Summary
Reductive dimethylation (Redi लेबलिंग) द्वारा पेप्टाइड्स के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए एक तेजी से, सस्ती रणनीति है. यहाँ हम लगभग किसी भी नमूना प्रकार से लागू किया जा सकता है कि Redi दृष्टिकोण का उपयोग प्रोटीन मिश्रण से तैयार करने और विश्लेषण के लिए एक मजबूत विधि प्रदर्शित करता है.
Abstract
Reductive dimethylation (Redi लेबलिंग) द्वारा पेप्टाइड्स के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग सही मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग नमूनों के बीच प्रोटीन अभिव्यक्ति मतभेद यों की एक विधि है. Redi लेबलिंग प्रत्येक मुक्त amine को दो मिथाइल समूह जोड़ने के लिए नियमित रूप से (प्रकाश) या formaldehyde और सोडियम cyanoborohydride के deuterated (भारी) रूपों का उपयोग किया जाता है. यहाँ हम Redi लेबलिंग और जटिल प्रोटीन मिश्रण की मात्रात्मक तुलना के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. तुलना के लिए प्रोटीन के नमूने प्रकाश या भारी मिथाइल टैग, मिश्रित, और LC-MS/MS द्वारा सह विश्लेषण किया या तो ले जाने के लिए लेबल पेप्टाइड्स, में से पच जाता है. सापेक्ष प्रोटीन abundances पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रा से निकाले घटक पेप्टाइड भारी और प्रकाश लेबल संस्करणों की आयन वर्णलेख शिखर क्षेत्रों की तुलना द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. यहाँ वर्णित विधि नमूना उलट चरण ठोस चरण निष्कर्षण द्वारा तैयारी, पेप्टाइड्स पर स्तंभ Redi लेबलिंग, बुनियादी पीएच राजस्व द्वारा पेप्टाइड fractionation शामिलersed चरण (BPRP) क्रोमैटोग्राफी, और StageTip पेप्टाइड शुद्धि. हम स्थिर आइसोटोप शामिल करने के लिए अन्य तरीकों के संबंध में Redi लेबलिंग के फायदे और सीमाओं पर चर्चा की. हम नमूने के लगभग किसी भी प्रकार में प्रोटीन abundances तुलना करने के लिए एक तेज, सस्ता, और सही तरीके के रूप में Redi लेबलिंग का उपयोग उपन्यास अनुप्रयोगों पर प्रकाश डाला.
Introduction
जटिल नमूने के बीच कई प्रोटीन की एकाग्रता अंतर को मापने प्रोटिओमिक्स में एक केंद्रीय चुनौती है. तेजी से, यह अलग समस्थानिक टैग के साथ प्रत्येक नमूने में प्रोटीन लेबलिंग नमूने के संयोजन, और एकाग्रता मतभेद यों मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके किया जा रहा है. कई तरीकों प्रोटीन और पेप्टाइड्स के स्थिर समस्थानिक लेबलिंग के लिए मौजूद हैं. ICAT 3, iTRAQ 4, और कमी dimethylation 5 प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन के बाद स्थिर आइसोटोप टैग जोड़ने जबकि 15 एन लेबलिंग 1 और SILAC 2, विवो में पाचन समस्थानिक लेबल परिचय. इन तरीकों के अलावा, reductive dimethylation (Redi लेबलिंग) नमूने के लगभग किसी भी प्रकार में प्रोटीन एकाग्रता मतभेद यों के लिए एक सस्ता, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पद्धति के रूप में लोकप्रिय हो रहा है.
