комплект) показывают, что аналогичные VMRs по сравнению с первым набором Вспучивания.
. Рисунок 4 Температура тела снижается UBD VMR снижение температуры тела от 37,5 ° С до 33,5 ° С приводит к значительному уменьшению в UBD VMR. (П = 6;. Паре Т-тест * P <0,05)
Таблица 1. Типичные данные для полного набора Вспучивания. Таблица показывает данные, включая растяжения полости матки давление AUC, prepressure интервал AUC, фон исправленный живота давление AUC и нормализованное живота давление AUC. Для каждого давления, животное получил три живота испытания. Среднее значение нормированной растяжения полости матки давление AUC на каждом давлении приведена на рисунке 3А.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
У людей, интерстициальный цистит / мочевого пузыря болевой синдром (IC / БТС) представляет собой значительный клиническую проблему, потому что пациенты изнурительной боли, которая часто не реагируют на регулярной лечения боли 15. Одна из основных проблем в понимании и в конечном счете лечения хронической боли в мочевом пузыре, чтобы понять, нормальные нервные процессы, которые участвуют в борьбе с вредными живота мочевого пузыря. Для того чтобы преодолеть эту проблему, животной модели боли мочевого пузыря является необходимым. Эта модель должна быть воспроизводимыми, стабильной и легко измерить. К счастью, Несс и его коллеги 10 разработали систему, которая может быть использована для исследования физиологических ответов на вредных живота мочевого пузыря.
Настройка системы прост и может быть сделано с помощью прежде всего вне готовых аппаратного и программного обеспечения. Основной пользовательский часть оборудования, участвующего в системе UBD VMR является регулятором приурочен давление. Эта машина предоставляет аналог-Цифровое преобразование давления воздуха и посылает начала стимула маркеры к дигитайзер оборудования. Использование регулятора давления таймерной значительно упрощает анализ данных, автоматически синхронизации стимул давления с записанной ЭМГ (т.е.. VMR) Это важно, поскольку VMR не обязательно начинать именно когда мочевой пузырь растянут первого и VMR часто поддерживают в течение короткий период (<5 сек) после окончания живота. Тем не менее, при тщательном синхронизации, можно было легко выполнить процедуру UBD VMR с вкл / выкл регулятора для управления живота включения / выключения и таймер, который находится в синхронизации с записанного сигнала EMG.
Основным преимуществом системы UBD VMR для допроса роль нервной системы в боль в мочевом пузыре в том, что ответы на градуированных давлении вздутие мочевого пузыря падать вдоль стандартной кривой с возрастающим давлением индуцирует повышение VMRs. Это позволяет исследователю легко определить, если экспериментальный человекipulation вызывает увеличение или уменьшение VMR на обоих безобидных и ядовитых давления распирания мочевого пузыря. Кроме того, сигнал от одного животного является очень стабильным во времени, так что несколько патронов градуированных живота может быть сделано (фиг.3В). Это позволяет исследователи, чтобы получить исходные UBD VMR а затем манипулировать животное (например, доставить лекарственное средство) для в-субъектных соответствия 13. Исследователи использовали систему UBD-VMR (в мышей и крыс) для записи или манипулировать спинного мозга нейронов заднего рога 16 и другие нейроны в центральной нервной системе (например, ростральной вентральной мозгового вещества 17 или миндалина 13,16.) Эти исследования и другие продолжают добавить к нашему основному научному пониманию роли различных компонентов нервной системы при обработке мочевого пузыря сенсорной информации и, в конечном счете субъективным боль ощущается в этом ноцицептивной входа. В то время как система UBD VMR включает в себя множество экспериментальных преимуществаповторно некоторые ограничения модели. Во-первых, в то время как висцеральный живота мочевого пузыря вызывает субъективные ощущения "боль" в организме человека невозможно знать, если брюшные записи ЭМГ на мышах действительно представитель боли. Тем не менее, ответы UBD VMR тормозятся общих анальгетиков предполагая, что VMR является ответом боль-как. Во-вторых, в настоящей системе UBD-VMR, животных анестезируют во время записи. Хотя сравнение в прямом эфире по сравнению с наркозом UBD VMR подтвердил правильность использования анестезии 10, есть возможные неизвестные эффекты изофлураном на боли, как ответов. В-третьих, описанный протокол не хирургия выживание, так что несколько записей из индивидуальных мышей с течением времени не представляется возможным. Тем не менее, использование модели UBD-VMR, а также других висцеральных систем болевых позволит для более полного понимания висцеральной боли и приведет к новым терапевтическим путей для пациентов, страдающих от IC / BPS и других внутренних органов болевых состояний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность д-ра. Роберт Gereau, Генри Лай, и Лара Крок за их полезные помощь в создании этой системы. Мы также хотели бы отметить источники финансирования для этой работы (BJK - Международной ассоциации по изучению боли Ранняя карьера исследования Grant по результатам проверки | Дизайн Фонд по INGER & JENS БРУУНА и Duquesne University Hunkele страшных фонда заболеваний).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared heating blanket and monitoring system | Kent Scientific | Right-Temp System | This system is set up to monitor two separate temperatures. This should include the animal and the heating blanket. In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp. However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off. Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment. |
| Isoflurane vaporizer | Draeger | Vapor 19.1 | Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has multiple notches between 0-2% isoflurane. |
| Isoflurane | multiple sources | n/a | |
| 100% Oxygen air tank | multiple sources | n/a | For ventilation of animal |
| Air breathing grade | multiple sources | n/a | For bladder distention |
| 24 G 0.56 in IV catheter | BD Biosciences | 381411 | For bladder catheterization |
| Surgilube (sterile) | Savage Laboratories | 0281-0205-02 | Any surgical grade lubricate would work fine. |
| Mineral oil (sterile) | multiple sources | n/a | |
| Saline (sterile) | multiple sources | n/a | |
| AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, No Insulation | Warner Instruments | W4 64-1318 | Any silver wire with these specifications will work. Wire does not need to be "chlorinated." |
| Ophthalmic ointment | multiple sources | n/a | |
| Small surgical scissors | multiple sources | n/a | |
| Sharp forceps | multiple sources | n/a | |
| 21 G Needle | multiple sources | n/a | |
| Grass amplifier P511 with 3-lead input cable | Grass Instruments | P511 (F-P5IC3/REV1) | This is the "amplifier" used in the protocol. Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in. |
| Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent) | Cambridge Electronic Design | 1401 Plus | This is the "digitizer" used in the protocol. Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal. |
| CED Spike2 software | Cambridge Electronic Design | Spike 2 | This is the the "digitizer software" used in the protocol. Should be from same manufacturer as digitizer. Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range. |
| Flow chart from air tank to bladder catheter | n/a | n/a | Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder: Air tank to 1/4 in tubing to Gilmont flowmeter to y connector. Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer. Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing to a 3rd y connector. Branch 1 of y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter. |
| Gilmont Flowmeter | Gilmont | GF8321-1401 | Multiple brands of flowmeters will work. For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter). For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 ml/min (typical mouse rate is 500-1,000 ml/min). |
| 4-way Gang valve | Elite | This is a specific piece of equipment. The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures. In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes. Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg. | |
| 1/4 in Tubing | multiple sources | n/a | |
| 3/32 inch Tubing | multiple sources | n/a | |
| "Y" connectors (1/4 and 3/32 in) | multiple sources | n/a | |
| Sphygmomanometer | CVS | Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application. | |
| Timed Pressure Regulator | custom | This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal. However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch. Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see Protocol 4). In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis. | |
| IGOR Pro | Wavemetrics | n/a | For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments. |
References
- Merskey, H., Bogduk, N. Classification of Chronic Pain. , IASP Press. (1994).
- Gureje, O., Korff, M. V., Simon, G. E., Gater, R. Peristent pain and well-being. A World Health Organization study in primary care. J. Am. Med. Assoc. 280, 147-151 (1998).
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J. Pain. 13, 715-754 (2012).
- Berry, S. H., et al. Prevalence of Symptoms of Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis Among Adult Females in the United States. J. Urol. 186, 540-544 (2011).
- Tunitsky, E., et al. Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis in twin sisters. J. Urol. 187, 148-152 (2012).
- Tettamanti, G., et al. Influence of smoking, coffee, and tea consumption on Bladder Pain Syndrome in female twins. Urology. 77, 1313-1317 (2011).
- Warren, J. W., et al. Harrison's Principles of Internal Medicine. Longo, D. L., et al. , McGraw-Hill. New York. (2012).
- Baldoni, F., Ercolani, M., Baldaro, B., Trombini, G. Stressful events and psychological symptoms in patients with functional urinary disorders. Perceptual Motor Skills. 80, 605-606 (1995).
- Tannenbaum, C., Gray, M., Hoffstetter, S., Cardozo, L. Comorbidities associated with bladder dysfunction. Int. J. Clin. Practice. 67, 105-113 (2013).
- Ness, T. J., Elhefni, H. Reliable visceromotor responses are evoked by noxious bladder distention in mice. J. Urol. 171, 1704-1708 (2004).
- Ness, T. J., Richter, H. E., Varner, R. E., Fillingim, R. B. A psychophysical study of discomfort produced by repeated filling of the urinary bladder. Pain. 76, 61-69 (1998).
- Ness, T. J., Gebhart, G. F. Visceral pain: a review of experimental studies. Pain. 41, 167-234 (1990).
- Crock, L. W., et al. Central amygdala metabotropic glutamate receptor 5 in the modulation of visceral pain. J. Neurosci. 32, 14217-14226 (2012).
- Anderson, R. H., Ness, T. J., Gebhart, G. F. A distension control device useful for quantitative studies of hollow organ sensation. Physiol. Behav. 41, 635-638 (1987).
- Dimitrakov, J., et al. Pharmacologic Management of Painful Bladder Syndrome/Interstitial Cystitis: A Systematic Review. Arch. Intern. Med. 167, 1922-1929 (2007).
- Qin, C., Van Meerveld, B. G. reenwood-, Foreman, R. D. Spinal neuronal responses to urinary bladder stimulation in rats with corticosterone or aldosterone onto the amygdala. J. Neurophysiol. 90, 2180-2189 (2003).
- Randich, A., Mebane, H., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Rostral ventral medulla modulation of the visceromotor reflex evoked by urinary bladder distension in female rats. J. Pain. 9, 920-926 (2008).
