Summary
Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es una estrategia rápida, de bajo costo para la proteómica precisas de masa basados en espectrometría cuantitativos. Aquí se demuestra un método robusto para la preparación y el análisis de mezclas de proteínas utilizando el enfoque Redi que se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra.
Abstract
Etiquetado de isótopos estables de péptidos por dimethylation reductora (etiquetado REDI) es un método para cuantificar con precisión las diferencias de expresión de proteínas entre muestras mediante espectrometría de masas. Etiquetado REDI se lleva a cabo utilizando formas regulares deuterados (pesados) de formaldehído y cianoborohidruro de sodio (luz) o para agregar dos grupos metilo a cada amina libre. Aquí se demuestra un protocolo robusto para el etiquetado Redi y la comparación cuantitativa de mezclas complejas de proteínas. Proteína muestras para la comparación se digieren en péptidos, etiquetados para llevar la luz o las etiquetas de metilo pesados, mezclados, y co-analizados por LC-MS/MS. Abundancias de proteínas relativas se cuantificaron mediante la comparación de las áreas de los picos del cromatograma de iones de versiones pesadas y ligeras marcados de la péptido constituyente extraído de la plena espectros de MS. El método descrito aquí incluye preparación de la muestra por extracción en fase sólida de fase inversa, etiquetado Redi en columna de péptidos, péptido fraccionamiento por rev de pH básicofase ersed (BPRP) cromatografía y purificación de péptidos StageTip. Se discuten las ventajas y limitaciones de etiquetado Redi con respecto a otros métodos para la incorporación de isótopos estables. Destacamos las nuevas aplicaciones utilizando el etiquetado Redi como un método rápido, económico y preciso para comparar la abundancia de proteínas en casi cualquier tipo de muestra.
Introduction
Medición de diferencias de concentración de muchas proteínas entre muestras complejas es un reto central en la proteómica. Cada vez más, esto se hace mediante el etiquetado de proteínas en cada muestra con diferentes etiquetas isotópicas, la combinación de las muestras, y el uso de la espectrometría de masas para cuantificar las diferencias de concentración. Existen varios métodos para el marcaje isotópico estable de proteínas y péptidos. 15 N etiquetado 1 y 2 SILAC introducen marcadores isotópicos metabólicamente in vivo, mientras que iCAT 3, iTRAQ 4, y la reducción de dimethylation 5 agregan etiquetas de isótopos estables después de la extracción de proteínas y la digestión. Entre estos métodos, dimetilación reductora (etiquetado Redi) está ganando popularidad como un método económico y reproducible para cuantificar las diferencias de concentración de proteína en casi cualquier tipo de muestra.
Etiquetado Redi implica péptidos que reaccionan con el formaldehído para formar una base de Schiff, que se reduce luegode cianoborohidruro. Esta reacción dimethylates grupos amino libres en N-terminales y cadenas laterales de lisina y monomethylates prolinas N-terminales. El protocolo descrito aquí methylates péptidos en la muestra 1 con una etiqueta de "luz" usando reactivos con átomos de hidrógeno en su distribución isotópica natural y la muestra 2 con una etiqueta de "pesado" con formaldehído deuterado y cianoborohidruro (Figura 1). Cada grupo amino dimetilado en un péptido da como resultado una diferencia de masa de 6,0377 Da entre la luz y las formas pesados, que se emplea para distinguir entre las dos formas utilizando un espectrómetro de masas. Específicamente, las abundancias relativas de péptidos se cuantifican como la relación de áreas cromatograma de iones extraídos MS1 (relación de área de pico MS1) de la luz y la versión pesada para cada par de iones de péptido. La abundancia relativa de una proteína se calcula como la mediana relación de área de pico MS1 entre todos los péptidos en la proteína. En este reporte se describe un protocolo robusto por conductaing experimentos de etiquetado Redi por LC-MS/MS que incluye la extracción de fase inversa de péptidos en fase sólida, etiquetado Redi en columna, fraccionamiento por pH básico péptido en fase inversa (BPRP) cromatografía, y la purificación de mezclas de péptidos utilizando StageTips (Figura 2) . Se discuten las ventajas y limitaciones del uso de etiquetado Redi para proteómica cuantitativa.
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Protocol
NOTA: Este método fue descrito previamente 12.
1. De aislamiento de proteínas
Prepare 1 mg de proteína celular por las células de lisis, preferiblemente por métodos físicos como la prensa francesa, golpes de talón, o ultrasonidos. Evitar la lisozima lisis celular mediada porque la enzima confundirá mediciones de espectrometría de masas.