Redi लेबलिंग तो कम हो जाता है, जो एक Schiff आधार, के लिए फार्म formaldehyde के साथ प्रतिक्रिया पेप्टाइड्स शामिलcyanoborohydride द्वारा. यह प्रतिक्रिया एन टर्मिनी और लाइसिन पक्ष श्रृंखला और monomethylates एन टर्मिनल prolines पर मुक्त एमिनो समूहों dimethylates. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल deuterated formaldehyde और cyanoborohydride (चित्रा 1) का उपयोग कर एक "भारी" लेबल के साथ अपने प्राकृतिक समस्थानिक वितरण और नमूना 2 में हाइड्रोजन परमाणुओं के साथ अभिकर्मकों का उपयोग कर एक "प्रकाश" लेबल के साथ नमूना 1 में पेप्टाइड्स methylates. प्रकाश और एक मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग दो रूपों के बीच भेद करने के लिए कार्यरत है जो भारी रूपों में 6.0377 दा के एक बड़े पैमाने पर अंतर में एक पेप्टाइड परिणामों पर प्रत्येक dimethylated एमिनो समूह. विशेष रूप से, रिश्तेदार पेप्टाइड abundances प्रकाश की MS1 निकाले आयन वर्णलेख क्षेत्रों का अनुपात (MS1 चोटी क्षेत्र अनुपात) और प्रत्येक पेप्टाइड आयन जोड़ी के लिए भारी संस्करण के रूप में मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. एक प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत प्रोटीन में सभी पेप्टाइड्स के बीच मंझला MS1 चोटी क्षेत्र अनुपात के रूप में गणना की है. इस रिपोर्ट में, हम आचरण के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णनउलट चरण पेप्टाइड ठोस चरण निष्कर्षण, पर स्तंभ Redi लेबलिंग, पेप्टाइड fractionation बुनियादी पीएच द्वारा चरण (BPRP) क्रोमैटोग्राफी उलट, और StageTips का उपयोग पेप्टाइड मिश्रण की शुद्धि (चित्रा 2) भी शामिल है कि LC-MS/MS द्वारा Redi लेबलिंग प्रयोगों आईएनजी . हम मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए Redi लेबलिंग का उपयोग करने के फायदे और सीमाओं पर चर्चा की.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नोट: इस विधि में पहले 12 में वर्णित किया गया.
1. प्रोटीन अलगाव
अधिमानतः ऐसे फ्रेंच प्रेस, मनका पिटाई, या sonication के रूप में भौतिक तरीकों से, lysing कोशिकाओं द्वारा सेलुलर प्रोटीन की 1 मिलीग्राम तैयार करें. एंजाइम मास स्पेक्ट्रोमेट्री माप उलझाना होगा क्योंकि लाइसोजाइम की मध्यस्थता सेल से बचें.
प्रोटीन की 2. टीसीए वर्षा
प्रोटीन वेग को 10 मिनट के लिए बर्फ पर 4 संस्करणों प्रोटीन और ठंडा करने के लिए 1 मात्रा Trichloroacetic एसिड (टीसीए) जोड़ें. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 XG पर और सतह पर तैरनेवाला हटायें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 XG पर ठंडा एसीटोन और अपकेंद्रित्र के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend सतह पर तैरनेवाला निकालें और 15 मिनट के लिए गोली सुखाने के लिए बेंच पर ट्यूब पलटना. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्रोटीन छर्रों
3. Denature प्रोटीन और डाइसल्फ़ाइड बांड में कमी
फिर सेप्रोटीन को निलंबित 500 μl विकृतीकरण और कमी बफर में ~ 2 मिलीग्राम / एमएल (50 मिमी HEPES पीएच 8.5, 5 मिमी डीटीटी में 4 एम यूरिया या 3% एसडीएस या तो) के लिए. वैकल्पिक रूप से, बफर में एक protease अवरोध शामिल हैं. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के द्वारा पीछा 56 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए प्रोटीन सेते हैं.
