Summary
還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。
Abstract
還元ジメチル化（ラベリングのRedi）によるペプチドの安定同位体標識を正確に質量分析を使用して試料間のタンパク質発現の差異を定量化する方法である。 REDI標識は、各フリーアミンに2個のメチル基を追加するために、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを定期的に（光）または重水素化（重）の形式のいずれかを使用して実行されます。ここでは、REDI標識および複雑なタンパク質混合物の定量的な比較のための堅牢なプロトコルを示しています。比較のためのタンパク質試料を光や重いメチルタグ、混合し、LC-MS/MSによって共同で分析のいずれかを実行するために標識されたペプチドの中に消化される。タンパク質の相対存在量は、全MSスペクトルから抽出された成分ペプチドの重鎖及び軽標識バージョンのイオンクロマトグラムのピーク面積を比較することにより定量される。ここで説明する方法は、塩基性のpH REVによる逆相固相抽出によるサンプル調製、ペプチドのオンカラムREDIラベル、ペプチド分画を含んでいるersed相（BPRP）クロマトグラフィー、およびStageTipペプチド精製。当社は、安定同位体の組み込みのための他の方法に関してREDIラベルの利点と制限について説明します。我々は、サンプルのほぼすべてのタイプの中のタンパク質の存在量を比較するために、高速で安価な、そして正確な方法としてREDIのラベリングを用いた新規のアプリケーションを強調表示します。
Introduction
複雑なサンプル間の多くのタンパク質の濃度差を測定するプロテオミクスにおける中心的な課題である。ますます、このことは、異なる同位体タグを各試料中のタンパク質を標識するサンプルを結合し、濃度差を定量化するために質量分析法を用いて行われている。いくつかの方法がタンパク質およびペプチドの安定同位体標識のために存在しています。15 N標識の1やSILAC 2 ICAT 3、のiTRAQ 4、還元ジメチル化5は、タンパク質の抽出および消化後に安定同位体タグを追加する一方で、 生体内で代謝的に同位体標識を導入。これらの方法の中でも、還元ジメチル化（ラベリングのRedi）は、サンプルのほぼ任意のタイプのタンパク質濃度の違いを定量化するための安価な、再現性のある方法として人気を集めている。
REDI標識は、その後減少するシッフ塩基を形成し、ホルムアルデヒドとペプチドを反応させることを含むシアノ水素化による。この反応は、N-末端およびリジン側鎖およびmonomethylates N-末端のプロリンに遊離アミノ基をdimethylates。ここで説明するプロトコルは、重水素化ホルムアルデヒドとシアノ水素化ホウ素（ 図1）を使用して、「重い」のラベルとの天然の同位体分布とサンプル2の水素原子を有する試薬を使用した「光」ラベルでサンプル1中のペプチドをメチル化。光、質量分析計を用いて二つの形態間を区別するために使用される重質形態との間の6.0377 Daの質量差ペプチドの結果についての各ジメチル化アミノ基である。具体的には、ペプチドの相対存在量は、光のMS1抽出イオンクロマトグラムの面積の比（MS1ピーク面積比）と各ペプチドイオン対についての重鎖バージョンとして定量化される。タンパク質の相対存在量は、タンパク質中の全てのペプチドのうち、中央値MS1のピーク面積比として計算される。本稿では、行動のための堅牢なプロトコルを記述逆相ペプチド固相抽出、オンカラムのRedi標識、ペプチド分画塩基性pH位相（BPRP）クロマトグラフィーを反転し、StageTipsを用いてペプチド混合物を精製し（ 図2）を含むLC-MS/MSによってのRedi標識実験をING 。我々は定量的プロテオミクスのためREDIラベルを使用することの利点と制限について説明します。
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Protocol
注：この方法は、以前に12を説明した。
1。タンパク質の単離
好ましくは、フレンチプレス、ビーズビーティング、または超音波のような物理的方法により、細胞を溶解することによって細胞タンパク質1mgを準備します。酵素は、質量分析の測定を混乱されますので、リゾチーム媒介細胞溶解を避けてください。
タンパク質の2。TCA沈殿
