Summary
Stabile isotoper merking av peptider ved reduktiv dimethylation (Redi merking) er en rask, billig strategi for nøyaktige massespektrometri-basert kvantitative proteomikk. Her vi viser en robust fremgangsmåte for fremstilling og analyse av proteinblandinger ved hjelp av REDI tilnærming som kan brukes på nesten hvilken som helst prøvetype.
Abstract
Stabile isotoper merking av peptider ved reduktiv dimethylation (Redi merking) er en metode for å nøyaktig kvantifisere protein expression forskjeller mellom prøver ved hjelp av massespektrometri. Redi merkingen utføres ved hjelp av enten vanlig (lett) eller deuterert (tung) former av formaldehyd og natrium-cyanoborhydrid for å legge til to metylgrupper på hver frie amin. Her viser vi en robust protokoll for Redi merking og kvantitativ sammenligning av komplekse proteinblandinger. Protein prøver for sammenligning er fordøyd i peptider, merket å bære enten lys eller tunge metyl-koder, blandet, og co-analysert ved LC-MS/MS. Relative protein Forekomsten blir kvantifisert ved å sammenligne ion kromatogram topparealene for tunge og lette merkede versjoner av de bærende peptidet ekstrahert fra den fullstendige MS-spektra. Fremgangsmåten beskrevet her omfatter prøvepreparering ved reversfase fastfase-ekstraksjon, på en kolonne REDI merking av peptider, peptid fraksjonering ved basisk pH omdrersed-fase (BPRP) kromatografi og StageTip peptid rensing. Vi diskuterer fordeler og begrensninger av Redi merking med hensyn til andre metoder for stabile isotoper innlemmelse. Vi trekker frem nye applikasjoner ved hjelp av Redi merking som en rask, billig, og nøyaktig metode for å sammenligne protein i hopetall i nesten hvilken som helst type prøve.
Introduction
Måling konsentrasjonsforskjeller av mange proteiner mellom komplekse prøver er en sentral utfordring i proteomikk. I økende grad dette blir gjort ved merking av proteiner i hver prøve med forskjellige isotoper koder, som kombinerer prøvene, og ved hjelp av massespektrometri til kvantifisere konsentrasjonsforskjeller. Det finnes flere metoder for stabil isotoper merking av proteiner og peptider. 15 N merking ett og SILAC 2 introdusere isotopmarkører metabolsk in vivo, mens ICAT 3, iTRAQ 4, og reduksjon dimethylation fem legge stabile isotopen koder etter protein utvinning og fordøyelse. Blant disse fremgangsmåter, er reduktiv dimethylation (REDI merking) økende popularitet som en billig, reproduserbar metode for å kvantifisere protein konsentrasjonsforskjeller i nesten hvilken som helst type prøve.
Redi merking involverer reagering peptider med formaldehyd for å danne en Schiff-base, som deretter reduseresetter cyanoborhydrid. Denne reaksjonen dimethylates frie amino-grupper på N-termini og lysin sidekjeder og monomethylates N-terminale prolinene. Protokollen er beskrevet her methylates peptider i prøven 1 med en «lett» etiketten med reagenser med hydrogenatomer i deres naturlige isotoper fordeling og prøven 2 med en "tung" label med deuterert formaldehyd og natriumcyanoborhydrid (figur 1). Hver dimethylated aminogruppe på et peptid resulterer i en masseforskjell på 6,0377 Da mellom lette og tunge former, som er anvendt for å skille mellom de to former ved hjelp av et massespektrometer. Nærmere bestemt, er relative peptid Forekomsten kvantifisert som forholdstallet for MS1 ekstrahert ion kromatogram områder (MS1 toppareal-forhold) av lette og tunge versjon for hvert peptid ionepar. Den relative mengde av et protein som er beregnet som median MS1 toppareal-forhold blant alle peptider i proteinet. I denne rapporten beskriver vi en robust protokoll for oppførseling Redi merkingseksperimenter ved LC-MS/MS som omfatter reversert-fase-peptid-faststoff-fase-ekstraksjon, på en kolonne REDI merking, peptid fraksjonering ved basisk pH reversert fase (BPRP) kromatografi og rensing av peptid-blandinger ved hjelp av StageTips (Figur 2) . Vi diskuterer fordeler og begrensninger ved bruk av Redi merking for kvantitative proteomikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Denne metoden ble tidligere beskrevet 12.
