Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Une peau pleine de défauts modèle pour évaluer la vascularisation des biomatériaux doi: 10.3791/51428 Published: August 28, 2014

Summary

La vascularisation est la clé pour les approches en ingénierie tissulaire succès. Par conséquent, des technologies fiables sont nécessaires pour évaluer le développement des réseaux vasculaires dans les tissus-constructions. Nous présentons ici une méthode simple et efficace de visualiser et de quantifier la vascularisation in vivo.

Abstract

Vascularisation insuffisante est considéré comme l'un des facteurs principaux limitant le succès clinique de constructions du génie tissulaire. Afin d'évaluer de nouvelles stratégies visant à améliorer la vascularisation, méthodes fiables sont nécessaires pour rendre le dans la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins dans les échafaudages de bio-artificiel visibles et quantifier les résultats. Au cours des deux dernières années, notre groupe a mis en place un modèle de défaut de peau complet qui permet la visualisation directe des vaisseaux sanguins par transillumination et offre la possibilité de quantification par la segmentation numérique. Dans ce modèle, on crée chirurgicalement défauts complets de la peau dans le dos de souris et les remplace par du matériau testé. Molécules ou cellules d'intérêt peuvent aussi être incorporés dans ces matières à étudier leur effet potentiel. Après un temps d'observation de son choix un, les matériaux sont explantées pour l'évaluation. Blessures bilatéraux prévoient la possibilité de faire des comparaisons internes eà minimiser les artefacts entre les individus ainsi que de diminuer le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. En comparaison à d'autres approches, notre méthode offre une analyse simple, fiable et rentable. Nous avons mis en place ce modèle comme un outil de routine pour effectuer le criblage à haute résolution lors du test de la vascularisation de différents biomatériaux et les approches bio-activation.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dans les dernières décennies, l'ingénierie tissulaire a ouvert une nouvelle option thérapeutique pour remplacer défauts des tissus avec les propres cellules de l'organisme 1. Afin de soutenir le processus physiologique de la régénération des tissus, des échafaudages sont conçus comme une structure biodégradable, qui fournit un scénario où les cellules du lit de la plaie peuvent se développer et de rétablir le défaut 2,3.

Vascularisation insuffisante est considéré comme le principal obstacle qui freine la percée clinique d'échafaudages bioartificiel 4. Avec la croissance de cellules, la demande de nutriments et d'oxygène augmente et la vascularisation de la matière devient indispensable. Vascularisation insuffisante ou tardive peut donc conduire à une nécrose centrale de produits de l'ingénierie tissulaire 5. De plus, les vaisseaux sanguins fournissent des cellules immunocompétentes et enlever les résidus métaboliques dans la zone de régénération. Des taux d'infection élevés et une faible régénération ne sontquelques-unes des conséquences de l'insuffisance perfusion sanguine observés dans l'ingénierie tissulaire, qui visent à être évités par l'augmentation de la vascularisation des échafaudages 6,7.

Plusieurs stratégies visant à améliorer la vascularisation accent sur le rôle clé du biomatériau lui-même et la microstructure de l'échafaud. Il ya des efforts intensifs de recherche pour développer de nouvelles approches en déplaçant le processus de guérison de la réparation de la régénération, de ce fait (re) produire un tissu avec des propriétés physiologiques les plus proches de celui qui doit être restaurées 8,9. Biomatériaux qui ont été étudiés et évalués en ce qui concerne leur potentiel de régénération inclus collagène, fibrine, le chitosane et l'alginate 10,11. Ces biomatériaux peuvent être utilisés et combinés comme une épine dorsale pour la construction de nouveaux échafaudages en utilisant différentes stratégies telles que décellularisation de tissus, auto-assemblage, prototypage rapide et électrofilature 12. Pour ENHment propre capacité de régénération de l'organisme, les échafaudages peuvent être bioactivé. L'incorporation de croissance angiogénique recombinant facteurs 13 ou génétiques des vecteurs codant pour des facteurs tels 14 a montré pour améliorer la vascularisation de l'échafaud. L'utilisation de cellules souches a été largement démontré être une stratégie prometteuse pour améliorer la vascularisation, où les cellules stromales et les cellules mésenchymateuses progénitrices endothéliales ont obtenu la plus grande attention 15,16. D'autres approches tentent de construire des constructions qui contiennent des réseaux de vaisseaux préfabriqués avant la transplantation 17. Malgré des efforts intensifs dans la conception de l'échafaudage et de leur bio-activation, pas de stratégie a amélioré la vascularisation au niveau cliniquement significative et, à l'exception des remplacements dermiques dans les brûlures massives, la traduction des documents issus du génie génétique dans la routine clinique n'est déroule hésitant 18 .