タンパク質を沈殿さ10分間氷上で4倍量のタンパク質と寒さに1ボリュームトリクロロ酢酸（TCA）を追加します。 4℃で5分間、12,000×gで遠心分離し、上清を取り除く。 4℃で5分間、12,000×gで氷冷アセトン及び遠心分離機の1ml中にペレットを再懸濁上清を除去し、15分間、ペレットを乾燥させるためにベンチにチューブを反転させる。 -80℃での店舗タンパク質ペレット
3。変性タンパク質ジスルフィド結合を還元
リタンパク質をサスペンド500μlの変性および還元緩衝液中で約2 mg / mlの（50mMのHEPES pH8.5で、5mMのDTT中4 M尿素または3％SDSのいずれか）である。任意選択で、緩衝液中のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。室温で10分間、続いて56℃で30分間、タンパク質をインキュベートする。
4。Aklylate無料スルフヒドリル基が不可逆的ジスルフィド結合の形成を破壊する
水中での新鮮な0.3Mのヨードアセトアミドを準備します。注意！ヨードアセトアミドは、非常に毒性が強い。 500μlのタンパク質に25μlの0.3 Mヨードアセトアミド（15mMの最終濃度）を添加し、室温で暗所に20分間インキュベートする。 300のDTT（5 mMの最終DTT濃度）を10μlを添加することにより、ヨードアセト急冷。 -80℃でアルキル化されたタンパク質を保存する
5。タンパク質消化
TCAは、タンパク質を沈殿させる（工程2に記載のように）および50 mMのHEPES（pHは8.2）1mlを、1 M尿素中で再懸濁する。シルendoproteinの原液を準備し2μgの/μLの濃度のタンパク質溶液に5μLを加え、水中でのASE（のLys-C）。室温で16時間混合物をインキュベートする。最終の確保のLys-C濃度は10ngの/μlのタンパク質と対のLysC比である（w / w）の50分の1〜200分の1である。 、50 mMの酢酸を40μlの20μgのシーケンシンググレードのトリプシンを再懸濁のLys-C消化物に5μL（10μgのトリプシン）を追加し、37℃で6時間インキュベートトリプシンに使用したのLys-Cに同じプロテアーゼ濃度およびプロテアーゼとタンパク質との比を使用してください。
6。逆相ペプチド抽出
- 0.5％の最終濃度（pH試験≈2）にトリフルオロ酢酸（TFA）を加えることによりペプチドを酸性化する。抽出マニホールドにC18カラムを取り付けます。ペプチドのローディングおよび溶出を除くすべてのステップのための可能な限り最高の流量を使用してください。
- 6ミリリットルのアセトニトリル（ACN）で濡れ列。 6ミリリットル80パーセントのACN、0.1％TFAでカラムを洗浄し、6ミリリットルの0.1％TFAで平衡化させます。許可されていませんステップ間で枯渇する列。
- 真空圧を停止し、約1ml /分の流速でカラムにペプチド500μgのを読み込む。ペプチドは、カラム、再始動真空に結合し、次いで（0.09 Mクエン酸、0.23 MのNa 2 HPO 4、pH5.5）中のクエン酸緩衝液3mlで6 mlの0.1％TFAで洗浄した後。
注：より高いペプチドの量は、標識することができるが、C18カラムの結合能力は、試料の損失を回避するために、ペプチドの量よりも少なくとも2倍高くなければならない。
7。オンカラム還元ジメチル化によるペプチドの標識（REDIラベリング）
シアン化水素は、ラベリング処理中に低濃度で放出された化学フードの下で、この手順を実行します。
- ペプチド遊離アミンをメチル化するために「光」と「重い」REDIバッファの12ミリリットルを用意します。光のRedi緩衝液は0.8％ホルムアルデヒド及び番目に水素を運ぶ0.12 Mシアノ水素化ホウ素ナトリウムから成りクエン酸緩衝液中のEIR天然の同位体分布。重鎖のRedi緩衝液は0.8％重水素化ホルムアルデヒド、クエン酸緩衝液中の0.12 M重水素化シアノ水素化ホウ素ナトリウムからなる。
- 1ミリリットル/分の流速でペプチド含有列に10ミリリットル光や重いREDIバッファのいずれかを追加することにより、ペプチドを含む列をインキュベートし、完全なラベル付けを確実にするために繰り返します。ウォッシュ6ミリリットル0.1％TFAでカラム、次いで1ミリリットルの0.5％酢酸を含む。
- 真空を停止し、1mlの80％ACN、約0.5ml /分の流速を用いて0.5％酢酸で、次いで1mlの40％ACN、0.5％酢酸を有する第1の標識されたペプチドを溶出させる。所望であれば、重鎖および軽鎖のサンプルを混合する前に、質量分析により個々の試料の標識効率を測定する（「代表的な結果」を参照）。質量分析によって定量化することが1:1重鎖及び軽標識化ペプチドのサンプルを混合する。