4. Aklylate मुफ्त sulfhydryl समूह अचल डाइसल्फ़ाइड बांड गठन को बाधित करने के लिए
पानी में ताजा 0.3 एम iodoacetamide तैयार करें. चेतावनी! Iodoacetamide बेहद जहरीला है. 500 μl प्रोटीन के लिए 25 μl 0.3 एम iodoacetamide (15 मिमी अंतिम एकाग्रता) जोड़ें और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए सेते हैं. 300 मिमी डीटीटी (5 मिमी अंतिम डीटीटी एकाग्रता) के 10 μl जोड़कर iodoacetamide बुझाने. सेल्सियस -80 पर alkylated प्रोटीन स्टोर
5. प्रोटीन पाचन
टीसीए प्रोटीन वेग (चरण 2 में वर्णित है) और 50 मिमी HEPES (पीएच 8.2) के 1 मिलीलीटर, 1 एम यूरिया में Resuspend. Lysyl endoprotein के एक शेयर समाधान तैयार2 ग्राम / μl की एकाग्रता में और प्रोटीन समाधान के लिए 5 μl जोड़ने के पानी में एएसई (लिस सी). कमरे के तापमान पर 16 घंटे के लिए मिश्रण को सेते हैं. अंतिम लिस सी एकाग्रता 10 एनजी / μl और प्रोटीन से lysC अनुपात (डब्ल्यू / डब्ल्यू) 1/200 के लिए 1/50 है सुनिश्चित करें. , 50 मिमी एसिटिक एसिड के 40 μl में 20 माइक्रोग्राम अनुक्रमण ग्रेड trypsin Resuspend लिस सी डाइजेस्ट करने के लिए 5 μl (10 माइक्रोग्राम trypsin) जोड़ने, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए सेते Trypsin के लिए इस्तेमाल के रूप में लिस-C के लिए एक ही प्रोटीज एकाग्रता और प्रोटीज करने वाली प्रोटीन के अनुपात का प्रयोग करें.
6. उलट चरण पेप्टाइड निकालना
- 0.5% की एक अंतिम एकाग्रता (पीएच ≈ 2) को trifluoroacetic एसिड (TFA) जोड़कर पेप्टाइड्स खट्टा करना. एक निष्कर्षण कई गुना करने के लिए एक C18 स्तंभ संलग्न करें. पेप्टाइड्स की लोडिंग और क्षालन छोड़कर सभी चरणों के लिए उच्चतम संभव प्रवाह दर का प्रयोग करें.
- 6 मिलीग्राम acetonitrile (ACN) के साथ गीला स्तंभ. 6 मिलीग्राम 80% ACN, 0.1% TFA साथ स्तंभ धो लें, फिर 6 मिलीलीटर 0.1% TFA साथ संतुलित करना. अनुमति न देंकदम के बीच सूखी चलाने के लिए स्तंभ.
- वैक्यूम दबाव बंद करो और लगभग 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर पर स्तंभ पर पेप्टाइड्स की 500 ग्राम भार. पेप्टाइड्स स्तंभ, पुनः आरंभ वैक्यूम करने के लिए बाध्य है और फिर (0.09 एम साइट्रिक एसिड, 0.23 एम ना 2 4 HPO, 5.5 पीएच) साइट्रिक एसिड बफर के 3 मिलीलीटर के साथ, 6 मिलीग्राम 0.1% TFA से धो कर लेते हैं.
नोट: हायर पेप्टाइड मात्रा में लेबल किया जा सकता है, लेकिन क्षमता बाध्यकारी C18 स्तंभ में कम से कम नमूना नुकसान से बचने के लिए पेप्टाइड मात्रा से अधिक दो गुना होना चाहिए.
7. पर स्तंभ reductive Dimethylation द्वारा पेप्टाइड लेबलिंग (Redi लेबलिंग)
हाइड्रोजन साइनाइड लेबलिंग प्रक्रिया के दौरान कम एकाग्रता में जारी किया गया है के रूप में एक रासायनिक हुड के तहत इस चरण को पूरा.
