Summary
Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.
Abstract
Stabiele isotopen van peptiden door reductieve dimethylering (Redi labeling) is een methode om nauwkeurig kwantificeren eiwitexpressie verschillen tussen monsters met behulp van massaspectrometrie. Redi etikettering wordt uitgevoerd met behulp van gewone (licht) of gedeutereerde (zware) vormen van formaldehyde en natriumcyaanboriumhydride twee methylgroepen toevoegen aan elke vrije amine. Hier laten we zien een robuust protocol voor Redi etikettering en kwantitatieve vergelijking van complexe eiwitmengsels. Eiwitmonsters ter vergelijking worden gedigesteerd in peptiden gelabeld ofwel lichte of zware methyl markeringen, gemengd en samen geanalyseerd met LC-MS/MS dragen. Relatieve dichtheden eiwit gekwantificeerd door vergelijking van de ionenchromatogram piekoppervlakten van zware en lichte gemerkte versies van de samenstellende peptide geëxtraheerd uit de volledige MS-spectra. De hier beschreven methode is inclusief monstervoorbereiding met reversed phase vaste-fase-extractie, on-column Redi etikettering van peptiden, peptide fractionering door basische pH reversed-fase (BPRP) chromatografie, en StageTip peptide zuivering. We bespreken de voordelen en beperkingen van Redi etikettering met betrekking tot andere methoden voor een stabiele isotoop oprichting. We belichten nieuwe toepassingen met Redi labeling als een snelle, goedkope en nauwkeurige methode om eiwit abondantie vergelijken in bijna elk soort monster.
Introduction
Het meten van de concentratie verschillen van veel eiwitten tussen complexe monsters is een centrale uitdaging in proteomics. In toenemende mate wordt dit gedaan door het merken van eiwitten in elk monster met verschillende isotopische labels combineren van de monsters en met massaspectrometrie om concentratieverschillen kwantificeren. Verschillende methoden bestaan voor stabiele isotopische labeling van eiwitten en peptiden. 15 N etikettering 1 en 2 SILAC voeren isotopische labels metabolisch in vivo, terwijl iCAT 3, iTRAQ 4 en vermindering dimethylering 5 commentaar stabiele isotoop labels na eiwitextractie en vertering. Onder deze methoden, is reductieve dimethylering (Redi etikettering) aan populariteit wint als een goedkope en reproduceerbare methode om eiwitconcentratie verschillen in bijna elk type monster te kwantificeren.
Redi etikettering omvat peptiden reageren met formaldehyde om een Schiff base, dat vervolgens wordt gereduceerd vormendoor cyanoboorhydride. Deze reactie dimethylates vrije aminogroepen op N-uiteinden en lysinezijketens en monomethylates N-terminale prolines. De hier beschreven protocol methyleert peptiden in monster 1 met een "lichte" label met reagentia met waterstofatomen in hun natuurlijke isotopische distributie en monster 2 met een "zware" label met gedeutereerd formaldehyde en dride (figuur 1). Elke digemethyleerd aminogroep op een peptide resulteert in een massaverschil van 6,0377 Da tussen lichte en zware vormen, die wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen de twee vormen met een massaspectrometer. In het bijzonder, zijn ten opzichte van peptide abundanties gekwantificeerd als de verhouding van MS1 gewonnen ionenchromatogram gebieden (MS1 piekoppervlakte ratio) van lichte en zware uitvoering voor elk peptide ionenpaar. De relatieve abundantie van een eiwit wordt berekend als de mediaan MS1 piekoppervlak verhouding tussen alle peptiden in het proteïne. In dit rapport beschrijven we een robuust protocol voor gedraging Redi markeringsexperimenten door LC-MS/MS dat omgekeerde fase peptide vaste fase extractie op-kolom Redi etikettering peptide fractionering door basische pH omgekeerde fase (BPRP) chromatografie en zuivering van peptide mengsels met StageTips (figuur 2) omvat . We bespreken de voordelen en beperkingen van het gebruik van Redi etikettering voor kwantitatieve proteomics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Deze methode werd eerder beschreven 12.
1. Eiwitisolatie
Bereid 1 mg cellulair eiwit door het lyseren van cellen, bij voorkeur door fysische werkwijzen zoals Franse pers, kralen slaan of sonicatie. Vermijd-lysozym-gemedieerde cellysis omdat het enzym massaspectrometrie metingen zullen beschamen.