塩基性pH逆相（BPRP）クロマトグラフィー<によって8。セパレートペプチド混合物/ pの>
塩基性pHは、独立して、プロテオームカバー率を増加させるためにLC-MS/MSにより分析する複数の画分へのペプチド混合物を分離するために相（BPRP）クロマトグラフィーを逆転させた。
- 10mMの重炭酸アンモニウム（pH8）に増加ACNの濃度勾配を適用することにより、C18-HPLCカラム上でペプチド混合物を分画する。 5分間、5％（v / v）のACNで開始し、60分で35％ACNへ増大し、1分間で、次いで90％ACN。 9分間の再平衡化の列に5％ACNを削減する前に4分間、90％ACNを保持します。 96ウェルプレート（H12にA1）に、等量の96画分を収集する。ペプチドは、（ここに記載された条件のために10〜70分）でカラムから溶出している間に220 nmでのUV検出器を用いて分画を監視します。
- 井戸A2、C2、E2、およびG2（フラクションA2）から、それに応じてのために、ウェルB1、D1、F1、およびH1（フラクションB1）から、井戸A1、C1、E1、およびG1（フラクションA1）から分画を組み合わせ残りの画分。 solvenを削除真空遠心機を用いてtを画分からの再懸濁し、ペプチドが、A1、B2、A3、B4、A5、B6、A7、B8、A9、B10、A11、およびB12、1M urea/0.5％のTFAを130μL中、ステップ9で説明したようにStageTipsを使用して浄化する。ストア画分B1、A2、B3、A4、B5、A6、B7、A8、B9、A10、B11、および-20 A12ºCの
9。ストップアンドゴーの抽出によって精製し、ペプチド（StageTips）
1.07ミリメートルの内径（ID）が2 C18ディスクを備えた200μlのピペットチップを充填することにより、C18-StageTip 7マイクロカラムを準備します。エッペンドルフチューブにステージのヒントを置く。メタノール130μL、その後130 UL 80パーセントACN、0.5％の酢酸でのヒントを洗浄するためのマイクロを使用しています。 130μlの0.1％TFAでStageTipsを平衡化させます。 StageTipsにペプチド混合物を移し、40μlの0.5％酢酸、その後、40μlの0.1％TFA、その後、130μlの0.1％TFAで洗浄する。 20μlの40％ACN、0.5％酢酸、次いで、20μlの80％ACN、0.5％酢酸を有する第1のペプチドを溶出させる。溶出液A組み合わせるND真空濾過により乾燥させます。
10。マイクロキャピラリーLC-MS/MS
- 約1μgの/μLの濃度に1-5μlの5％ギ酸、5％ACN中のペプチドを溶解させる。 0.125％ギ酸中の6から22パーセントACNの勾配で100ミクロン×20センチC18-逆相HPLCカラム上の解決〜1μgのペプチドは、〜300リットル/分の流量で75又は100分間にわたって適用した。
- LTQ Velos 12又はオービトラップ質量分析計は、高分解能、高質量精度を提供することで同様の液体クロマトグラフィー-質量分析プラットフォームを用いてペプチドを同定する。オービトラップアナライザで取得されたフルMSスキャン（60,000の分解能）とデータ依存モードでの質量分析装置を操作します。完全なMSスペクトルで検出された20の最も豊富なイオンのための線形イオントラップMS / MSスペクトルを生成する。 MS / MSのための完全なMSのための1×10 6と2000に自動利得制御（AGC）の目標を設定します。千ミリ秒、最大イオン蓄積時間を設定するMSおよびMS / MS用150ミリ用。 20〜60秒のためのMS / MSからのさらなる選択から断片化されたペプチド前駆体イオンを除外します。
11。、MS / MSデータ収集
これらのパラメータ（ 表1）を用いて、このようなSEQUEST 8などのアルゴリズムを用いて理論的なデータベースへのMS / MSスペクトルのRAWファイルを比較することにより、ペプチドを同定。
表1。ペプチドデータベース検索のパラメータを。
| 一般的なパラメータ | 最大2と完全にトリプシン消化は、切断を逃した |
| 25 ppmの前駆イオントレランス | |
| 1.0ダフラグメントイオンの許容範囲 | |