En. Protein Isolation
Forbered 1 mg celleprotein ved lyseres cellene, fortrinnsvis ved fysiske metoder slik som fransk presse, perle vibrerende eller sonikering. Unngå lysozym-mediert cellelyse fordi enzymet vil forvirre massespektrometri målinger.
2. TCA Nedbør av Proteiner
Tilsett 1 volum trikloreddiksyre (TCA) til 4 volumer protein og chill på is i 10 minutter for å utfelle proteiner. Sentrifuger ved 12000 x g i 5 min ved 4 ° C og fjern supernatanten. Resuspender pellet i 1 ml iskald aceton og sentrifuger ved 12 000 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og snu røret på benken for å tørke pellet i 15 min. Butikk protein pellets ved -80 ° C.
Tre. Denature Proteiner og redusere disulfidbindinger
Resuspen proteiner til ~ 2 mg / ml i 500 pl denaturering og reduksjon buffer (enten 4 M urea og 3% SDS i 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Eventuelt inkluderer en protease inhibitor i bufferen. Inkuber proteiner i 30 min ved 56 ° C, etterfulgt av 10 min ved romtemperatur.
4. Aklylate Gratis sulfhydrylgrupper å irreversibelt Disrupt Disulfide Bond Dannelse
Forbered frisk 0,3 M iodoacetamide i vann. FORSIKTIG! Iodoacetamide er svært giftig. Tilsett 25 ul 0,3 M jodacetamid (15 mM sluttkonsentrasjon) 500 pl protein og inkuberes i 20 minutter i mørke ved romtemperatur. Slukke jodacetamid ved tilsetning av 10 ul av 300 mM DTT (5 mM DTT sluttkonsentrasjon). Oppbevar alkylerte proteiner ved -80 ° C.
5. Protein Fordøyelse
TCA utfelle proteiner (som beskrevet i trinn 2) og resuspender i 1 ml 50 mM HEPES (pH 8,2), 1 M urea. Forbered en stamløsning av lysyl endoproteinase (Lys-C) i vann ved en konsentrasjon på 2 pg / mL og tilsett 5 mL til proteinoppløsningen. Inkuber blandingen i 16 timer ved romtemperatur. Sikre den endelige Lys-C-konsentrasjonen er 10 ng / mL, og proteinet til LysC forholdet (vekt / vekt) er 1/50 til 1/200 personer. Resuspender 20 pg sekvense grade trypsin i 40 pl av 50 mM eddiksyre, tilsett 5 pl (10 pg trypsin) til Lys-C digest, og inkuberes i 6 timer ved 37 ° C. Bruk samme protease konsentrasjon og protease-til-protein forholdstall for Lys-C som anvendes for trypsin.
6.. Reversert-fase Peptide Extraction
- Surgjøre peptider ved tilsetning av trifluoreddiksyre (TFA) til en sluttkonsentrasjon på 0,5% (pH ≈ 2). Fest en C18 kolonne til en utvinning manifold. Bruk høyest mulig strømningshastighet for alle trinn bortsett fra lasting og eluering av peptidene.
- Våt kolonne med 6 ml acetonitril (ACN). Vask kolonnen med 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA, og deretter stabilisere seg med 6 ml 0,1% TFA. Ikke la denkolonne for å kjøre tørr mellom trinnene.
- Stopp vakuumtrykket og laste 500 ug av peptider på kolonnen ved en strømningshastighet på omtrent 1 ml / min. Når peptider er bundet til kolonnen, restart vakuum til og vask med 6 ml 0,1% TFA, og deretter med 3 ml sitronsyrebuffer (0,09 M sitronsyre, 0,23 M Na HPO 2 til 4, pH 5,5).
Merk: Høyere mengder peptid kan merkes, men den C18-kolonne bindingskapasitet bør være minst to ganger høyere enn den mengde peptid for å unngå tap av prøven.
7. On-kolonne Peptide Merking av Reduktiv Dimethylation (Redi Merking)
Utfør dette trinnet under en kjemisk hette som hydrogencyanid er utgitt i lav konsentrasjon under merkeprosessen.
- Forbered 12 ml av "lette" og "tunge" Redi buffere til methylate peptid frie aminer. Lett Redi buffer består av 0,8% formaldehyd og 0,12 M natriumcyanoborhydrid frakte hydrogen i thEir naturlige isotoper utdelinger i sitronsyre buffer. Heavy Redi buffer består av 0,8% deutererte formaldehyd og 0,12 M deutererte natriumcyanborhydrid i sitronsyrebuffer.