2. Precipitación con TCA de las proteínas
Añadir ácido tricloroacético 1 volumen (TCA) a 4 volúmenes de proteínas y se enfría en hielo durante 10 minutos para precipitar las proteínas. Centrifugar a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 1 ml de acetona enfriada con hielo y se centrifuga a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante e invierta el tubo en el banco para secar el sedimento durante 15 min. Pellets de proteína Almacenar a -80 ° C.
3. Desnaturalizar las proteínas y reducir enlaces disulfuro
Resuspender las proteínas a ~ 2 mg / ml en 500 l de tampón de desnaturalización y reducción (o bien 4 M de urea o SDS al 3% en 50 mM de HEPES, pH 8,5, DTT 5 mM). Opcionalmente, incluir un inhibidor de la proteasa en la memoria intermedia. Incubar las proteínas durante 30 min a 56 ° C, seguido por 10 min a temperatura ambiente.
4. Aklylate gratis Sulfidrilo Grupos de perturbar irreversiblemente disulfuro Formación
Prepare fresco 0,3 M yodoacetamida en agua. ¡CUIDADO! Yodoacetamida es altamente tóxico. Añadir 25 l 0,3 M yodoacetamida (15 mM de concentración final) a 500 l de proteína y se incuba durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Sacia yodoacetamida añadiendo 10 l de 300 mM DTT (5 mM concentración final TDT). Guarde proteínas alquiladas a -80 ° C.
5. La digestión de proteínas
TCA precipitar proteínas (como se describe en el paso 2) y resuspender en 1 ml de HEPES 50 mM (pH 8,2), 1 M de urea. Preparar una solución madre de Lisil endoproteinASE (Lys-C) en agua a una concentración de 2 g / l y añadir 5 l de la solución de proteína. Incubar la mezcla durante 16 horas a temperatura ambiente. Asegúrese de que la concentración final Lys-C es 10 ng / l y la relación proteína-a-LysC (W / W) es 1/50 a 1/200. Resuspender 20 g de tripsina grado de secuenciación en 40 l de 50 mM de ácido acético, añadir 5 l (10 mg de tripsina) a la Lys-C digest, y se incuba durante 6 horas a 37 ° C. Utilice la misma concentración de proteasa y proporciones-proteasa-a proteína para Lys-C tal como se utiliza para la tripsina.
6. De fase inversa de péptidos Extracción
- Acidificar péptidos mediante la adición de ácido trifluoroacético (TFA) a una concentración final de 0,5% (pH ≈ 2). Adjuntar una columna C18 a un colector de extracción. Utilice el caudal más alto posible para todas las etapas, excepto carga y la elución de los péptidos.
- Columna húmeda con 6 ml de acetonitrilo (ACN). Lavar la columna con 6 ml de 80% de ACN, 0,1% de TFA, a continuación, se equilibre con 6 ml de TFA al 0,1%. No permita que lacolumna para funcionar en seco entre los pasos.
- Deja de presión de vacío y carga de 500 g de péptidos en la columna a un caudal de aproximadamente 1 ml / min. Una vez que los péptidos se han unido a la columna, de vacío reinicio y se lava con 6 ml de TFA al 0,1%, a continuación con 3 ml de tampón de ácido cítrico (0,09 M de ácido cítrico, 0,23 M de Na 2 HPO 4, pH 5,5).
Nota: las cantidades de péptido más altas pueden ser etiquetados, pero la columna C18 capacidad de unión deben ser al menos dos veces mayores que la cantidad de péptido para evitar la pérdida de muestra.
7. En la columna de péptido etiquetado por reductiva dimethylation (REDI Etiquetado)
Realice este paso en una campana química como cianuro de hidrógeno se libera en baja concentración durante el proceso de etiquetado.
- Preparar 12 ml de "ligeros" y tampones Redi "pesados" para metilar aminas péptido libres. Búfer Redi Luz consta de 0,8% de formaldehído y 0,12 M de cianoborohidruro de sodio llevar hidrógenos en their distribuciones isotópicas naturales en tampón de ácido cítrico. Búfer Redi pesado consiste en 0,8% de formaldehído deuterado y 0,12 M de cianoborohidruro de sodio deuterado en tampón ácido cítrico.
- Incubar columna que contiene péptidos mediante la adición de 10 ml ya sea de luz o de amortiguamiento Redi pesada para las columnas que contienen péptidos a un caudal de 1 ml / min y repetir para asegurar el etiquetado completo. Lavar la columna con 6 ml de TFA al 0,1% y luego con ácido acético 1 ml de 0,5%.