| 静的な変更 | システイン、カルボキシアミドメチル化に関する57.02146ダ |
| リジンおよびペプチドのN末端上28.03130ダ、光ジメチル化ラベル | |
| 動的変更 | メチオニン、酸化に対する15.99491ダ |
| リジンおよびペプチドのN末端、重いジメチル化ラベルに6.03766ダ |
- 実際、逆向きでオープンリーディングフレームのデータベースを使用して、ターゲット·デコイ9戦略としてのメソッドを使用して1％の偽発見率にフィルタペプチド。
12ペプチドの定量化
計算MS1の重鎖および軽鎖のペアの領域は、イオンクロマトグラム（MS1ピーク面積）およびペプチドシグナル対ノイズ（S / N）比が10を抽出した。ペプチドを含むペアた場合にのみ、その平均信号NOIそれ比は5以上である。同じペプチド（MS1ピーク面積比）の重鎖および軽鎖のバージョンMS1ピーク面積の比が、2つの試料中のペプチドの相対存在量を定量する。タンパク質中の全てのペプチドの中央値MS1ピーク面積比と相対タンパク質量を計算します。
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Representative Results
私たちは、Saccharomyces cerevisiaeを使用して正確さ、精度、およびREDIラベルの再現性を評価し、 クロストリジウムは、全細胞溶解物をphytofermentans。まず、CのミックスのRediの標識効率を定量化セルロース（重ラベル、H）とグルコース（光ラベル、L）の培養物からタンパク質溶解物をphytofermentans。 1％ペプチド偽発見率に濾過する場合、このサンプルは、98％のRediの標識効率と11194のユニークなペプチド配列を含有していた。未分画S.セレビシエタンパク質溶解物は、同様に、HまたはLの試薬 で標識された様々な比率で混合し、そして分析した。タンパク質発現の違い（2）（中央値MS1ピーク面積を記録）再現性H及びLサンプルは比（ 図3）を混合するの広い範囲にわたって混合した時の比を反映する。具体的には、タンパク質の99％の倍率変化を、1:1の混合試料に対して1.6倍よりも小さいようにして測定した。で1:10〜10時01分試料、タンパク質の99％が1:1の混合物からより大きな距離での標準偏差の増加を示す、予想される比の3.8倍以内であった。 REDIの標識はクロストリジウムphytofermentansプロテオームを印加したとき、我々はグルコースに生育する複製培養用の2倍のレベル内で測定、94％のタンパク質（ 図4A）で2,000以上のタンパク質を定量した。タンパク質は文化の重複ペアの変更点（セルロース対グルコース）、高度に相関していた（R 2 = 0.82）、（ 図4B）を折る。S.サッカロミセス·セレビシエの比較（ 図3）は、単一の培養物からであり、従って、REDI基づく定量的プロテオミクスの技術的な再現性を示している。C. phytofermentans測定 （ 図4A、B）は、発現差は測定誤差や文化間の生物学的変動の両方を表すように文化を複製比較。一緒に、これらの実験メンツはREDIプロテオミクスは、複雑なサンプル間のタンパク質発現の違いを定量化するための正確で再現性のある方法であることを支持している。
図1。遊離アミンをdimethylateする重および軽試薬を用いてペプチドの還元ジメチル化。光試薬対ヘビーで標識された同一のペプチドは、遊離のアミンあたり6.0377ダマスのシフトを持っています。ここに示すペプチドは、N末端及びリシン側鎖の両方で標識されている。画像は参考文献11から適応。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
矢印上の図2。還元ジメチル化による定量的プロテオミクスのためのプロトコルの概要。赤い数字は、プロトコルで説明されたステップに対応しています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
サッカロミセス·セレビシエ全細胞溶解物を用いてのRedi標識の図3の評価 。単独培養からのサンプルの重（H）のいずれかで標識し、種々の割合（1Hで混合軽（L）試薬、：10L、1H：5L、1H：2L、1H：1L、2H：1L、5H：1L、および10H：1L）およびHとLのサンプル間のタンパク質の差は、log 2メディアンMS1ピーク面積比（H 2 / L比を対数）として定量した。すべてのデータを通して線形トレンドラインのR 2値ポイントは0.96（黒線）であった。ピアソンの相関は0.98であった。信頼境界（赤線）のデータポイントの95％が各サンプルについて見出されたその中にトレンドラインからの絶対垂直距離を示す。画像はリファレンス12から適応。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
