Summary
Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l'analisi di miscele proteiche che utilizzano l'approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.
Abstract
Etichettatura isotopi stabili di peptidi di dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un metodo per quantificare con precisione le differenze di espressione proteica tra campioni utilizzando la spettrometria di massa. Etichettatura Redi viene eseguita utilizzando sia regolare (luce) o deuterati (pesanti) forme di formaldeide e sodio cianoboroidruro di aggiungere due gruppi metilici ad ogni ammina libera. Qui mostriamo un protocollo robusto per l'etichettatura Redi e comparazione quantitativa di miscele di proteine complesse. Campioni di proteine di confronto vengono digeriti in peptidi, etichettati a portare luce o tag metilici pesanti, mescolato, e co-analizzati mediante LC-MS/MS. Abbondanze relative di proteina sono quantificate confrontando le aree di picco di ioni cromatogramma delle versioni etichettate pesanti e leggeri del peptide costituente estratto dalla piena MS spettri. Il metodo qui descritto comprende la preparazione del campione mediante estrazione in fase solida in fase inversa, etichettatura Redi on-column di peptidi, peptide frazionamento da pH rev basefase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip depurazione peptide. Discutiamo vantaggi ei limiti di etichettatura Redi rispetto ad altri metodi per isotopi stabili incorporazione. Evidenziamo nuove applicazioni utilizzando etichettatura Redi come un metodo rapido, economico e preciso per confrontare le abbondanze di proteine in quasi ogni tipo di campione.
Introduction
Misurare differenze di concentrazione di molte proteine tra i campioni complessi è una sfida centrale in proteomica. Sempre più spesso, questo viene fatto etichettando le proteine in ogni campione con diversi tag isotopiche, mescolando i campioni, e l'utilizzo di spettrometria di massa per quantificare le differenze di concentrazione. Esistono diversi metodi per l'etichettatura isotopica stabile di proteine e peptidi. 15 N etichettatura 1 e 2 SILAC introdurre etichette isotopiche metabolicamente in vivo, che iCAT 3, iTRAQ 4, e la riduzione dimethylation 5 aggiungere tag isotopi stabili dopo l'estrazione delle proteine e la digestione. Tra questi metodi, dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) sta guadagnando popolarità come un poco costoso, metodo riproducibile per quantificare le differenze di concentrazione di proteine in quasi ogni tipo di campione.
Etichettatura REDI comporta peptidi che reagiscono con formaldeide per formare una base di Schiff, che viene poi ridottoda cianoboroidruro. Questa reazione dimethylates gruppi amminici liberi su N-Termini e laterali lisina catene e monomethylates proline N-terminale. Il protocollo qui descritto metila peptidi nel campione 1 con un'etichetta "luce" utilizzando reagenti con atomi di idrogeno nella loro distribuzione isotopica naturale e campione 2 con un'etichetta "pesante" utilizzando formaldeide deuterato e cianoboroidruro (Figura 1). Ogni gruppo amminico dimetilato su un peptide provoca una differenza di massa di 6,0377 Da tra luce e forme pesanti, che viene impiegata per distinguere tra i due moduli utilizzando uno spettrometro di massa. In particolare, abbondanze peptide relativi vengono quantificati come rapporto delle aree cromatogramma ionico MS1 estratti (MS1 rapporto dell'area di picco) di luce e versione pesante per ogni coppia peptide ione. L'abbondanza relativa di una proteina è calcolato come rapporto mediano area del picco MS1 tra tutti i peptidi della proteina. In questo rapporto, descriviamo un protocollo robusto per comportamentozione esperimenti di marcatura Redi da LC-MS/MS che include peptide estrazione a fase inversa in fase solida, etichettatura on-column Redi, peptide frazionamento da pH basico fase (BPRP) cromatografia inversa, e la purificazione di miscele di peptidi utilizzando StageTips (Figura 2) . Discutiamo vantaggi ei limiti di utilizzo etichettatura redi per proteomica quantitativa.
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Protocol
NOTA: Questo metodo è stato descritto in precedenza 12.
1. Proteina Isolamento
Preparare 1 mg di proteina cellulare da parte delle cellule di lisi, preferibilmente con metodi fisici come stampa francese, perlina percosse, o ultrasuoni. Evitare di lisozima-lisi cellulare mediata perché l'enzima si confondono misure di spettrometria di massa.