- Deja de vacío y eluir péptidos marcados primero con 1 ml de 40% de ACN, ácido acético 0,5%, luego con 1 ml de 80% de ACN, 0,5% de ácido acético utilizando un caudal de aproximadamente 0,5 ml / min. Si lo desea, mida la eficiencia de marcaje de muestras individuales por espectrometría de masas antes de mezclar muestras pesadas y ligeras (véase "Los resultados representativos"). Mezclar 01:01 péptido muestras pesadas y ligeras que llevan la etiqueta de ser cuantificados por espectrometría de masas.
8. Separate Péptido Mezcla por Basic pH Fase Invertida (BPRP) Cromatografía </ P>
PH básico cromatografía de fase inversa (BPRP) para separar la mezcla de péptidos en múltiples fracciones, que se analizan de forma independiente por LC-MS/MS para aumentar la cobertura del proteoma.
- Fraccionar la mezcla de péptidos en una columna C18-HPLC mediante la aplicación de un gradiente de concentración creciente de ACN en 10 mM de bicarbonato de amonio (pH 8). Comience con 5% (v / v) de ACN durante 5 min, aumentar a 35% de ACN en 60 min, y luego a 90% de ACN en 1 min. Conservar la ACN 90% durante 4 min antes de reducir la ACN a 5% para volver a equilibrar la columna para 9 min. Recoger 96 fracciones de igual volumen en una placa de 96 pocillos (A1 a H12). Supervisar el fraccionamiento utilizando un detector UV a 220 nm, mientras que los péptidos se eluyen de la columna (10-70 min durante las condiciones descritas aquí).
- Se combinan las fracciones de los pozos A1, C1, E1, G1 y (fracción A1), a partir de los pocillos B1, D1, F1, y H1 (fracción B1), de los pozos A2, C2, E2, y G2 (fracción A2) y en consecuencia para la restantes fracciones. Retire la solvent usando una centrífuga de vacío. Péptidos Resuspender de fracciones A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 y B12 en 130 l de 1 M urea/0.5% TFA y purificar usando StageTips como se describe en el paso 9. Tienda fracciones B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 y A12 a -20 º C.
9. Purify péptidos por Stop and Go Extracción (StageTips)
Preparar C18-StageTip 7 microcolumnas por el embalaje de 200 puntas de pipeta l con dos C18 discos con un diámetro interno (ID) de 1,07 mm. Poner Consejos Etapa en tubos Eppendorf. Utilice una microcentrífuga para lavar consejos con 130 l de metanol, a continuación, 130 ul 80% de ACN, ácido acético 0,5%. Equilibre StageTips con 130 l 0,1% de TFA. Transferir la mezcla de péptidos a StageTips y se lava con 130 l 0,1% de TFA, a continuación, 40 l 0,1% de TFA, a continuación, 40 l de ácido acético al 0,5%. Eluir péptidos primero con 20 l 40% de ACN, ácido acético 0,5%, a continuación, 20 l 80% de ACN, ácido acético 0,5%. Combine eluidos unnd seco por filtración al vacío.
10. Microcapilares LC-MS/MS
- Disolver péptidos en 1-5 l de ácido fórmico al 5%, 5% de ACN a una concentración de aproximadamente 1 g / l. Resolver ~ 1 g péptidos en un 100 micras × 20 cm C18-invertidas columna de HPLC de fase con un gradiente de 6-22% de ACN en ácido fórmico al 0,125% aplicado sobre 75 o 100 min a una velocidad de flujo de ~ 300 Nl / min.
- Identificar péptidos usando un LTQ Velos Orbitrap 12 o plataforma similar cromatografía líquida-espectrometría de masas con un espectrómetro de masa que disponga de alta resolución y alta precisión en masa. Operar el espectrómetro de masas en modo dependiente de los datos con una MS de barrido completo (resolución de 60000) adquiridos en el analizador Orbitrap. Generar trampa de iones lineal espectros MS / MS para los 20 más abundantes iones detectados en el espectro MS. Ajuste el control automático de ganancia (AGC) objetivos a 1 x 10 6 para el pleno MS y 2000 para MS / MS. Establecer tiempos máximos de acumulación de iones para 1000 msegpara MS y 150 mseg para MS / MS. Excluir iones precursores de péptidos fragmentados de una selección adicional de MS / MS de 20-60 seg.