- पेप्टाइड मुक्त amines methylate को "प्रकाश" और "भारी" Redi बफ़र्स की 12 मिलीलीटर की तैयारी. लाइट Redi बफर 0.8% formaldehyde और वें में hydrogens ले जाने 0.12 एम सोडियम cyanoborohydride के होते हैंसाइट्रिक एसिड बफर में EIR प्राकृतिक समस्थानिक वितरण. भारी Redi बफर 0.8% deuterated formaldehyde और साइट्रिक एसिड बफर में 0.12 एम deuterated सोडियम cyanoborohydride के होते हैं.
- 1 मिलीग्राम / मिनट के प्रवाह की दर में पेप्टाइड युक्त कॉलम को 10 मिलीलीटर प्रकाश या भारी Redi बफर या तो जोड़कर पेप्टाइड्स युक्त स्तंभ सेते हैं और पूरी लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए दोहराएँ. धो 6 मिलीलीटर 0.1% TFA साथ स्तंभ और फिर 1 मिलीलीटर 0.5% एसिटिक एसिड के साथ.
- वैक्यूम बंद करो और लगभग 0.5 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर का उपयोग तो 1 मिलीलीटर 80% ACN के साथ, 0.5% एसिटिक एसिड 1 मिलीलीटर 40% ACN, 0.5% एसिटिक एसिड, के साथ पहली लेबल पेप्टाइड्स elute. अगर वांछित, भारी और प्रकाश नमूने मिश्रण से पहले मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा व्यक्ति के नमूनों की लेबलिंग दक्षता उपाय ("प्रतिनिधि परिणाम" देखें). मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा 1:1 भारी और प्रकाश लेबल पेप्टाइड नमूने मिलाएं.
बुनियादी पीएच उलट चरण (BPRP) क्रोमैटोग्राफी <द्वारा 8. अलग पेप्टाइड मिश्रण/ P>
बुनियादी पीएच स्वतंत्र रूप proteome कवरेज बढ़ाने के लिए LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं जो कई भिन्न, में पेप्टाइड मिश्रण को अलग करने के चरण (BPRP) क्रोमैटोग्राफी उलट.
- 10 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट (पीएच 8) में बढ़ रही ACN एकाग्रता की एक ढाल लगाने से एक C18-HPLC स्तंभ पर पेप्टाइड मिश्रण fractionate. 5 मिनट के लिए 5% (v / v) ACN के साथ शुरू करो, 60 मिनट में 35% ACN को बढ़ाने, और 1 मिनट में फिर से 90% ACN. 9 मिनट के लिए फिर से संतुलित करने के लिए कॉलम 5% की ACN को कम करने से पहले 4 मिनट के लिए 90% ACN को बनाये रखें. एक 96 अच्छी तरह से थाली (H12 को ए 1) में बराबर मात्रा के 96 भिन्न लीजिए. पेप्टाइड्स स्तंभ (यहाँ वर्णित शर्तों के लिए 10-70 मिनट) बंद eluting कर रहे हैं, जबकि 220 एनएम पर एक यूवी डिटेक्टर का उपयोग fractionation मॉनिटर.