L'une des raisons pour lesquelles la vascularisationde constructions de tissu artificiel est encore un problème non résolu, est la difficulté d'évaluer le succès des nouvelles technologies dans les approches in vivo. Bien que des expériences in vitro peuvent fournir des indications importantes sur le potentiel de la vascularisation des échafaudages, des modèles animaux appropriés sont nécessaires pour étudier les paramètres clés tels que la biocompatibilité du matériau, la sécurité et l'efficacité du traitement et, d'une importance particulière, la vascularisation du tissu construire. Par conséquent, des outils fiables de visualiser et de quantifier les réseaux de vaisseaux sanguins in vivo sont essentiels.

Dans cette étude, nous présentons une méthode simple et fiable qui permet la visualisation et la quantification du réseau vasculaire à l'intérieur des échafaudages explantées. Cette méthode est basée sur la transillumination de tissus et de segmentation numérique. Etant donné que cette méthode est non invasif, il permet d'autres analyses moléculaires et histologiques de la matière cible.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1 Préparation des échafaudages

  1. Générer des échantillons des échafaudages en utilisant 12 mm de poinçons de biopsie.
  2. Pour introduire des molécules bioactives ou des cellules dans l'échafaud, égoutter les échafaudages en les pressant doucement avec une gaze stérile. Puis réhydrater les échafaudages en ajoutant 160 ul d'une solution contenant des molécules ou des cellules d'intérêt bioactifs. Double-vérifier le succès de bioactivation avec des cellules par des tests métaboliques tels que le MTT dosages.
  3. Si nécessaire, fixer les composés ou les cellules à tester à l'intérieur de l'échafaudage, en les délivrant, par exemple dans une solution de fibrine-thrombine ou un hydrogel, de nouveau à travers la réhydratation de la manière décrite dans l'étape 1.2.
    REMARQUE: Cette étape peut être utile lorsque des composés ou des cellules ne s'attachent pas mécaniquement à la matière. On peut aussi contrôler la dynamique de libération des composés ..
  4. Préparer les mailles titanisés, qui seront placés sous chaque échafaudage dans chaque groupe d'expérience et de contrôle, par cutting des morceaux en forme de tour, à environ 14 mm de diamètre.
    REMARQUE: La maille titanisé fonctionne comme une frontière physique requis pour délimiter le tissu régénéré à partir du lit de la plaie.

2. Animaux

  1. Avant la mise en œuvre du modèle présenté, consulter les lois de protection des animaux correspondants et obtenir la permission des autorités locales. Dans ce travail, toutes les expériences ont été effectuées avec des souris, selon l'actuelle loi sur la protection des animaux allemand et approuvés par le gouvernement du district de Haute-Bavière (Oberbayern Regierung von).
  2. Choisissez avec soin l'animal et de la souche. Bien que le modèle de souris a été établi, il peut être converti en d'autres animaux courants, tels que des rats, des lapins ou des cochons.
  3. Dans le cas où vous travaillez avec des animaux à fourrure, de se raser le dos des animaux avant l'implantation des échafaudages.
    NOTE: Ce travail utilise des souris de 6 à 8 semaines d'âge avec un poids corporel compris entre 20 g et 25 g, mais différents âges et body poids peuvent également être utilisés.