2. TCA precipitazione delle proteine
Aggiungere acido tricloroacetico 1 volume (TCA) a 4 volumi di proteine e freddo in ghiaccio per 10 minuti per precipitare le proteine. Centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml di acetone ghiacciato e centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e invertire il tubo sul banco per asciugare il pellet per 15 min. Pellets proteine Conservare a -80 ° C.
3. Denaturare le proteine e ridurre disolfuro Obbligazioni
Resospendere proteine a ~ 2 mg / ml in 500 microlitri tampone di denaturazione e riduzione (o 4 M urea o 3% SDS in 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Facoltativamente, includere un inibitore della proteasi nel buffer. Incubare proteine per 30 min a 56 ° C, seguita da 10 minuti a temperatura ambiente.
4. Aklylate gratis solfidrile Gruppi di interrompere Irreversibilmente legame disolfuro Formazione
Preparare fresco 0.3 M iodoacetamide in acqua. ATTENZIONE! Iodoacetamide è altamente tossico. Aggiungere 25 microlitri 0,3 M iodoacetamide (15 mm concentrazione finale) a 500 microlitri di proteine e incubare per 20 minuti al buio a temperatura ambiente. Placare iodoacetamide con l'aggiunta di 10 ml di 300 mM DTT (5 mM concentrazione finale DTT). Conservare le proteine alchilati a -80 ° C.
5. Digestione delle proteine
TCA precipitare le proteine (come descritto al punto 2) e risospendere in 1 ml di HEPES 50 mM (pH 8.2), 1 M urea. Preparare una soluzione stock di Lysyl endoproteinase (Lys-C) in acqua ad una concentrazione di 2 mg / mL e aggiungere 5 ml della soluzione proteica. Incubare la miscela per 16 ore a temperatura ambiente. Garantire la concentrazione finale Lys-C è 10 ng / ml e il rapporto proteina-to-lysC (w / w) è 1/50 a 1/200. Risospendere 20 mcg sequenziamento grado tripsina in 40 ml di 50 mM di acido acetico, aggiungere 5 ml (10 mg tripsina) alla Lys-C digest, e incubare per 6 ore a 37 ° C. Utilizzare la stessa concentrazione proteasi e rapporti proteasi-to-proteina per Lys-C come usato per la tripsina.
6. Fase inversa Peptide Estrazione
- Acidificare peptidi aggiungendo acido trifluoroacetico (TFA) a una concentrazione finale di 0,5% (pH ≈ 2). Attaccare una colonna C18 a un collettore di aspirazione. Usare la massima portata possibile per tutti i passaggi tranne carico e eluizione dei peptidi.
- Colonna bagnato con 6 ml di acetonitrile (ACN). Lavare colonna con 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA, poi equilibrare con 6 ml 0,1% TFA. Non permettere che lacolonna di funzionare a secco tra i passaggi.
- Arrestare pressione di vuoto e carica 500 pg di peptidi sulla colonna ad una velocità di flusso di circa 1 ml / min. Una volta peptidi hanno legato alla colonna, riavvio vuoto e lavare con 6 ml 0,1% TFA, poi con 3 ml di tampone di acido citrico (0,09 M di acido citrico, 0.23 M Na 2 HPO 4, pH 5.5).
Nota: gli importi più elevati di peptide possono essere etichettati ma la colonna C18 capacità di legame dovrebbero essere almeno due volte più elevate rispetto alla quantità peptide per evitare la perdita del campione.
7. On-colonna Peptide Labeling da riduttiva dimethylation (Redi Labeling)
Eseguire questo passaggio sotto una cappa chimica cianuro di idrogeno viene rilasciato in bassa concentrazione durante il processo di etichettatura.
- Preparare 12 ml di "leggere" e "pesanti" buffer Redi a metilare ammine peptide gratuiti. Tampone Redi Luce si compone di 0,8% di formaldeide e 0,12 M sodiocianoboroidruro trasportano idrogeno in thEIR distribuzioni isotopiche naturali in tampone acido citrico. Tampone REDI pesante consiste di 0,8% di formaldeide deuterato e 0,12 M sodiocianoboroidruro deuterato in tampone acido citrico.
- Incubare colonna contenente peptidi aggiungendo 10 ml luce o tampone Redi pesante alle colonne contenenti peptidi a portata di 1 ml / min e ripetere garantire un'etichettatura completa. Lavare colonna con 6 ml 0,1% TFA e poi con 1 ml di 0,5% acido acetico.