2. TCA precipitatie van de eiwitten
Voeg 1 volume trichloorazijnzuur (TCA) aan 4 delen eiwit en chill op ijs gedurende 10 minuten om eiwitten neer te slaan. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude aceton en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en keer de buis op de bank om de pellet gedurende 15 minuten drogen. WINKEL eiwit pellets bij -80 ° C.
3. Denaturatiesectie Eiwitten en verminderen zwavelbruggen
Renaar ~ 2 mg / ml in 500 pl denaturatie en vermindering buffer (hetzij 4 M ureum of 3% SDS in 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT) schorten eiwitten. Eventueel omvatten een proteaseremmer in de buffer. Incubeer eiwitten gedurende 30 min bij 56 ° C, gevolgd door 10 min bij kamertemperatuur.
4. Aklylate Gratis sulfohydrylgroepen onomkeerbaar Disrupt disulfidenbinding Vorming
Bereid verse 0,3 M iodoacetamide in water. LET OP! Iodoacetamide is zeer giftig. Voeg 25 gl 0,3 M joodaceetamide (15 mM eindconcentratie) 500 pi eiwit en incubeer gedurende 20 min in het donker bij kamertemperatuur. Quench iodoacetamide door het toevoegen van 10 pi van 300 mM DTT (5 mM DTT uiteindelijke concentratie). Slaan gealkyleerde eiwitten bij -80 ° C.
5. Eiwitvertering
TCA precipiteren eiwitten (zoals beschreven in stap 2) en resuspendeer in 1 ml 50 mM HEPES (pH 8,2), 1 M ureum. Bereid een voorraad oplossing van Lysyl endoproteinase (Lys-C) in water bij een concentratie van 2 ug / ul en voeg 5 ul aan de eiwitoplossing. Incubeer het mengsel gedurende 16 uur bij kamertemperatuur geroerd. Controleer de uiteindelijke Lys-C concentratie 10 ng / ul en het eiwit naar LysC verhouding (w / w) 1/50 tot 1/200. Resuspendeer 20 ug sequentie rang trypsine in 40 ui 50 mM azijnzuur, 5 pi (10 pg trypsine) de Lys-C digest, en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C. Gebruik dezelfde protease concentratie en protease-to-eiwit verhouding voor Lys-C als voor trypsine.
6. Reversed-phase Peptide Extractie
- Zuur peptiden door toevoeging van trifluorazijnzuur (TFA) tot een eindconcentratie van 0,5% (pH ≈ 2). Bevestig een C18-kolom aan een extractie spruitstuk. Gebruik de hoogst mogelijke debiet voor alle stappen behalve laden en elutie van de peptiden.
- Natte kolom met 6 ml acetonitril (ACN). Waskolom met 6 ml 80% ACN 0,1% TFA, vervolgens evenwicht met 6 ml 0,1% TFA. Sta niet toe dat dekolom droog komt te staan tussen de stappen.
- Stop vacuümdruk en 500 ug laden van peptiden op de kolom met een stroomsnelheid van ongeveer 1 ml / min. Zodra peptiden gebonden aan de kolom, herstart vacuüm en was met 6 ml 0,1% TFA, vervolgens met 3 ml citroenzuur buffer (0,09 M citroenzuur, 0,23 M Na 2 HPO 4, pH 5,5).
Opmerking: met peptide bedragen codeerbaar maar de C18 bindingscapaciteit moet ten minste tweemaal hoger dan de peptide hoeveelheid monster verlies te voorkomen.
7. On-column Peptide Labeling door Reductieve dimethylering (Redi Labeling)
Voer deze stap onder een chemische kap als waterstof cyanide vrijkomt bij lage concentratie tijdens de etikettering proces.
- Bereid 12 ml van "lichte" en "zware" Redi buffers om peptide vrije amines methyleren. Licht Redi buffer bestaat uit 0.8% formaldehyde en 0,12 M natriumcyaanboorhydride dragen waterstofatomen in their natuurlijke isotopische distributies in citroenzuur buffer. Zware Redi buffer bestaat uit 0,8% gedeutereerd formaldehyde en 0,12 M gedeutereerd natriumcyaanboorhydride in citroenzuur buffer.
- Kolom bevattende peptiden Incubeer door 10 ml hetzij lichte of zware Redi buffer om de peptide bevattende kolommen stroomsnelheid van 1 ml / min en herhaal volledige etikettering te waarborgen. Was de kolom met 6 ml 0,1% TFA en vervolgens met 1 ml 0,5% azijnzuur.
- Stop vacuüm en elueer gemerkte peptiden eerst met 1 ml 40% ACN, 0,5% azijnzuur, vervolgens met 1 ml 80% ACN, 0,5% azijnzuur met een stroomsnelheid van ongeveer 0,5 ml / min. Indien gewenst, het meten van de etikettering efficiëntie van individuele monsters met behulp van massaspectrometrie voor het mengen zware en lichte monsters (zie "Representatieve resultaten"). Meng 01:01 zwaar en licht gemerkt peptide monsters worden gekwantificeerd met behulp van massaspectrometrie.
8. Aparte peptidenmengsel door Basic pH Reversed Phase (BPRP) Chromatography </ P>
Eenvoudig pH omgekeerde fase (BPRP) chromatografie om het peptidemengsel te scheiden in verschillende fracties, die onafhankelijk geanalyseerd door LC-MS/MS aan proteoom bereik vergroten.
- Het peptidemengsel te fractioneren op een kolom C18-HPLC door toepassing van een gradiënt van toenemende ACN concentratie in 10 mM ammoniumbicarbonaat (pH 8). Begin met 5% (v / v) ACN gedurende 5 min, toenemen tot 35% ACN in 60 minuten en vervolgens tot 90% ACN in 1 minuut. Bewaar de 90% ACN gedurende 4 min voor het verminderen van de ACN tot 5% opnieuw equilibreren de kolom 9 minuten. Verzamel 96 fracties van gelijk volume in een 96-well plaat (A1 tot H12). Bewaken van de fractionering met behulp van een UV-detector bij 220 nm terwijl peptiden elueren uit de kolom (10-70 min voor de hier beschreven voorwaarden).
- Combineer fracties uit putten A1, C1, E1 en G1 (fractie A1), uit bronnen B1, D1, F1 en H1 (fractie B1), uit bronnen A2, C2, E2, G2 (fractie A2) en derhalve voor de overige fracties. Verwijder de solvent gebruik van een vacuüm centrifuge. Resuspendeer peptiden uit fracties A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 en B12 in 130 ui 1 M urea/0.5% TFA en zuiveren met StageTips zoals beschreven in stap 9. Store fracties B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 en A12 bij -20 º C.
9. Zuiver Peptiden door stop en go Extraction (StageTips)
Bereid C18-StageTip 7 microkolommen door de verpakking 200 ul pipet tips met twee C18 schijven met een inwendige diameter (ID) van 1,07 mm. Zet Stage Tips in Eppendorf buizen. Gebruik een microcentrifuge om tips wassen met 130 pl methanol, vervolgens 130 ul 80% ACN, 0,5% azijnzuur. Equilibreer StageTips met 130 ul 0,1% TFA. Transfer peptidemengsel te StageTips en wassen met 130 ul 0,1% TFA, vervolgens 40 ul 0,1% TFA, vervolgens 40 pi 0,5% azijnzuur. Elueer peptiden eerst met 20 ul 40% ACN, 0,5% azijnzuur, vervolgens 20 ul 80% ACN, 0,5% azijnzuur. Combineer eluaten eennd droog door vacuümfiltratie.
10. Microcapillaire LC-MS/MS
- Los peptiden in 1-5 ul 5% mierenzuur, 5% ACN tot een concentratie van ongeveer 1 ug / ul. Oplossing ~ 1 ug peptiden op een 100 urn x 20 cm C18-omgekeerde fase HPLC kolom met een gradiënt van 6-22% ACN in 0,125% mierenzuur aangebracht op 75 of 100 minuten bij een stroomsnelheid van ~ 300 nl / min.
- Identificeer peptiden met behulp van een LTQ Orbitrap Velos 12 of soortgelijke vloeistofchromatografie-massaspectrometrie platform met een massaspectrometer leveren van hoge resolutie en hoge nauwkeurigheid massa. Bedien de massaspectrometer in data-afhankelijke modus met een volledige MS scan (resolutie van 60.000) verworven in de Orbitrap analyzer. Genereer lineaire ion trap MS / MS-spectra voor de 20 meest voorkomende ionen gedetecteerd in de volledige MS spectrum. Stel Automatic Gain Control (AGC) targets tot 1 x 10 6 voor de volledige MS en 2000 voor MS / MS. Stel een maximum ion accumulatie tijden tot 1000 msecvoor MS en 150 msec voor MS / MS. Uitsluiten gefragmenteerd peptide precursorionen van verdere selectie van MS / MS voor 20-60 sec.