3. anesthésie

  1. Mener l'opération dans des conditions stériles. Afin de maintenir la température normale du corps de l'animal, utilisant une surface de chauffage.
  2. Avant l'anesthésie par inhalation les animaux reçoivent buprénorphine à une dose de 0,05-0,1 mg / kg de poids corporel, voie sous-cutanée toutes les 8 heures.
  3. Placez l'animal sous anesthésie par inhalation (isoflurane) ou appliquer des procédures standard équivalent. Confirmez l'anesthésie soit en pressant doucement les orteils de l'animal ou par une pincée de peau.
  4. Pour éviter exsiccoses, injecter 0,5 ml de solution saline physiologique par voie sous cutanée, au début de l'opération.

4. excision de la peau

  1. Placez l'animal dans une position couchée et marquer la ligne médiane du dos de la souris avec un stylo à pointe fine permanent (figure 1A).
  2. Définir la zone d'excision. Placez les défauts dans la zone indiquée dans Figure 1C. Notez que si les défauts sont placés trop caudale, les animaux sont plus enclins à enlever les pansements et les échafaudages.
  3. Créer ronde défauts bilatéraux en utilisant un 10 mm biopsie poinçon (figure 1B). Le poinçon doit être soigneusement forcé contre la peau et ne doit pas être utilisé pour couper complètement à travers la peau, mais pour délimiter la zone d'excision (Figures 1C et 1E).
  4. Soulevez délicatement la peau marquée avec une pince et inciser le long du cercle marqué avec des ciseaux chirurgicaux fines (figure 1F). En cas de saignement, comprimer soigneusement avec de la gaze stérile. Une description étape par étape de l'excision est représenté sur la figure 1.
    NOTE: Le défaut est créé avec un poinçon plus petit que celui de la génération des échafaudages, pour compenser l'élargissement du défaut dû à l'élasticité de la peau.

5. Échafaudages Implantation

  1. Pour faire de la place pour le titanisé maille, de prolonger la séparation de la peau et du tissu sous-jacent aux frontières plaies pour 2-4 mm (figure 2A).
  2. Placez le titanisés engrener dans le défaut directement sur ​​le lit de la plaie et dans les bords de la plaie (Figures 2A et B).
  3. Lieu échafaudages directement sur le maillage.
  4. Suturer les échafaudages sur les bords de la plaie adjacentes de 4 à 6 nœuds simples, laissant les bords un peu plus de l'échafaud (figure 2C).
    REMARQUE: Évitez l'utilisation de sutures biodégradables.
  5. Suturer une plaie pansement transparent au-dessus des défauts de protéger l'échafaudage, tout en permettant la surveillance de la zone de la plaie (Figure 2D).

6 Soins postopératoires

  1. Gardez une souris par cage pour éviter la manipulation mutuelle de la vinaigrette et les échafaudages.
  2. Évaluer l'état général de l'animal sur une base quotidienne en observant l'activité motrice, le poids corporel, des signes de douleur, de la toléranceà la vinaigrette et l'auto-mutilation. Surveiller également la surface de la plaie pour un saignement, des signes locaux et systémiques de l'infection et de la position du pansement.
  3. Afin de minimiser la douleur de l'animal, l'injection buprénorphine par jour à une dose de 0,05 à 0,1 mg de / kg de poids corporel ou d'un médicament analgésique équivalente.
  4. Si la souris enlève ou endommage le pansement, remplacer ou remettre en place sous anesthésie.

7. euthanasie et explantation de l'échafaud

  1. A des moments souhaités, sacrifier les animaux par des surdoses de pentobarbital (150 mg / kg).
  2. Marquez le site de l'excision de la peau avec un marqueur permanent, qui devrait inclure les échafaudages et autant de la souris peau du dos que possible (figure 3A).
  3. Inciser la peau le long des lignes marquées avec une paire de ciseaux ou un scalpel. Détachez l'ensemble de la peau, y compris les échafaudages et le maillage titanisé, à partir du tissu sous-jacent à travers la préparation émoussé (Figure 3B).
  4. Placez le tissu explantée étendu sur une boîte de Pétri (figure 3C et D)