11. MS / MS de Adquisición de Datos
Identificar péptidos mediante la comparación de archivos RAW espectros MS / MS a una base de datos teórica con un algoritmo tal como SEQUEST 8 usando estos parámetros (Tabla 1).
Tabla 1. Péptido de bases de datos de parámetros de búsqueda.
| Parámetros generales | digestión plenamente tríptico con hasta 2 perdió divisiones |
| 25 ppm de iones de precursor de la tolerancia | |
| 1.0 Da fragmento de la tolerancia de iones | |
| Modificaciones estáticas | 57.02146 Da en cisteína, carboxiamidometilación |
| 28.03130 Da en lisina y el péptido N-terminal, etiqueta dimethylation luz | |
| Modificaciones dinámicas | 15.99491 Da en metionina, la oxidación |
| 6.03766 Da en lisina y el péptido N-terminal, etiqueta dimethylation pesada |
- Filtrar péptidos a una tasa de falso descubrimiento 1% con un método como la estrategia de objetivo señuelo 9 usando una base de datos de los marcos de lectura abiertos en las orientaciones reales e invertidas.
12. Péptido Cuantificación
Calcular las áreas de pares pesadas y ligeras de MS1 extrajeron los cromatogramas de iones (áreas de los picos MS1) y el péptido de señal a ruido (S / N) las relaciones de 10. Incluya pares peptídicos sólo cuando su media de señal a noirelación en sí está por encima de cinco. Cuantificar la abundancia relativa de un péptido en las dos muestras como la relación de áreas de los picos de MS1 versiones pesadas y ligeras de la misma péptido (proporción de área de pico MS1). Cálculo de las abundancias de proteínas relativos como la relación del área del pico MS1 mediana para todos los péptidos en la proteína.
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Representative Results
Se evaluó la exactitud, precisión y reproducibilidad de etiquetado Redi utilizando Saccharomyces cerevisiae y Clostridium phytofermentans lisados de células enteras. Primero cuantificamos el etiquetado de eficiencia Redi de una mezcla de C. phytofermentans lisados de proteínas a partir de celulosa culturas (pesada etiqueta, H) y glucosa (etiqueta de la luz, L). Cuando se filtra a un péptido falso descubrimiento tasa del 1%, la muestra contenía 11.194 secuencias de péptidos únicos con un etiquetado de eficiencia Redi 98%. No fraccionada S. cerevisiae proteína lisado se marcó de manera similar con H o L reactivos, mezclado en diversas proporciones, y se analizó. Las diferencias de expresión de proteínas (log 2 (zonas de mediana pico MS1)) reflejan y reproducen las relaciones en las que se mezclan las muestras H y L en una amplia gama de relaciones de mezcla (Figura 3). Específicamente, se midió el cambio de plegado de 99% de las proteínas como siendo más pequeño que 1,6 veces para las 1:01 muestras mixtas. Enlas 01:10 y 10:01 muestras, 99% de proteínas estaban dentro de 3,8 veces de la relación era de esperar, que muestra un aumento en la desviación estándar en la mayor distancia de una mezcla 01:01. Cuando etiquetado REDI se aplicó a proteoma del Clostridium phytofermentans, hemos cuantificado más de 2.000 proteínas con proteínas 94% medidos en niveles de 2 veces para cultivos replicados crecen en glucosa (Figura 4 A). Proteína veces cambios de pares de duplicados de las culturas (la glucosa en comparación con la celulosa) también fueron altamente correlacionados (r 2 = 0,82), (Figura 4B). S. comparaciones cerevisiae (Figura 3) son de una sola cultura y por lo tanto muestran la reproductibilidad técnica de la proteómica cuantitativa a partir Redi. C. phytofermentans mediciones (Figuras 4A, B) comparan replicar culturas para las diferencias de expresión representan tanto el error de medida y la variación biológica entre culturas. En conjunto, estos experimentostos apoyan que Redi proteómica es un método preciso y reproducible para cuantificar las diferencias de expresión de proteínas entre muestras complejas.