- Arrestare vuoto ed eluire prima peptidi marcati con 1 ml di 40% ACN, 0,5% di acido acetico, poi con 1 ml di 80% ACN, 0,5% di acido acetico utilizzando una portata di circa 0,5 ml / min. Se lo si desidera, misurare l'efficienza etichettatura dei singoli campioni mediante spettrometria di massa prima della miscelazione campioni pesanti e leggeri (vedi "Rappresentante dei risultati"). Mescolare 01:01 campioni peptide pesanti e leggeri etichettati per essere quantificata mediante spettrometria di massa.
8. Peptide separato miscela in base pH fase reversibile (BPRP) Cromatografia </ P>
PH basico fase inversa (BPRP) cromatografia per separare la miscela di peptidi in più frazioni, che vengono analizzati in modo indipendente da LC-MS/MS per aumentare la copertura proteoma.
- Frazionare la miscela peptidica su una colonna C18-HPLC applicando un gradiente di concentrazione crescente ACN in 10 mM di bicarbonato di ammonio (pH 8). Iniziare con 5% (v / v) ACN per 5 min, aumentare al 35% ACN, in 60 minuti, e poi al 90% ACN in 1 min. Conservare il ACN 90% per 4 minuti prima di ridurre l'ACN al 5% di riequilibrare la colonna per 9 min. Raccogliere 96 frazioni di pari volume in una piastra a 96 pozzetti (da A1 a H12). Monitorare il frazionamento utilizzando un rivelatore UV a 220 nm, mentre i peptidi sono eluizione largo della colonna (10-70 min per le condizioni qui descritte).
- Combina frazioni da pozzi A1, C1, E1 e G1 (frazione A1), da pozzi B1, D1, F1, e H1 (frazione B1), da pozzi A2, C2, E2, e G2 (frazione A2) e di conseguenza per l' restanti frazioni. Rimuovere il solvent utilizzando una centrifuga a vuoto. Peptidi Risospendere da frazioni A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 e B12 in 130 ml di 1 M urea/0.5% TFA e purificare usando StageTips come descritto al punto 9. Negozio frazioni B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 e A12 a -20 ° C.
9. Purify peptidi da Stop and Go estrazione (StageTips)
Preparare C18-StageTip 7 microcolonne da imballaggio 200 ml punte per pipette con due C18 dischi con un diametro interno (ID) di 1,07 mm. Mettere Fase Consigli in tubi Eppendorf. Utilizzare una microcentrifuga per lavare punte con 130 ml di metanolo, quindi 130 ul 80% ACN, 0,5% di acido acetico. Equilibrare StageTips con 130 microlitri 0,1% TFA. Trasferire la miscela di peptidi a StageTips e lavare con 130 microlitri 0,1% TFA, quindi 40 microlitri 0,1% TFA, quindi 40 microlitri 0,5% di acido acetico. Eluire peptidi prima con il 20 microlitri 40% ACN, 0,5% di acido acetico, poi 20 l 80% ACN, 0,5% di acido acetico. Combina eluati unnd secco mediante filtrazione sotto vuoto.
10. Microcapillare LC-MS/MS
- Sciogliere peptidi in 1-5 ml di acido formico al 5%, 5% ACN ad una concentrazione di circa 1 mg / mL. Risolvere ~ 1 mg peptidi su un 100 pm × 20 cm C18-invertiti colonna HPLC in fase con gradiente 6-22% in ACN 0,125% acido formico ripartiti lungo 75 o 100 minuti ad una portata di ~ 300 Nl / min.
- Identificare i peptidi utilizzando un LTQ Orbitrap Velos 12 o simile piattaforma liquido cromatografia-spettrometria di massa con uno spettrometro di massa che preveda ad alta risoluzione ed elevata accuratezza di massa. Azionare lo spettrometro di massa in modalità dati-dipendente con un full MS scansione (risoluzione di 60.000), acquisita nel analizzatore Orbitrap. Generare trappola ionica lineare MS / MS spettri per i 20 ioni più abbondanti rilevati nello spettro completo di MS. Impostare il controllo automatico del guadagno (AGC) target a 1 x 10 6 per la piena SM e 2000 per MS / MS. Impostare tempi massimi di accumulo di ioni a 1.000 msecper la SM e 150 msec per MS / MS. Escludi frammentate ioni peptide precursore di un'ulteriore selezione da MS / MS per 20-60 sec.
11. MS / MS Acquisizione Dati
Identificare peptidi confrontando file RAW spettri MS / MS ad un database teorico con un algoritmo come SEQUEST 8 utilizzando questi parametri (Tabella 1).
Tabella 1. Peptide ricerca database dei parametri.
| Parametri generali | digestione completamente trittico con un massimo di 2 perdere fratture |
| 25 ppm tolleranza ione precursore | |
| 1.0 Da tolleranza agli ioni frammento | |
| Modifiche statici | 57,02146 Da sulla cisteina, carboxyamidomethylation |
| 28,03130 Da sulla lisina e il peptide N-terminale, etichetta dimethylation luce | |
| Modifiche dinamici | Da 15,99,491 mila su metionina, ossidazione |
| 6,03766 Da sulla lisina e il peptide N-terminale, etichetta dimethylation pesante |
- Filtra peptidi ad aliquote scoperta falso 1% con un metodo quale il 9 strategia target-richiamo utilizzando un database di open reading frames negli orientamenti attuali e invertiti.
12. Peptide Quantificazione
Calcolare le aree di coppie pesanti e leggeri di MS1 estratti ioni cromatogrammi (aree di picco MS1) e peptide segnale-rumore (S / N) Formati 10. Includi coppie peptide solo quando il loro segnale medio-to-noirapporto se è superiore a cinque. Quantificare abbondanza relativa di un peptide nei due campioni come il rapporto delle aree dei picchi MS1 di versioni pesanti e leggere dello stesso peptide (MS1 rapporto dell'area di picco). Calcola abbondanze proteici relativamente come mediana rapporto area del picco MS1 per tutti i peptidi della proteina.
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Representative Results
Abbiamo valutato l'accuratezza, la precisione e riproducibilità di etichettatura Redi utilizzando Saccharomyces cerevisiae e Clostridium phytofermentans lisati cellulari interi. In primo luogo abbiamo quantificato l'efficienza etichettatura Redi di un mix di C. phytofermentans lisati proteici da cellulosa (pesante etichetta, H) e glucosio (etichetta luce, L) culture. Quando filtrato per un peptide tasso di scoperta di falsi 1%, questo campione conteneva 11.194 sequenze peptidiche unici con una efficienza di etichettatura Redi 98%. Non frazionata S. cerevisiae proteina lisato è stato allo stesso modo marcato con H o L reagenti, mescolato a vari rapporti, e analizzato. Differenze di espressione proteica (log 2 (zone mediane di picco MS1)) riproducibile riflettere i rapporti alla quale i campioni H e L sono stati mescolati in una vasta gamma di rapporti di miscelazione (Figura 3). In particolare, la piega-variazione del 99% delle proteine sono stati misurati come più piccole di 1,6 volte per 1:1 campioni misti. In1:10 a 10:1 campioni, il 99% di proteine erano entro 3,8 volte il rapporto previsto, con un incremento della deviazione standard a maggiore distanza da una miscela 1:1. Quando l'etichettatura Redi è stato applicato al Clostridium phytofermentans proteoma, abbiamo quantificato oltre 2000 proteine con il 94% di proteine misurati entro livelli di 2 volte per le colture replicate cresce su glucosio (Figura 4A). Proteine piega modifiche per coppie duplicati delle culture (glucosio rispetto di cellulosa) sono stati anche altamente correlati (r 2 = 0.82), (Figura 4B). S. confronti cerevisiae (Figura 3) sono da una singola cultura, e quindi mostrano riproducibilità tecnica della proteomica quantitativa basati Redi. C. phytofermentans misure (Figure 4A, B) confronta replicare culture così differenze di espressione rappresentano sia errori di misurazione e variabilità biologica tra le culture. Insieme, queste esperienzementi sostengono che il Redi proteomica è un metodo accurato e riproducibile per quantificare le differenze di espressione proteica tra campioni complessi.
Figura 1. Dimethylation riduttiva di peptidi che utilizzano reagenti pesanti e leggere di dimethylate ammine libere. Lo stesso peptide marcato con pesanti contro i reagenti luce ha un Da spostamento di massa 6,0377 per ammina libera. Il peptide mostrato qui è etichettato sia al N-terminale e una catena laterale di lisina. Immagine adattato da riferimento 11. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Panoramica di protocollo per la proteomica quantitativa per dimethylation riduttivo. Numeri rossi sopra le frecce corrispondono alle fasi descritte nel protocollo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Valutazione della etichettatura Redi utilizzando Saccharomyces cerevisiae lisati cellulari intere. I campioni di una sola cultura sono stati etichettati con uno pesante (H) e la luce (L) reagenti, mescolati a diversi rapporti (1H: 10L, 1H: 5L, 1H: 2L, 1H: 1L, 2H: 1L, 5H: 1L, e 10H: 1L), e le differenze tra i campioni di proteine H e L sono stati quantificati come rapporti di log 2 mediana MS1 zona di picco (log 2 rapporto H / L). Il valore R 2 di una linea di tendenza lineare attraverso tutti i datipunti era 0.96 (linea nera); la correlazione di Pearson è stato 0,98. Limiti di confidenza (linee rosse) mostrano la distanza perpendicolare assoluta dalla linea di tendenza entro il quale il 95% dei punti dati sono stati trovati per ciascun campione. Immagine adattato da riferimento 12. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Quantificazione dei Redi-marcato Clostridium phytofermentans proteine da colture che crescono di fonti di carbonio diverse. A) L'espressione proteica in una cultura glucosio rispetto ad una cultura replicare glucosio, una cultura emicellulosa, e una cultura cellulosa. La frazione di proteine espresse entro i livelli duplici: glucosio-glucosio (94%), glucosio-emicellulosa (80%), e glucose-cellulosa (49%). B) Piegare cambiamenti nell'espressione di proteine per il glucosio contro culture cellulosa sono altamente correlati (r 2 = 0,82) per coppie duplicate di culture. Immagini adattato da riferimento 12. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Numerosi punti fanno etichettatura isotopo stabile di peptidi utilizzando un metodo interessante per la proteomica quantitativa dimethylation riduttiva (etichettatura Redi): reagenti poco costosi di etichettatura (reagenti costano meno di $ 1 per esempio), velocità di reazione rapida (~ 10 min), assenza di prodotti collaterali, alte riproducibilità (figure 3, 4), prodotti di reazione stabili, capacità di utilizzare qualsiasi proteasi e ad alta efficienza di ionizzazione dei peptidi marcati. Etichettatura chimica mediante Redi è anche vantaggioso rispetto alla marcatura metabolica poiché non richiede ceppi o linee cellulari con specifiche auxotrophies aminoacidi o di crescita su un mezzo sintetico. Come tale, Redi può essere applicato a quasi ogni tipo di campione proteico compreso nuovi microbi 12 per cui alcuni ceppi mutanti sono disponibili 13 e cellule staminali umane 14, tra gli altri 15.
Una limitazione di etichettatura Redi è una minore capacità di multiplex campioni relativi a oti suoi metodi come l'etichettatura isobarica (ad esempio, iTRAQ o TMT), per la quale attualmente fino a 8 campioni possono essere contemporaneamente quantificate 16. Il metodo che descriviamo qui permette il confronto quantitativo dei due campioni differenzialmente etichettati. Ulteriori combinazioni isotopiche di formaldeide e cianoboroidruro possono essere utilizzati per produrre fino a 3 etichette che differiscono da almeno 4 Da 17 ed etichettatura Redi è stato recentemente esteso a 5 campioni multiplexing 18. Un'altra sfida di etichettatura Redi è che i peptidi deuterati eluiscano poco prima quelli leggeri quando si utilizza la cromatografia in fase inversa. Per controllare questa "effetto deuterio", peptide quantificazione deve sempre essere basata sull'intero cromatogramma ionico estratto (area del picco MS1) invece di intensità da una scansione.
Il protocollo proteomica Redi qui descritto include numerosi miglioramenti 11,15,17 apportate dopo la prima descrizione di etichettatura dimetil riduzionedi peptidi per spettrometria di massa 5. Abbiamo descritto un metodo "a colonna" etichettatura per permettere importi più elevati di peptide e l'efficienza di etichettatura possono essere verificate prima del campione di miscelazione, ma "in soluzione" e ai metodi di etichettatura "online" esistono pure 19. Oltre a proteoma quantificazione, etichettatura Redi viene applicato per la determinazione isoforma 20 e può essere combinato con altri metodi per analizzare modificazioni post-traduzionali come fosforilazione 11,18 acetilazione 21, 22 e glicosilazione. Grazie alla sua versatilità e poco costoso, chimica quantitativa, l'etichettatura Redi verrà applicata sempre alla proteomica quantitativa in modi nuovi ed entusiasmanti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| Cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| Deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| Sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
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