- कुओं ए 2, सी 2, E2, और G2 (अंश A2) से और तदनुसार के लिए, कुओं बी 1, डी 1, F1, और एच 1 (अंश बी 1) से, कुओं A1, सी 1, E1, और G1 (अंश A1) से भिन्न जुडा शेष भिन्न. Solven निकालेंएक वैक्यूम अपकेंद्रित्र का उपयोग टी. भिन्न से Resuspend पेप्टाइड्स A1, बी 2, ए 3, बी 4, ए 5, बी 6, ए 7, बी 8, ए 9, B10, A11, और बी 12 1 एम urea/0.5% TFA के 130 μl में और कदम 9 में वर्णित StageTips का उपयोग कर शुद्ध. स्टोर भिन्न बी 1, ए 2, बी 3, ए 4, बी 5, ए 6, B7, ए 8, B9, A10, B11, और -20 पर A12 डिग्री सेल्सियस
9. बंद करो और जाओ निष्कर्षण द्वारा शुद्ध पेप्टाइड्स (StageTips)
1.07 एमएम की एक आंतरिक व्यास (आईडी) के साथ दो C18 डिस्क के साथ 200 μl विंदुक युक्तियाँ पैकिंग द्वारा C18-StageTip 7 microcolumns तैयार करें. Eppendorf ट्यूबों में स्टेज टिप्स रखो. मेथनॉल के 130 μl, तो 130 उल 80% ACN, 0.5% एसिटिक एसिड के साथ सुझावों को धोने के लिए एक microcentrifuge का प्रयोग करें. 130 0.1 μl% TFA साथ StageTips संतुलित करना. StageTips को पेप्टाइड मिश्रण स्थानांतरण और 40 μl 0.5% एसिटिक एसिड, फिर 40 μl 0.1% TFA तो, 130 μl 0.1% TFA से धो लें. 20 μl 40% ACN, 0.5% एसिटिक एसिड, तो 20 μl 80% ACN, 0.5% एसिटिक एसिड के साथ पहली पेप्टाइड्स Elute. Eluates एक जुडाएन डी वैक्यूम निस्पंदन द्वारा सूखा.
10. Microcapillary LC-MS/MS
- लगभग 1 ग्राम / μl की एकाग्रता को 1-5 μl 5% चींटी एसिड, 5% ACN में पेप्टाइड्स भंग. पर ~ 1 ग्राम पेप्टाइड्स को हल एक 100 माइक्रोन × C18 उलट 0.125% चींटी एसिड में 6-22% ACN की एक ढाल के साथ चरण HPLC स्तंभ ~ 300 NL / मिनट की एक प्रवाह दर पर 75 या 100 मिनट पर लागू 20 सेमी.
- एक LTQ Orbitrap Velos 12 या एक मास स्पेक्ट्रोमीटर उच्च संकल्प और उच्च सटीकता जन को उपलब्ध कराने के साथ इसी तरह के तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री मंच का उपयोग करके पेप्टाइड्स पहचानें. Orbitrap विश्लेषक में अधिग्रहण एक पूर्ण एमएस स्कैन (60,000 का समाधान) के साथ डेटा पर निर्भर मोड में मास स्पेक्ट्रोमीटर कार्य करते हैं. पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रम में पाया 20 सबसे प्रचुर मात्रा में आयनों के लिए रैखिक आयन जाल एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा उत्पन्न करें. एमएस / एमएस के लिए 1 एक्स 10 पूर्ण एमएस के लिए 6 और 2,000 को स्वत: प्राप्त नियंत्रण (AGC) लक्ष्य निर्धारित करें. 1000 मिसे के लिए अधिकतम आयन संचय के समय निर्धारितएमएस और एमएस / एमएस के लिए 150 मिसे के लिए. 20-60 सेकंड के लिए एमएस / एमएस से आगे चयन से खंडित पेप्टाइड अग्रदूत आयनों को बाहर निकालें.
11. एमएस / एमएस डाटा अधिग्रहण
इन मानकों (1 टेबल) का उपयोग ऐसे SEQUEST 8 के रूप में एक एल्गोरिथ्म के साथ एक सैद्धांतिक डाटाबेस के लिए एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा कच्चे फ़ाइलों की तुलना द्वारा पेप्टाइड्स पहचानें.