Figura 1. Dimethylation reductiva de péptidos utilizando reactivos pesadas y ligeras para dimethylate aminas libres. Lo mismo péptido marcado con un fuerte frente reactivos de luz tiene un 6,0377 Da turno masa por amina libre. El péptido se muestra aquí está etiquetado tanto en el extremo N-terminal y una cadena lateral de lisina. Imagen adaptada de Referencia 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Visión general del protocolo para la proteómica cuantitativa por dimethylation reductora. Números rojos encima de las flechas corresponden a los pasos descritos en el protocolo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Evaluación de etiquetado Redi usando Saccharomyces cerevisiae lisados de células enteras. Las muestras de una sola cultura fueron etiquetados, ya sea con pesada (L) reactivos, mezcladas en diferentes proporciones (1H (H) y la luz: 10L, 1H: 5L, 1H: 2L, 1H: 1L, 2H: 1L, 5H: 1L, y 10H: 1 l), y las diferencias entre las muestras de proteínas H y L se cuantificaron como cocientes log 2 mediana de área pico MS1 (log 2 relación H / L). El valor de R 2 de una línea de tendencia lineal a través de todos los datospuntos fue 0,96 (línea de color negro); la correlación de Pearson fue de 0,98. Límites de confianza (líneas rojas) muestran la distancia perpendicular absoluta de la línea de tendencia en el que se encontraron el 95% de los puntos de datos para cada muestra. Imagen adaptada de Referencia 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Cuantificación de Redi marcado con Clostridium phytofermentans proteínas a partir de cultivos en crecimiento de diferentes fuentes de carbono. A) Expresión de proteínas en una cultura de la glucosa en relación con una cultura de la glucosa réplica, una cultura hemicelulosa, celulosa y una cultura. La fracción de proteínas expresadas dentro de los niveles doble: glucosa-glucosa (94%), glucosa-hemicelulosa (80%), y Glucose-celulosa (49%). B) Doblar los cambios en la expresión de la proteína para la glucosa en comparación con los cultivos de celulosa están altamente correlacionados (r 2 = 0,82) para los pares de duplicados de cultivos. Imágenes adaptadas de Referencia 12. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Varios puntos hacen que el etiquetado de isótopos estables de péptidos utilizando un método atractivo para proteómica cuantitativa dimethylation reductora (etiquetado REDI): reactivos baratos etiquetado (reactivos cuestan menos de $ 1 por muestra), la velocidad de reacción rápida (~ 10 min), ausencia de productos secundarios, altas reproducibilidad (Figuras 3, 4), productos de reacción estable, capacidad de utilizar cualquier proteasa y de alta eficiencia de ionización de péptidos marcados. Etiquetado químico por Redi es también ventajoso en relación con el etiquetado metabólico, ya que no requiere cepas o líneas celulares con auxotrofías de aminoácidos específicos o crecimiento en un medio sintético. Como tal, Redi se puede aplicar a casi cualquier tipo de muestra de proteína incluyendo nuevos microbios 12 para los que pocas cepas mutantes están disponibles 13 y células madre humanas 14, 15 entre otros.
Una limitación de etiquetado Redi es una menor capacidad para multiplexar muestras relativa a otsus métodos tales como el etiquetado isobárica (por ejemplo, iTRAQ o TMT), para la que actualmente hasta 8 muestras pueden ser simultáneamente cuantificaron 16. El método como se describe aquí permite la comparación cuantitativa de dos muestras marcadas diferencialmente. Combinaciones isotópicas adicionales de formaldehído y cianoborohidruro se pueden utilizar para producir hasta 3 etiquetas que difieren en por lo menos 4 Da 17 y etiquetado REDI se ha extendido recientemente a 5 muestras multiplexadas 18. Otro de los retos de etiquetado Redi es que los péptidos deuteradas eluyen poco antes los ligeros cuando se utiliza la cromatografía de fase inversa. Para el control de este "efecto de deuterio", la cuantificación del péptido siempre debe basarse en todo el cromatograma de iones extraídos (área del pico MS1) en lugar de la intensidad de una exploración.
El protocolo de la proteómica Redi aquí descrita incluye numerosas mejoras 11,15,17 realizados desde la primera descripción de etiquetado dimetil reducciónde los péptidos de la espectrometría de masa 5. Describimos un método "en la columna" etiquetado para permitir cantidades de péptidos más altos y el etiquetado de eficiencia pueden ser verificados antes de mezclar en la muestra, pero "en la solución" y los métodos de etiquetado "en línea" existir, así 19. Además de la cuantificación proteoma, etiquetado Redi está siendo aplicado para la determinación de la isoforma 20 y se puede combinar con otros métodos para analizar las modificaciones post-traduccionales tales como fosforilación 11,18 acetilación 21, y glicosilación 22. Debido a su versatilidad y bajo costo, la química cuantitativa, etiquetado REDI se aplica cada vez más a la proteómica cuantitativa de formas nuevas y emocionantes.
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Disclosures
Los autores declaran no tener que compiten intereses financieros u otros conflictos de intereses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| Cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| Deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| Sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
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