REDI-標識クロストリジウムの図4。定量化は、異なる炭素源の成長培養物からタンパク質をphytofermentans。複製グルコース培養物にグルコース培養相対、ヘミセルロース文化、セルロース、培養中のA）のタンパク質発現。二重のレベル内に発現されたタンパク質の画分：グルコース - グルコース（94％）、ヘミセルロース、グルコース（80％）、およびglucosE-セルロース（49％）。B）は 、セルロースの文化に対するグルコースのためのタンパク質発現の変化を折り、高度の文化の複製ペアについて（R 2 = 0.82）に相関している。リファレンス12から適応の画像が。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
安価な標識試薬（試薬はサンプルあたり1ドル未満のコスト）、速い反応速度（〜10分）、副生成物が存在しない場合、高：いくつかのポイントが還元ジメチル化を使用して、ペプチドの安定同位体標識（REDIラベリング）定量的プロテオミクスのための魅力的な方法を作る再現性（ 図3、図4）、安定した反応生成物、任意のプロテアーゼを使用する能力、および標識されたペプチドのイオン化効率が高い。それは、特定のアミノ酸栄養要求性または合成培地上で増殖した株又は細胞系を必要としないためのRediによる化学的標識はまた、代謝標識に有利相対的である。このように、いくつかのRediは、変異株は他の15のうち13およびヒト幹細胞14入手可能な新規な微生物12を含むタンパク質試料のほぼ任意のタイプに適用することができる。
REDIラベルの制限は、OTと比較したサンプルを多重化する低機能ですこのような現在までの8つのサンプルを同時に16を定量化することができるため同重体標識（ 例えば 、のiTRAQまたはTMT）としての彼女の方法。我々はここで説明する方法は2異なって標識サンプルの定量的な比較を可能にする。ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素同位体のさらなる組み合わせは、少なくとも4 Daの17だけ異なるとのRedi標識は、最近5多重化された試料18に拡張されたラベル3まで生産するために使用することができる。 REDI標識のもう1つの課題は、逆相クロマトグラフィーを使用するときに、重水素化ペプチドが光ものの前にわずかに溶出することである。この「重水素効果」を制御するために、ペプチドの定量化ではなく常に1スキャンからの強度の全体抽出イオンクロマトグラム（MS1ピーク面積）に基づいている必要があります。
ここで説明REDIプロテオミクスプロトコルが削減ジメチルラベルの最初の記述以降に行われた多くの改良11,15,17が含まれてい質量分析のための5のペプチド。私たちは、 "オンカラム「ラベル高いペプチド量と標識効率は、サンプル混合する前に確認することができますようにする方法が、「溶液中」と「オンライン」の標識方法だけでなく、19の存在を説明した。プロテオームの定量化に加えて、標識のRediアイソフォーム判定20に適用されていて、例えばリン酸化、アセチル化21 11,18、および22、グリコシル化などの翻訳後修飾を分析するための他の方法と組み合わせることができる。ため、その汎用性と安価な、定量的化学的性質、REDIラベルは、ますます新しいエキサイティングな方法で定量的プロテオミクスに適用されます。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益や関心のある他の衝突を宣言していません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| Cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| Deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| Sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
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