तालिका 1. पेप्टाइड डेटाबेस खोज मापदंडों.
| जनरल पैरामीटर्स | अप करने के लिए 2 के साथ पूरी तरह से tryptic पाचन चोली याद किया |
| 25 पीपीएम अग्रदूत आयन सहिष्णुता | |
| 1.0 दा टुकड़ा आयन सहिष्णुता | |
| स्टेटिक संशोधन | सिस्टीन, carboxyamidomethylation पर 57.02146 दा |
| लाइसिन और पेप्टाइड एन टर्मिनस पर 28.03130 दा, प्रकाश dimethylation लेबल | |
| गतिशील संशोधन | Methionine, ऑक्सीकरण पर 15.99491 दा |
| लाइसिन और पेप्टाइड एन टर्मिनस, भारी dimethylation लेबल पर 6.03766 दा |
- वास्तविक और उलट झुकाव में खुला पढ़ने फ्रेम के एक डेटाबेस का उपयोग करते हुए इस तरह के लक्ष्य फंदा 9 रणनीति के रूप में एक विधि के साथ एक 1% झूठे खोज दर को फ़िल्टर पेप्टाइड्स.
12. पेप्टाइड मात्रा
गणना करें MS1 की भारी और प्रकाश जोड़े के क्षेत्रों आयन chromatograms (MS1 शिखर क्षेत्रों) निकाले और पेप्टाइड संकेत करने वाली शोर (एस / एन) अनुपात 10. पेप्टाइड जोड़े शामिल केवल जब उनकी औसत संकेत करने वाली Noiएसई अनुपात पाँच से ऊपर है. एक ही पेप्टाइड (MS1 चोटी क्षेत्र अनुपात) की भारी और प्रकाश संस्करणों की MS1 शिखर क्षेत्रों के अनुपात के रूप में दो नमूनों में एक पेप्टाइड के रिश्तेदार बहुतायत यों. प्रोटीन के सभी पेप्टाइड्स के लिए औसत MS1 चोटी क्षेत्र अनुपात के रूप में रिश्तेदार प्रोटीन abundances की गणना.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हम Saccharomyces cerevisiae का उपयोग सटीकता, शुद्धता, और Redi लेबलिंग के reproducibility मूल्यांकन किया और क्लोस्ट्रीडियम पूरे सेल lysates phytofermentans. हम पहले सी का एक मिश्रण की Redi लेबलिंग दक्षता मात्रा निर्धारित सेलूलोज (भारी लेबल, एच) और ग्लूकोज (प्रकाश लेबल, एल) संस्कृतियों से प्रोटीन lysates phytofermentans. एक 1% पेप्टाइड झूठे खोज दर को फ़िल्टर किया जाता है, इस नमूना एक 98% Redi लेबलिंग दक्षता के साथ 11,194 अद्वितीय पेप्टाइड दृश्यों निहित. Unfractionated एस cerevisiae प्रोटीन lysate इसी तरह, एच या एल अभिकर्मकों के साथ लेबल विभिन्न अनुपात में मिलाया, और विश्लेषण किया गया था. प्रोटीन अभिव्यक्ति मतभेद (2) (मंझला MS1 शिखर क्षेत्रों log) reproducibly एच एल और नमूने अनुपात (चित्रा 3) के मिश्रण की एक विस्तृत श्रृंखला में मिलाया गया, जिस पर अनुपात को दर्शाते हैं. विशेष रूप से, प्रोटीन के 99% के गुना परिवर्तन 01:01 मिश्रित नमूने के लिए 1.6 गुना की तुलना में छोटे होने के रूप में मापा गया. मेंप्रोटीन के 99% एक 1:1 मिश्रण से अधिक दूरी पर मानक विचलन में वृद्धि दर्शाता है, उम्मीद अनुपात के 3.8 गुना के भीतर थे 01:10 और 10:01 के नमूने,. Redi लेबलिंग क्लोस्ट्रीडियम phytofermentans proteome के लिए लागू किया गया था, हम ग्लूकोज (चित्रा -4 ए) पर बढ़ती दोहराने संस्कृतियों के लिए 2 गुना के स्तर के भीतर मापा 94% प्रोटीन के साथ 2,000 से अधिक प्रोटीन की मात्रा निर्धारित की. प्रोटीन. एस संस्कृतियों का डुप्लिकेट जोड़े के लिए परिवर्तन (सेलुलोज बनाम ग्लूकोज) भी अत्यधिक (2 आर = 0.82) सहसंबद्ध थे, चित्रा (4 बी) गुना cerevisiae तुलना (चित्रा 3) एक ही संस्कृति से कर रहे हैं और इस प्रकार Redi आधारित मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के तकनीकी reproducibility दिखा. सी. phytofermentans माप (आंकड़े -4 ए, बी) अभिव्यक्ति मतभेद माप त्रुटि और संस्कृतियों के बीच जैविक विभिन्नता दोनों का प्रतिनिधित्व करते हैं इसलिए संस्कृतियों को दोहराने की तुलना करें. साथ में, इन अनुभवबयान Redi प्रोटिओमिक्स जटिल नमूने के बीच प्रोटीन अभिव्यक्ति मतभेद यों के लिए एक सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि है कि समर्थन करते हैं.
