Summary

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em> In Vivo</em

Published: August 28, 2014
doi:

Summary

Vaskularisierung ist der Schlüssel zur erfolgreichen Ansätze in der Gewebezüchtung. Daher werden sichere Technologien erforderlich, um die Entwicklung von Gefäßnetze im Gewebekonstrukte bewerten. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode zur Visualisierung und Quantifizierung Vaskularisierung in vivo.

Abstract

Unzureichende Vaskularisierung wird als einer der wichtigsten Faktoren, die den klinischen Erfolg der Tissue-Engineering-Konstrukten sein. Um neue Strategien, die auf die Verbesserung der Gefäß Ziel zu bewerten, werden zuverlässige Methoden erforderlich, um die in-Wachstum von neuen Blutgefäßen in Bio-künstliche Gerüste sichtbar zu machen und zu quantifizieren, die Ergebnisse. In den letzten paar Jahren hat unsere Gruppe eine vollständige Hautdefekt Modell, das die direkte Darstellung von Blutgefäßen ermöglicht durch Durchleuchtung und bietet die Möglichkeit der Quantifizierung durch digitale Segmentierung eingeführt. In diesem Modell chirurgisch schafft eine volle Hautdefekte in den Rücken von Mäusen und ersetzt sie mit dem geprüften Werkstoff. Moleküle oder Zellen von Interesse können in solche Materialien einverleibt werden, um die möglichen Auswirkungen zu untersuchen. Nach einer Beobachtungszeit von der eigenen Wahl werden die Materialien für die Bewertung explantiert. Bilaterale Wunden bieten die Möglichkeit, interne Vergleiche thbei minimieren Artefakte zwischen den Individuen als auch der Verringerung der Anzahl der Tiere, für die Studie benötigt. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, bietet unsere Methode eine einfache, zuverlässige und kostengünstige Analyse. Wir haben dieses Modell als Routinewerkzeug in hoher Auflösung Screening beim Testen von verschiedenen Gefäß Biomaterialien und Bio-Aktivierung durchführen Ansätze implementiert.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten hat sich das Tissue Engineering eine neue therapeutische Option, um Gewebedefekten mit körpereigenen Zellen ersetzen 1 eröffnet. Um die physiologischen Prozess der Geweberegeneration zu unterstützen, werden als biologisch abbaubare Gerüst-Struktur, die ein Szenario, in dem Zellen aus dem Wundbett wachsen und Wiederherstellen der Defekt 2,3 kann bietet gestalten.

Unzureichende Vaskularisierung gilt als das Haupthindernis, das die klinischen Durchbruch der bioartifizielle Gerüste 4 zurückhält sein. Mit dem Einwachsen von Zellen, wird die Nachfrage nach Nährstoffen und Sauerstoff zu und Gefäß des Materials wesentlich. Unzureichende oder verzögert Gefäß kann daher zu zentralen Nekrose der Tissue-Engineering-Produkte 5 führen. Darüber hinaus bieten die Blutgefäße immunkompetenten Zellen und Entfernen der Stoffwechselreste in dem Regenerationsbereich. Hohe Infektionsraten und geringe Regenerations sind nureinige der Folgen unzureichender Durchblutung im Tissue Engineering beobachtet, die ausgerichtet sind, um durch die Erhöhung der Vaskularisierung der Gerüste 6,7 abgewendet werden.

Mehrere Strategien, die auf die Verbesserung der Vaskularisierung Fokus auf die Schlüsselrolle von dem Biomaterial selbst und der Mikrostruktur des Gerüst zielen. Es gibt intensive Forschungsbemühungen, um neue Ansätze bei der Verlagerung des Heilungsprozesses von der Reparatur, um die Regeneration und damit (wieder), die ein Gewebe mit den engsten physiologischen Objekte, die dem zu entwickeln, die wiederhergestellt werden 8,9. Biomaterialien, die ihre Regenerationspotential untersucht und bewertet wurden hinsichtlich enthalten Kollagen, Fibrin, Chitosan und Alginat 10,11. Diese Biomaterialien verwendet und kombiniert als Backbone für den Bau neuer Gerüste mit unterschiedlichen Strategien, wie Gewebe Dezellularisierung, Selbstorganisation, Rapid Prototyping und das Elektro 12 werden. Um ENHrung der körpereigenen Regenerationsfähigkeit, kann Gerüste bioaktiviert werden. Der Einbau von rekombinanten angiogene Wachstumsfaktoren 13 oder Gen-Vektoren kodieren für solche Faktoren 14 hat gezeigt, dass die Vaskularisierung des Gerüsts zu verbessern. Die Verwendung von Stammzellen wurde weithin gezeigt worden, um eine vielversprechende Strategie, um Gefäß, bei denen mesenchymale Stromazellen und endothelialen Vorläuferzellen haben die meiste Aufmerksamkeit 15,16 gewonnen zu verbessern. Andere Ansätze versuchen, Konstrukte, die vorgefertigte Gefäßnetze vor der Transplantation 17 enthalten zu bauen. Trotz intensiver Bemühungen in Gerüst-Design und ihre Bio-Aktivierung hat keine Strategie Vaskularisierung an einer klinisch signifikanten Niveau verbessert und, mit Ausnahme von Hautersatz in massiven Brandverletzungen, ist die Übersetzung von biotechnisch hergestellten Materialien in der klinischen Routine nur zögerlich statt 18 .