8 Visualisation et quantification du réseau vasculaire

  1. Transillumination:
    1. Mettre en place un dispositif de radiographie, par le montage d'une boîte de Pétri dessus d'une forte source de lumière blanche (100 Watt ampoule standard).
    2. Correction d'un appareil photo numérique au-dessus du diaphanoscope pour obtenir des images numériques.
    3. Placer les échantillons à l'envers sur la boîte de Pétri sur le dispositif de radiographie.
    4. Prenez des photos des échafaudages complets en mode macro, ainsi que des zones de taille égale de la peau normale. Stocker les images dans un format TIFF pour une analyse plus approfondie numérique.
    5. Enregistrez le tissu pour plus d'analyse biochimique ou histologique.
  2. Segmentation numérique et la quantification:
    1. Télécharger et installer le logiciel VesSeg-outil, qui peut être obtenu free frais au: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
    2. Ouvrez l'image avec le logiciel VesSeg-Tool.
    3. Sélectionnez la zone de l'image couverte par l'échafaud pour l'analyse numérique (Image → Select).
    4. Pour augmenter le contraste des vaisseaux utiliser l'option "seuil d'hystérésis" (image → amélioration de navire filtre → Hystérésis seuil → Top-Hat transformation → amélioration de navire Calculer).
    5. Procéder à la segmentation de la carte de la cuve (de frontières image → amélioration de navire filtre → → hystérésis seuil de seuil). Sélectionnez le premier seuil («couverture de navire»), de sorte que chaque pixel, ce qui est encore à distance type vaisseau, sera étiqueté comme navire. Sélectionnez le second seuil ("couverture de base"), de sorte que seuls les pixels qui sont particulièrement type vaisseau sera étiqueté comme navires.
    6. Vérifiez la proposition de segmentation automatique manuellement pour ajouter des navires non capturées et d'éliminer les structures de faux positifs communs, qui sont généralement des structures de navires comme de longues et minces tels que des poils ou des sutures.
    7. Calculer la longueur des navires et la superficie totale couverte par les navires (statistiques image → Image → statistiques d'images binaires).
      REMARQUE: Pour le calcul des navires longueurs, les navires de la carte de navire résultant sont éclaircis à des lignes d'une largeur d'un pixel 20.
  3. Analyser la région natale de la peau sous les mêmes paramètres que les échafaudages, l'attribution d'une valeur de 100% pour le tissu natif et rapporter l'échafaud à cette valeur. Par exemple, si le pourcentage de pixels blancs est de 60% dans le tissu normal et 30% dans l'échafaudage, cela représenterait une vascularisation de 50% de l'échafaud. Remarque: Le vaisseaux couverture des cheveux blancs est affectée à la surface d'un carré autour de l'échafaud. Réglez le nombre de pixels blancs couverture considering que la surface du cercle est sensiblement plus petit (π x R 2) que le carré (4 x R 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A défaut fiable pleine peau bilatérale peut être créé chez la souris (Figure 1) où la peau peut être remplacé par un biomatériau à l'étude (Figure 2). Ici, pas de complications majeures sont observées pendant ou après l'intervention chirurgicale, ni signes macroscopiques d'infection ou de réaction à corps étranger. Dans de rares cas, un échafaudage se perd lorsque la souris le supprime. La contraction des plaies n'a jamais été observée (figure 3). transillumination de tissus a permis une visualisation claire des structures vasculaires allant jusqu'à 30 um de largeur, dans un échantillon de tissu qui comprenait à la fois, tissu natif et échafaudages implantés (Figure 4). Après segmentation numérique, les navires pourraient être facilement quantifiés au moment souhaité après l'implantation. Par exemple, 2 semaines après l'implantation, les niveaux de 62,28 ± 8,6% de la vascularisation n'a été observée (moyenne ± erreur standard de la moyenne, n = 8) 21. Au total, environ 25 min et# 160; par animal (2 échafaudages) sont nécessaires pour l'implantation, 5 min pour récolter du tissu et qui évoque et 10 min pour l'analyse numérique d'un échantillon. Comme un point final, cette méthode n'affecte pas la qualité du tissu explantée pour une analyse ultérieure. Par exemple, des protéines et des extraits d'ARN peuvent être facilement obtenus à partir de l'échantillon par des procédés classiques.