11. MS / MS Data Acquisition
Identificeer peptiden door vergelijking van MS / MS spectra RAW een theoretische database een algoritme zoals SEQUEST 8 met behulp van deze parameters (tabel 1).
Tabel 1. Peptide Database Zoekparameters.
| Algemene parameters | volledig tryptische digestie met maximaal 2 gemiste splitsingen |
| 25 ppm precursorion tolerantie | |
| 1.0 Da fragmention tolerantie | |
| Statische Wijzigingen | 57,02146 Da op cysteïne, carboxyamidomethylation |
| 28,03130 Da op lysine en peptide N-terminus, licht dimethylering label | |
| Dynamische Wijzigingen | 15,99491 Da op methionine, oxidatie |
| 6,03766 Da op lysine en peptide N-terminus, zware dimethylering label |
- Filter peptiden een 1% fout ontdekt waardering met een methode als het doel-decoy 9 aanpak vanuit een database van open reading frames in de huidige en omgekeerde oriëntaties.
12. Peptide Kwantificering
Bereken het gebied van zware en lichte paren van MS1 gewonnen ion chromatogrammen (MS1 piekgebieden) en peptide signaal-ruisverhouding (S / N) verhouding 10. Omvatten peptide paren alleen wanneer hun gemiddelde signaal-noise, groter dan vijf. Kwantificeer de relatieve abundantie van een peptide in de twee monsters als de verhouding tussen MS1 piekoppervlakten van zware en lichte versie van hetzelfde peptide (MS1 piekoppervlakte-verhouding). Berekenen relatieve abundanties eiwit als de mediaan MS1 piekoppervlak verhouding voor alle peptiden in het proteïne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We evalueerden de nauwkeurigheid, precisie en reproduceerbaarheid van Redi labeling met Saccharomyces cerevisiae en Clostridium phytofermentans gehele cellysaten. We hebben eerst gekwantificeerd de Redi etikettering efficiëntie van een mix van C. phytofermentans eiwitlysaten uit cellulose (zware gelabeld, H) en glucose (licht label, L) culturen. Wanneer gefilterd om een 1% peptide valse ontdekking tarief, dit monster bevatte 11.194 unieke peptide sequenties met een 98% Redi etikettering efficiëntie. Ongefractioneerde S. cerevisiae eiwit lysaat werd op soortgelijke wijze gelabeld met H of L reagentia gemengd in verschillende verhoudingen en geanalyseerd. Eiwitexpressie verschillen (log 2 (mediaan MS1 piek oppervlakten)) reproduceerbaar geven de verhoudingen waarin de H en L monsters werden gemengd in diverse mengverhoudingen (figuur 3). Specifiek, de veelvoudverandering van 99% van de eiwitten werden gemeten als kleiner dan 1,6 maal de 01:01 gemengde monsters. Inde 01:10 en 10:01 monsters, 99% van de proteïnen in 3,8 voudige van de verwachte verhouding, die een verhoging van de standaardafwijking op grotere afstand van een 01:01-mengsel. Toen Redi labeling werd aangebracht op de Clostridium phytofermentans proteoom, we gekwantificeerd meer dan 2000 eiwitten met 94% eiwit gemeten in 2-voudige niveaus vermenig groeien op glucose (figuur 4A). Eiwit vouwen veranderingen op dubbele paren van culturen (glucose versus cellulose) werden ook sterk gecorreleerd (r 2 = 0,82), (Figuur 4B). S. cerevisiae vergelijkingen (figuur 3) zijn van een enkele cultuur en dus tonen technische reproduceerbaarheid van Redi gebaseerde kwantitatieve proteomics. C. phytofermentans metingen (figuren 4A, B) vergelijken repliceren culturen dus expressie verschillen vertegenwoordigen zowel meetfouten en biologische variatie tussen culturen. Samen vormen deze ervaringmenten ondersteunen dat Redi proteomics is een nauwkeurige en reproduceerbare methode om eiwitexpressie verschillen tussen complexe monsters te kwantificeren.