चित्रा 1. मुक्त amines dimethylate को भारी और प्रकाश अभिकर्मकों का उपयोग कर पेप्टाइड्स के reductive dimethylation. प्रकाश अभिकर्मकों बनाम भारी साथ लेबल एक ही पेप्टाइड मुक्त amine प्रति एक 6.0377 दा जन पारी है. यहाँ दिखाया गया है पेप्टाइड एन टर्मिनस पर और एक लाइसिन पक्ष श्रृंखला पर दोनों लेबल है. संदर्भ 11 से अनुकूलित छवि. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
तीर ऊपर reductive dimethylation द्वारा मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए प्रोटोकॉल के चित्रा 2. अवलोकन. लाल संख्या प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों के अनुरूप हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Saccharomyces cerevisiae पूरे सेल lysates का उपयोग Redi लेबलिंग की चित्रा 3. मूल्यांकन. 10L, 1h: 5L, 1h: 2L, 1h: 1L, 2H: 1L, 5H: एक ही संस्कृति से नमूने भारी (एच) और प्रकाश विभिन्न अनुपात में मिश्रित (एल) अभिकर्मकों, (1h के साथ या तो लेबल थे 1L, और 10H: 1L), और एच एल और नमूने के बीच प्रोटीन मतभेद प्रवेश 2 मंझला MS1 चोटी क्षेत्र अनुपात (2 एच / एल अनुपात log) के रूप में मात्रा निर्धारित किया गया था. सभी डेटा के माध्यम से एक रेखीय प्रवृत्ति रेखा के आर 2 मूल्यअंक 0.96 (काला लाइन) था; पियर्सन सहसंबंध 0.98 था. विश्वास सीमाओं (लाल लाइनों) डेटा बिंदुओं का 95% हर नमूने पाए गए जो भीतर प्रवृत्ति रेखा से पूर्ण सीधा दूरी दिखा. संदर्भ 12 से अनुकूलित छवि. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4. मात्रा Redi लेबल क्लोस्ट्रीडियम विभिन्न कार्बन स्रोतों की बढ़ती संस्कृतियों से प्रोटीन phytofermentans. एक दोहराने ग्लूकोज संस्कृति को एक ग्लूकोज संस्कृति रिश्तेदार, एक hemicellulose संस्कृति, और एक सेलूलोज संस्कृति में एक) प्रोटीन अभिव्यक्ति. ग्लूकोज ग्लूकोज (94%), ग्लूकोज hemicellulose (80%), और glucos: दुगना स्तर के भीतर व्यक्त प्रोटीन का अंशई सेलूलोज (49%). बी) सेलूलोज संस्कृतियों बनाम ग्लूकोज के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन मोड़ो अत्यधिक सहसंबद्ध होते हैं (2 आर = 0.82) संस्कृतियों का डुप्लिकेट जोड़े के लिए. संदर्भ 12 से अनुकूलित छवियाँ. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
उच्च सस्ती लेबलिंग अभिकर्मकों (अभिकर्मकों नमूना प्रति कम से कम $ 1 लागत), तेजी से प्रतिक्रिया की दर (~ 10 मिनट), पक्ष उत्पादों का अभाव,: कई जगहों मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए एक आकर्षक विधि reductive dimethylation (Redi लेबलिंग) का उपयोग कर पेप्टाइड्स के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग करना reproducibility (आंकड़े 3, 4), स्थिर प्रतिक्रिया उत्पादों, किसी भी प्रोटीज उपयोग करने की क्षमता है, और लेबल पेप्टाइड्स के उच्च आयनीकरण दक्षता. यह एक कृत्रिम माध्यम पर विशिष्ट एमिनो एसिड auxotrophies या वृद्धि के साथ उपभेदों या सेल लाइनों की आवश्यकता नहीं है क्योंकि Redi द्वारा रासायनिक लेबलिंग भी चयापचय लेबलिंग के लिए फायदेमंद रिश्तेदार है. जैसे, Redi कुछ उत्परिवर्ती उपभेदों दूसरों 15 के बीच, 13 और मानव स्टेम सेल 14 उपलब्ध हैं जिसके लिए उपन्यास रोगाणुओं 12 सहित प्रोटीन के नमूने के लगभग किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है.