Figure 1
Figure 1: des défauts de la peau complet. L'ligne médiane du dos de la souris est marqué avec un stylo à pointe fine et un poinçon de biopsie est utilisé pour marquer la zone ont été le défaut sera créé (A, B, C et D). Une fois que les zones sont définies, la peau pleine est retirée avec des ciseaux chirurgicaux standards comme on le voit dans le plan rapproché de la préparation (E et F). A final résultat de l'anomalie est indiquée en (D) et amplifié en (G). Les barres d'échelle représentent 1 cm de ABCD et 5 mm d'EFG. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: L'implantation de l'échafaudage. Avant l'implantation de l'échafaudage, un treillis est placé dans le défaut directement sur ​​le lit de la plaie et sous les bords de la plaie (A et B). Suivant les échafaudages sont placés au-dessus de la maille et suturées aux bords de la plaie (C). Enfin, un pansement transparent est placé et suturé à la peau (D). La barre d'échelle représente 5 mm (A, B, et C) und 1 cm (D). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 explantation des tissus. Pour l'analyse des tissus de la peau complète de l'arrière de l'animal est enlevée chirurgicalement (A et B) et étendu sur une boîte de Pétri (C). Pour transillumination la peau est renversé et une photo numérique est prise (D). L'enlèvement de la peau à côté de l'échafaudage est nécessaire pour la normalisation des données de vascularisation. Les barres d'échelle représentent 1 cm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 4 Transillumination, segmentation numérique et les tissus de la peau a été excisée quantification. Et le réseau vasculaire dans a été visualisée par transillumination (images supérieures) peau pleine de l'arrière (A) et les zones détaillées de la peau d'origine (B) et l'échafaud (C ) sont représentés. Les flèches indiquent les zones agrandies dans (B) et (C). Chacune des images du bas montre les résultats de l'opération de segmentation de l'image numérique située directement au-dessus. Les barres d'échelle représentent 5 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Il est nécessaire d'établir des méthodes efficaces dans l'amélioration de la perfusion sanguine dans les constructions de l'ingénierie tissulaire, qui exige la mise au point de nouvelles méthodes fiables pour étudier les processus de vascularisation dans les biomatériaux. Les méthodes courantes pour faire échafaud vascularisation ex vivo visible comprennent l'utilisation de la microscopie, qui fournit un outil de haute résolution. Dans la plupart des cas, cependant, cette méthode est limitée à l'analyse de petites zones de tissu et a tendance à être coûteux et prend du temps. En outre, il comprend souvent étiquetage complexe et des méthodes de coloration, où le sang perfusé navires ne peuvent pas être distingués des non-fonctionnels 22. Méthodes utilisées pour évaluer la fonctionnalité des bâtiments sont la tomographie par ordinateur, l'imagerie par résonance magnétique et la tomographie électronique de positons. Ces méthodes présentent les inconvénients des équipements extrêmement coûteux et à faible pouvoir de résolution 23. Une autre stratégie couramment utilisée pour visualiser la vascularisation est l'utilisation des moulages vasculaire suivie par la corrosion chimique des tissus 24. Cette méthode permet d'obtenir une structure 3D représentant du réseau vasculaire, mais les résultats varient fortement en fonction du niveau de la perfusion des tissus artificiels et ne peut pas être utilisé pour d'autres études biochimiques, telles que des protéines ou de l'analyse de l'ARN. La membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM) du modèle 25 et le modèle de la chambre de pli cutané chez les rongeurs 26,27 se sont avérés être des méthodes efficaces pour analyser l'angiogenèse, la perfusion capillaire et du débit sanguin. Récemment, le modèle de la chambre du pli cutané a également été utilisé pour des applications de génie tissulaire évaluation des stratégies de vascularisation base de MSC dans les échafaudages de polyuréthane poreux 28. Ces méthodes présentent des avantages importants pour l'imagerie in vivo et représente une cible intéressante pour le procédé décrit ici.