Figuur 1. Reductieve dimethylering van peptiden met behulp van zware en lichte reagentia vrije amines dimethylate. Hetzelfde werd gelabeld met zware versus lichte reagentia heeft een 6,0377 Da massaverschuiving per vrije amine. De hier getoonde peptide gelabeld zowel aan de N-terminus en een lysinezijketen. Afbeelding aangepast van Reference 11. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Overzicht van protocol voor kwantitatieve proteomics door reductieve dimethylering. Rode cijfers hierboven pijlen corresponderen met stappen in het protocol beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Evaluatie van Redi labeling met Saccharomyces cerevisiae gehele cellysaten. Monsters van een kweek werden gelabeld met hetzij zware (H) en lichte (L) reagentia gemengd in verschillende verhoudingen (1H: 10L, 1H: 5L, 1H: 2L, 1H: 1L, 2H: 1L, 5H: 1L, en 10H: 1L), en eiwitten verschillen tussen H en L monsters werden gekwantificeerd als log 2 mediaan MS1 piekoppervlakken (log 2 H / L-ratio). De R2 waarde van een lineaire trendlijn door alle gegevenspunten was 0,96 (zwarte lijn); de Pearson correlatie was 0,98. Vertrouwen grenzen (rode lijnen) geven de absolute loodrechte afstand van de trendlijn waarbinnen 95% van de gegevens punten gevonden voor elk monster. Afbeelding aangepast van Reference 12. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Kwantificering van Redi-gelabelde Clostridium phytofermentans eiwitten uit culturen groeien van verschillende koolstof bronnen. A) Eiwitexpressie in een glucose-cultuur ten opzichte van een repliceren glucose cultuur, een hemicellulose cultuur, en een cellulose cultuur. De fractie eiwitten aanwezig in dubbele niveaus glucose-glucose (94%), glucose-hemicellulose (80%) en glucose-cellulose (49%). B) veranderingen in eiwitexpressie Vouw voor glucose versus cellulose culturen zijn sterk gecorreleerd (r 2 = 0,82) voor dubbele paren van culturen. Afbeeldingen aangepast van Reference 12. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een aantal punten maken stabiele isotoop labeling van peptiden met behulp van reductieve dimethylering (Redi etikettering) een aantrekkelijke methode voor kwantitatieve proteomics: goedkoop etikettering reagens (reagentia kost minder dan $ 1 per monster), snelle reactiesnelheid (~ 10 min), de afwezigheid van nevenproducten, hoge reproduceerbaarheid (figuren 3, 4), stabiele reactieproducten, mogelijkheid om een protease te gebruiken en hoge ionisatie-efficiëntie van gelabelde peptiden. Chemische labeling van Redi is ook voordelig ten opzichte van metabolisch merken aangezien het geen stammen of cellijnen specifieke aminozuur auxotrophies of groei op een synthetisch medium nodig. Als zodanig kan Redi worden toegepast op vrijwel elk type eiwit monster inbegrip van nieuwe microben 12 waarvoor weinig mutante stammen zijn 13 en menselijke stamcellen 14, onder anderen 15.
Een beperking van Redi etikettering is een lager vermogen om monsters ten opzichte van multiplex om othaar werkwijzen zoals isobare kenmerking (bijvoorbeeld iTRAQ of TMT), waarvoor nog tot 8 monsters gelijktijdig worden gekwantificeerd 16. De hier beschreven werkwijze maakt het kwantitatieve vergelijking van twee verschillend gemerkte monsters. Aanvullende isotopische combinaties van formaldehyde en dride kan worden gebruikt om te produceren tot 3 labels die verschillen met ten minste 4 Da 17 en Redi etikettering onlangs uitgebreid tot 5 multiplex monsters 18. Een andere uitdaging van Redi etikettering is dat deuterium peptiden elueren iets eerder licht die bij het gebruik van omgekeerde fase chromatografie. Om te bepalen voor deze "deuterium effect", dient peptide kwantificering altijd gebaseerd op het gehele geëxtraheerde ionenchromatogram (MS1 piekoppervlak) in plaats van intensiteiten ve scan.
De Redi proteomics hier beschreven protocol bevat een groot aantal verbeteringen 11,15,17 geboekt sinds de eerste beschrijving van vermindering dimethyl etiketteringvan peptiden voor massaspectrometrie 5. We beschreven een "on-column" etikettering methode om hogere peptide bedragen en de etikettering efficiëntie kan worden gecontroleerd voordat monstermenging, maar "in oplossing" en "online" etikettering methoden bestaan ook 19. Naast proteoom kwantificering wordt Redi etikettering wordt toegepast isovorm bepaling 20 en kan gecombineerd worden met andere methoden post-translationele modificaties zoals fosforylering 11,18 21 acetylering, glycosylering en 22 geanalyseerd. Door zijn veelzijdigheid en goedkoop, kwantitatieve chemie, zal Redi etikettering steeds meer worden toegepast op kwantitatieve proteomics in nieuwe en spannende manieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| Cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| Deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| Sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