Einer der Gründe, warum die Vaskularisierungder künstlichen Gewebekonstrukten ist immer noch ein ungelöstes Problem ist die Schwierigkeit, den Erfolg der neuen Technologien in der in-vivo-Ansätze zu bewerten. Obwohl in vitro-Experimenten können wichtige Erkenntnisse der Gefäß Potenzial von Gerüsten bieten, werden geeignete Tiermodelle erforderlich, um wichtige Parameter untersuchen, wie die Biokompatibilität des Materials, die Sicherheit und Wirksamkeit der Behandlung und, besonders wichtig, die Vaskularisierung des Gewebes zu konstruieren. Daher zuverlässige Werkzeuge zur Visualisierung und Quantifizierung von Blutgefäßnetze in vivo sind unerlässlich.

In dieser Studie zeigen wir ein einfaches und zuverlässiges Verfahren, das die Visualisierung und Quantifizierung des Gefäßnetzes in explantierten Gerüsten ermöglicht. Diese Methode basiert auf Gewebe und digitale Durchleuchtung Segmentierung. Da dieses Verfahren nicht-invasiv ist, kann er weitere molekulare und histologische Analysen des Targetmaterials.

Protocol

1. Herstellung der Gerüste Erzeugen Proben der Gerüste durch die Verwendung von 12 mm-Biopsie Schläge. Bioaktive Moleküle oder Zellen einzuführen in das Gerüst, abtropfen lassen die Gerüste durch sanft drückte sie mit einer sterilen Gaze. Dann rehydrieren die Gerüste durch Zugabe von 160 ul einer Lösung, die biologisch aktiven Moleküle oder Zellen von Interesse enthält. Überprüfen Sie den Erfolg der Bioaktivierung mit Zellen durch Stoffwechseltests, wie MTT-Assays. Falls erfo…

Representative Results

Eine zuverlässige bilateralen Vollhautdefekt in der Maus (Abbildung 1), wo die Haut durch ein Biomaterial untersucht (Abbildung 2) ersetzt werden erstellt. Hier werden keine größeren Komplikationen während oder nach dem operativen Eingriff, weder makroskopische Anzeichen einer Infektion oder Fremdkörperreaktion beobachtet. In seltenen Fällen wird ein Gerüst verloren, wenn eine Maus entfernt es. Wundkontraktion wurde nicht beobachtet (Abbildung 3). Gewebedurch erl…

Discussion

Es besteht die Notwendigkeit, erfolgreiche Ansätze bei der Verbesserung der Durchblutung im Gewebe Konstrukte, die die Entwicklung von neuen zuverlässigen Methoden verlangt, um die Gefäßprozesse in den Biomaterialien zu untersuchen etablieren. Übliche Verfahren zur Herstellung von Gerüst Vaskularisierung ex vivo sichtbar umfassen die Verwendung von Mikroskopie, die eine hochauflösende Werkzeug bietet. In den meisten Fällen jedoch ist dieses Verfahren beschränkt auf die Analyse von kleinen Gewebebereich…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Integra dermalen Regeneration Vorlage wurde freundlicherweise von Integra Lifesciences Corporation. Finanzierungsquellen zur Unterstützung der Arbeit: (. Nr 15090007) Diese Arbeit wurde teilweise durch die CIRM-BMBF Früh Translational II Award und dem FONDAP Zentrum für Genom Regelung sowohl JTE finanziert.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 Ethicon, Norderstedt, Germany 698G Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1050
Biopsy punches (12 mm) Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA P1250
Digital camera  Ricoh, Hannover, Germany Cx1
Gazin Mullkompresse  Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany 13622 Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8 'x 10') Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA 88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia  Baxter, Unterschleissheim, Germany 100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu Charles River, Sulzfeld, Germany Strain code 088 Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g 
Buprenorphine (0.3 mg/ml) Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight PFM Medical AG, Köln, Germany 6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany B1332020110614 Fibrin-thrombin solution 
Transparent adhesove drape (30.5 cm x 26 cm) KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK M6275009/10

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Schenck, T. L., Chávez, M. N., Condurache, A. P., Hopfner, U., Rezaeian, F., Machens, H., Egaña, J. T. A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo. J. Vis. Exp. (90), e51428, doi:10.3791/51428 (2014).

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