Le modèle présenté ici a été développé pour pallier les insuffisances de la méthode mentioned ci-dessus. Profitant des caractéristiques intrinsèques uniques de la peau, des défauts complets sont créés et utilisés pour évaluer la vascularisation des biomatériaux. La peau est un organe externe, ce qui permet de faciliter la visualisation et la manipulation du tissu. En raison de sa structure de surface homogène et large, de multiples défauts peuvent être créés qui rend les comparaisons internes possible, tout en diminuant le nombre d'animaux requis pour l'étude. En raison de la symétrie antéro-postérieur de l'animal, des défauts bilatéraux sont proposées, cependant; l'influence des effets systémiques doit être envisagée lorsque les deux parties sont comparées les unes aux autres. Enfin, la peau est un tissu assez transparent représentant un organe de choix possible pour transillumination. Bien que le procédé décrit ici est approprié pour de nombreux tissus différents et de plusieurs biomatériaux natifs, ce protocole a été établi à l'origine pour être utilisé avec un échafaudage à base de collagène à double couche qui est approuvé par la FDA et cliniquement utilisé pour dermal réparation. Une condition préalable importante pour la mise en œuvre de cette méthode est que l'échafaudage doit être partiellement transparente. Selon le matériau choisi de l'échafaudage, une adaptation du protocole peut être nécessaire. Auparavant, notre groupe a utilisé le modèle pour montrer comment l'application des cellules mésenchymateuses humaines aux échafaudages améliore leur vascularisation 29.

Une caméra numérique standard et une source de lumière sont suffisantes pour la visualisation du réseau vasculaire, qui peut être quantifiée par le logiciel gratuit. La segmentation semi-automatique des images par la VesSeg-outil se compose de deux étapes. Dans la première étape, l'image prise à partir du réseau vasculaire est contraste amélioré conduisant à une carte de la cuve. Ensuite, l'algorithme de segmentation sélectionne les zones du navire et enfin, la proposition de segmentation est présenté comme une image (figure 4) 30. Dans une deuxième étape de traitement, en utilisant le fait que les récipients sont reliés structures (ce qui signifie que navire pixels tenir ensemble dans l'espace), une deuxième segmentation permet de sélectionner à partir de la première que les navires de vrais pixels et tous les vrais vaisseaux pixels. Par conséquent, une étiquette définitive de «un» est décerné uniquement aux navires de faible confiance des pixels de la première image qui sont connectés sur une chaîne de voisins à un navire pixel de confiance élevé dans la deuxième image.

En l'absence d'additifs chimiques sont nécessaires, ce procédé est aussi rentable. Analyse numérique montre une bonne reproductibilité à déterminer les dimensions du navire distances intravasculaires, le nombre de points de branchement, zone vascularisée et la longueur totale de réseau vasculaire. Nous avons précédemment montré que le réseau de vaisseaux sanguins peut être visualisée par transillumination mieux que par des études de radio-angiographique 31. La présence de la maille de titane a une double fonction. D'une part, il empêche la contraction de la plaie, ce qui est un inconvénient commun de l'utilisation de la souris models; d'autre part, il fournit une frontière physique entre l'échafaudage et le lit de la plaie. Parce que la plupart des échafaudages sont biodégradables, cette dernière fonction est essentielle pour délimiter physiquement la frontière entre l'échafaudage et le lit de la plaie au cours de la récolte des échafaudages. Parmi les principaux inconvénients de cette méthode est la nécessité de l'explantation des échafaudages et donc le retenir de l'analyse à un seul point dans le temps; ainsi l'observation dynamique de la vascularisation n'est pas possible avec le réglage actuel. Un autre problème est que cette méthode est limitée à des biomatériaux semi-transparents qui permettent transillumination. Enfin, même si la procédure d'opération ne nécessite pas de compétences chirurgicales spécifiques, une courbe d'apprentissage d'environ 6 - 12 animaux opérés doivent être considérés à maîtriser la méthode correctement.