- Inkuber kolonne inneholdende peptider ved tilsetning av 10 ml enten lette eller tunge REDI buffer til de peptid-inneholdende kolonne ved strømningshastighet på 1 ml / min, og gjenta for å sikre fullstendig merking. Vask kolonnen med 6 ml 0,1% TFA og deretter med 1 ml 0,5% eddiksyreløsning.
- Stopp vakuum og eluere merkede peptider først med 1 ml 40% ACN, 0,5% eddiksyre, deretter med 1 ml 80% ACN, 0,5% eddiksyre ved hjelp av en strømningshastighet på omtrent 0,5 ml / min. Dersom det er ønskelig, måles merking effektiviteten av individuelle prøver ved massespektrometri før blanding av tunge og lette prøver (se "Representative resultater"). Bland 01:01 tunge og lette-merkede peptid-prøver som skal kvantifiseres ved massespektrometri.
8. Separat Peptide Blanding av Basic pH reversert fase (BPRP) Kromatografi </ P>
Basis pH reversfase (BPRP) kromatografi for å separere peptidet blandingen i flere fraksjoner, som er uavhengig av hverandre analysert ved LC-MS/MS å øke proteom dekning.
- Fraksjonerer peptidet blandingen på en C18-HPLC-kolonne ved anvendelse av en gradient med økende ACN-konsentrasjon på 10 mM ammonium-bikarbonat (pH 8). Begynn med 5% (v / v) ACN i 5 min, øker med 35% ACN i 60 min, og deretter til 90% ACN i 1 min. Ta vare på 90% ACN i 4 minutter før reduksjon av ACN til 5% for å re-ekvilibrering av kolonnen for 9 min. Samle 96 fraksjoner av likt volum i en 96-brønns plate (A1 til H12). Overvåk fraksjonering ved hjelp av en UV-detektor ved 220 nm, mens peptider er eluert fra kolonnen (10 til 70 minutter for de forhold som er beskrevet her).
- Kombiner fraksjoner fra brønner A1, C1, E1, og G1 (brøkdel A1), fra brønner B1, D1, F1, og H1 (brøkdel B1), fra brønner A2, C2, E2, og G2 (brøkdel A2) og tilsvarende for den øvrige fraksjoner. Fjern solvent ved hjelp av en vakuum-sentrifuge. Suspender peptider fra fraksjoner A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 og B12 i 130 mL av en M urea/0.5% TFA og rense hjelp StageTips som beskrevet i trinn 9. Butikk fraksjoner B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, og A12 ved -20 º C.
9. Purify Peptider av Stop and Go Extraction (StageTips)
Forbered C18-StageTip 7 microcolumns ved pakking 200 mL pipettespisser med to C18 disker med en indre diameter (ID) på 1,07 mm. Sett Stage Tips til Eppendorf-rør. Bruk en mikrosentrifuge for å vaske tips med 130 ul metanol, og deretter 130 ul 80% ACN, 0,5% eddiksyre. Stabil StageTips med 130 mL 0,1% TFA. Overfør peptidblandingen til StageTips og vask med 130 pl 0,1% TFA, og deretter 40 pl 0,1% TFA, og deretter 40 pl 0,5% eddiksyre. Eluer peptider først med 20 ul 40% ACN, 0,5% eddiksyre, deretter 20 ul 80% ACN, 0,5% eddiksyre. Kombiner Eluatene ennd tørr ved vakuumfiltrering.
10. Microcapillary LC-MS/MS
- Oppløs peptider i 1-5 mL 5% maursyre, 5% ACN i en konsentrasjon på omtrent 1 pg / pl. Løse ~ 1 ug peptider på et 100 pm x 20 cm C18-reversert fase HPLC-kolonne med en gradient av 6-22% ACN i 0,125% maursyre påføres over 75 eller 100 minutter ved en strømningshastighet på ~ 300 nl / min.
- Identifiser peptider ved hjelp av en LTQ Orbitrap Velos 12 eller tilsvarende væske-kromatografi-massespektrometri plattform med et massespektrometer som gir høy oppløsning og høy massenøyaktighet. Betjene massespektrometer i data-avhengige modus med en full MS scan (oppløsning på 60 000) kjøpte i Orbitrap analysator. Generere lineær ion felle MS / MS spektra for de 20 mest tallrike ioner påvist i hele MS spekteret. Sette automatisk nivåkontroll (AGC) mål til 1 x 10 6 for hele MS og 2000 for MS / MS. Fastsatt maksimums ion akkumulering ganger til 1000 msekfor MS og 150 msek for MS / MS. Ekskluder fragmenterte peptid forløper ioner fra ytterligere utvalg fra MS / MS for 20-60 sek.
11. MS / MS Data Acquisition
Identifiser peptider ved å sammenligne MS / MS spektra RAW-filer til en teoretisk database med en algoritme som SEQUEST 8 ved hjelp av disse parametrene (tabell 1).
Tabell 1. Peptide Database søkeparametere.
| Generelle parametere | fullt tryptisk fordøyelse med opptil to savnet cleavages |
| 25 ppm forløper ion toleranse | |
| 1,0 Da fragment ion toleranse | |
| Statiske Modifikasjoner | 57,02146 Da på cystein, carboxyamidomethylation |
| 28,03130 Da på lysin og peptid N-terminale, lys dimethylation etiketten | |
| Dynamiske Modifikasjoner | 15,99491 Da på metionin, oksidasjon |
| 6,03766 Da på lysin og peptid N-terminale, tung dimethylation etiketten |
- Filter peptider til en 1% falske positive rate med en fremgangsmåte slik som den target-lokke 9 strategi ved hjelp av en database over åpne leserammer i de faktiske og reversert orientering.
12. Peptide Kvantifisering
Beregn områder av tunge og lette par av MS1 ekstrahert ion kromatogrammer (MS1 toppområder) og peptid signal-til-støy (S / N) forhold 10. Inkluder peptid parene bare når deres gjennomsnittlige signal-til-noiSE andelen overstiger fem. Tall relative overflod av et peptid i de to prøver som forholdet mellom MS1 topparealene for tunge og lette versjoner av det samme peptid (MS1 toppareal-forhold). Beregn relative protein Forekomsten som median MS1 toppareal-forhold for alle peptider i proteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi evaluerte nøyaktighet, presisjon og reproduserbarhet av Redi merking ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae og Clostridium phytofermentans hele cellelysater. Vi først kvantifisert Redi merking effektiviteten av en blanding av C. phytofermentans proteinlysatene fra cellulose (heavy merket, H) og glukose (lys etiketten, L) kulturer. Når filtrert til en 1% peptid falsk funnrate, denne prøven inneholdt 11 194 unike peptidsekvenser med en 98% Redi merking effektivitet. Ufraksjonert S. cerevisiae protein lysatet ble merket på lignende måte med H-eller L-reagenser, blandet i forskjellige forhold, og analysert. Protein expression forskjeller (log 2 (median MS1 topparealer)) reproduserbart reflektere forholdet når H-og L-prøver ble blandet i et bredt spekter av blandingsforholdene (figur 3). Nærmere bestemt, ble det fold-bytte av 99% av proteinene målt til å være mindre enn 1,6 ganger de 01:01 blandede prøver. Ipå 01:10 og 10:01 prøver, 99% av proteinene var innenfor 3,8 ganger av den forventede ratio, som viser en økning i standardavvik på større avstand fra en 1:1-blanding. Når Redi merking ble brukt til Clostridium phytofermentans proteomet, vi kvantifisert mer enn 2000 proteiner med 94% proteiner målt innen to-fold nivåer for replikere kulturer vokser på glukose (Figur 4A). Protein fold endringer for like par av kulturer (glukose versus cellulose) ble også sterkt korrelerte (r 2 = 0,82), (figur 4B). S. cerevisiae sammenligninger (figur 3) er fra en enkelt kultur og således viser teknisk reproduserbarheten Redi basert kvantitative proteomforskning. C. phytofermentans målinger (Tall 4A, B) sammenligne replikere kulturer så uttrykks forskjeller representerer både målefeil og biologisk variasjon mellom kulturer. Sammen utgjør disse opplementer støtter at Redi proteomikk er en nøyaktig og reproduserbar metode for å kvantifisere protein expression forskjeller mellom komplekse prøver.
Figur 1. Reduktiv dimethylation av peptider ved hjelp av tunge og lette reagenser til dimethylate frie aminer. Den samme peptid merket med tung versus lette reagenser har en 6,0377 Da masse skift per fri amin. Peptidet er vist her er merket både ved N-terminus og lysin på en sidekjede. Bilde tilpasset fra Reference 11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Oversikt av protokoll for kvantitative proteomikk ved reduktiv dimethylation. Røde tall over pilene tilsvarer trinn som er beskrevet i protokollen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3.. Evaluering av videre merking ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae hele cellelysater. Prøver fra en enkelt kultur ble merket med enten tung (H) og lys (L) reagenser, blandet i forskjellige forhold (1H: 10L, 1H: 5L, 1H: 2L, 1H: 1L, 2t: 1L, 5H: 1L, og 10H: 1L), og protein forskjeller mellom H og L prøver ble kvantifisert som log 2 median MS1 peak området forholdstall (log 2 H / L ratio). R 2 verdien av en lineær trendlinjen gjennom alle opplysningerpoeng var 0,96 (sort linje); Pearsons korrelasjon var 0,98. Tillit grenser (røde linjer) viser den absolutte vinkelrett avstand fra trendlinjen innen hvilke 95% av datapunktene ble funnet for hver prøve. Bilde tilpasset fra Reference 12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kvantifisering av Redi-merket Clostridium phytofermentans proteiner fra kulturer vokser av ulike karbonkilder. A) proteinekspresjon i en glukose kultur i forhold til en gjengivelse glukose kultur, et hemicellulose-kultur, og en cellulose-kultur. Fraksjonen av proteiner uttrykt i To gangers nivåer: glukose-glukose (94%), glukose-hemicellulose (80%), og gluke-cellulose (49%). B) Brett forandringer i protein ekspresjon for glukose versus cellulosekulturer er sterkt korrelert (r 2 = 0,82) etter like par av kulturer. Bilder tilpasset fra Reference 12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere punkter gjør stabile isotoper merking av peptider ved hjelp av reduktiv dimethylation (Redi merking) en attraktiv metode for kvantitative proteomikk: billig merking reagenser (reagenser koster mindre enn $ 1 per prøve), rask reaksjonshastighet (~ 10 min), fravær av sideprodukter, høye reproduserbarhet (figur 3, 4), stabile reaksjonsprodukter, evne til å bruke noen protease, og høy ionisering effektivitet av merkede peptider. Kjemisk merking av Redi er også fordelaktig i forhold til metabolsk merking, siden det ikke krever stammer eller cellelinjer med bestemte aminosyrer auxotrophies eller vekst på et syntetisk medium. Som sådan kan Redi anvendes på nesten hvilken som helst type protein prøven inkludert nye mikrober 12 hvor noen mutante stammer er tilgjengelige 13 og humane stamceller 14, blant andre 15.
En begrensning av videre merking er en lavere evne til å multiplex prøvene i forhold til othennes metoder som isobaric merking (f.eks iTRAQ eller TMT), som for tiden opp til åtte prøvene kan være samtidig kvantifisert 16. Metoden vi beskriver her gjør at kvantitativ sammenligning av to ulikt merkede prøver. En annen isotop-kombinasjonene av formaldehyd og natriumcyanoborhydrid kan brukes til å produsere opp til 3 etiketter som er forskjellige med minst fire Da 17 og REDI merking er nylig blitt utvidet til 5 multipleksede prøvene 18. En annen utfordring for Redi merking er at deuterierte peptider elueres litt før lette seg når du bruker reversfase kromatografi. For å kontrollere for dette "deuterium-effekten", bør peptidet kvantifisering alltid være basert på hele ekstrahert ion kromatogram (MS1 toppareal) i stedet for intensitetene fra en avsøkning.
Den Redi proteomikk protokollen beskrevet her inkluderer en rekke forbedringer 11,15,17 gjort siden den første beskrivelsen av reduksjon dimethyl merkingav peptider for massespektrometri fem. Vi beskrev en "on-kolonnen" merking metode for å tillate høyere peptid beløp og merking effektivitet kan verifiseres før prøveblanding, men "i løsning" og "online" merking metoder finnes også 19. I tillegg til proteom kvantifisering er Redi merking blir anvendt for bestemmelse isoform 20 og kan kombineres med andre metoder for analyse av post-translasjonelle modifikasjoner som fosforylering 11,18 acetylering 21 og 22 glykosylering. På grunn av sin allsidighet og rimelig, kvantitativ kjemi, vil Redi merking bli stadig mer brukt til kvantitative proteomikk i nye og spennende måter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| Cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| Deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| Sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