Redi लेबलिंग की एक सीमा है ओ.टी. के लिए रिश्तेदार के नमूने मल्टीप्लेक्स के लिए एक कम क्षमता हैइस तरह के (जैसे, iTRAQ या टीएमटी), जिसके लिए वर्तमान में 8 नमूने हो सकता है समदाब रेखीय लेबलिंग के रूप में उसके तरीकों एक साथ 16 मात्रा. हम यहाँ वर्णन विधि दो विभिन्न लेबल नमूनों की मात्रात्मक तुलना की अनुमति देता है. Formaldehyde और cyanoborohydride के अतिरिक्त समस्थानिक संयोजन दा 17 में कम से कम 4 से अलग और Redi लेबलिंग हाल ही में 5 मल्टिप्लेक्स नमूने 18 से बढ़ा दिया गया है कि 3 लेबल तक का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Redi लेबलिंग की एक और चुनौती उलट चरण क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करते समय deuterated पेप्टाइड्स प्रकाश वालों से पहले थोड़ा elute है. इस 'ड्यूटेरियम प्रभाव "के लिए नियंत्रित करने के लिए, पेप्टाइड मात्रा का ठहराव हमेशा के बजाय एक स्कैन से तीव्रता के पूरे निकाले आयन वर्णलेख (MS1 शिखर क्षेत्र) के आधार पर किया जाना चाहिए.
यहाँ वर्णित Redi प्रोटिओमिक्स प्रोटोकॉल कमी डाइमिथाइल लेबलिंग की पहली वर्णन के बाद से किए गए कई सुधार 11,15,17 शामिलमास स्पेक्ट्रोमेट्री 5 के लिए पेप्टाइड्स की. हम एक "पर स्तंभ" लेबलिंग उच्च पेप्टाइड मात्रा और लेबलिंग दक्षता नमूना मिश्रण से पहले सत्यापित किया जा सकता अनुमति देने के लिए विधि, लेकिन "समाधान में" और "ऑनलाइन" लेबलिंग तरीके के रूप में अच्छी तरह से 19 मौजूद वर्णन किया. Proteome मात्रा का ठहराव के अलावा, Redi लेबलिंग isoform दृढ़ संकल्प 20 के लिए लागू किया जा रहा है और इस तरह के phosphorylation 11,18 एसिटिलीकरण 21, और ग्लाइकोसिलेशन के रूप में 22 के बाद translational संशोधनों का विश्लेषण करने के लिए अन्य तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है. क्योंकि अपनी बहुमुखी प्रतिभा और सस्ती, मात्रात्मक रसायन विज्ञान, Redi लेबलिंग तेजी से नए और रोमांचक तरीके में मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स को लागू किया जाएगा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अन्य संघर्ष की घोषणा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| Cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| Deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| Sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