Nous introduisons un temps et le coût approche efficace qui permet la visualisation à haute résolution et la quantification des structures vasculaires, representing une méthode idéale pour comparer la vascularisation dans différents biomatériaux ou des stratégies différentes échafaudage bioactivation. Ce procédé est facile à mettre en place et ne nécessite pas d'équipement spécial. Un élément clé de ce modèle est que, après la visualisation des vaisseaux, les tissus peuvent ensuite être utilisées pour des études comme analyse histologique ou moléculaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Conflit d'intérêt:

Tous les auteurs: Aucun

Liens financiers:

Aucun des auteurs a un intérêt financier dans l'un des produits, dispositifs ou médicaments mentionnés dans ce manuscrit.

Acknowledgments

Integra modèle de régénération dermique a été gracieusement fournie par Integra Lifesciences Corporation. Sources de fonds soutenant le travail: Ce travail a été partiellement financé par le début Award CIRM-BMBF translationnelle II et le Centre de régulation génomique FONDAP fois à JTE (Nr 15090007.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 Ethicon, Norderstedt, Germany 698G Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1050
Biopsy punches (12 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1250
Digital camera  Ricoh, Hannover, Germany Cx1
Gazin Mullkompresse  Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany 13622 Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA 88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia  Baxter, Unterschleissheim, Germany 100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu Charles River, Sulzfeld, Germany Strain code 088 Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g 
Buprenorphine (0.3 mg/ml) Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight PFM Medical AG, Köln, Germany 6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany B1332020110614 Fibrin-thrombin solution 
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK M6275009/10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rahaman, M. N., Mao, J. J. Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine. Biotechnology and Bioengineering. 91, (3), 261-284 (2005).
  2. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).
  3. Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. Bioartificial skin. Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).
  4. Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).
  5. Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. Strategies for vascularization of polymer scaffolds. Journal of Investigative Medicine. 58, (7), 838-844 (2010).
  6. Laschke, M. W., et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes. Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).
  7. Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction. Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2, (5), 510-525 (2010).
  8. Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold. Biomaterials. 34, (11), 2655-2664 (2013).
  9. Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering. International Journal of Pharmaceutics. 439, (1-2), 73-80 (2012).
  10. Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).
  11. Wang, X., et al. The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats. Acta Biomaterials. 9, (8), 7822-7832 (2013).
  12. Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches. Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).
  13. des Rieux, A., et al. 3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering. Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).
  14. Reckhenrich, A. K., et al. Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector. Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).
  15. Chen, J., et al. The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration. Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).
  16. Fedorovich, N. E., et al. The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs. Tissue Engineering Part A. 16, (7), 2355-2367 (2010).
  17. Wang, L., et al. Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells. Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).
  18. Cuadra, A., et al. Functional results of burned hands treated with Integra. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65, (2), 228-234 (2012).
  19. Wilcke, I., et al. VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo. Langenbecks Arch Surg. 392, (3), 305-314 (2007).
  20. Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. 21-26 (2005).
  21. Danner, S., et al. The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration. Journal of Investigative Dermatology. 132, (6), 1707-1716 (2012).
  22. Shaterian, A., et al. Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing. Burns. 35, (6), 811-817 (2009).
  23. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nature Medicine. 9, (6), 713-725 (2003).
  24. Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).
  25. Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo. Microvascular Research. 54, (1), 65-73 (1997).
  26. Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. American Journal of Pathology. 143, (4), 1055-1062 (1993).
  27. Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo. International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9, (1), 103-117 (1990).
  28. Laschke, M. W., et al. Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds. Acta Biomaterials. 9, (6), 6876-6884 (2013).
  29. Egaña, J. T., et al. Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration. Tissue Eng Part A. 15, (5), 1191-1200 (2009).
  30. Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. 269-272 (2005).
  31. Egaña, J. T., et al. Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin. Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).
Une peau pleine de défauts modèle pour évaluer la vascularisation des biomatériaux<em&gt; In Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schenck, T. L., Chávez, M. N., Condurache, A. P., Hopfner, U., Rezaeian, F., Machens, H. G., Egaña, J. T. A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo. J. Vis. Exp. (90), e51428, doi:10.3791/51428 (2014).More

Schenck, T. L., Chávez, M. N., Condurache, A. P., Hopfner, U., Rezaeian, F., Machens, H. G., Egaña, J. T. A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo. J. Vis. Exp. (90), e51428, doi:10.3791/51428 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter