Summary
Vi presenterer i denne artikkelen en ny strekking plattform som kan brukes til å undersøke enkelt celle responser på komplekse anisotrop biaksial mekanisk deformasjon og kvantifisere de mekaniske egenskapene til biologiske vev.
Abstract
Verktøy som tillater anvendelse av mekaniske krefter på celler og vev, eller som kan kvantifisere de mekaniske egenskapene til biologiske vev har bidratt betydelig til forståelsen av basis mechanobiology. Disse teknikkene har vært mye brukt for å demonstrere hvordan utbruddet og progresjon av ulike sykdommer er sterkt påvirket av mekaniske signaler. Denne artikkelen presenterer en multi-funksjonelle biaksiale stretching (BAXS) plattform som kan enten mekanisk stimulere enkeltceller eller kvantifisere mekanisk stivhet av vev. Den BAXS plattformen består av fire talespole motorer som kan styres uavhengig av hverandre. Enkeltceller kan kultiveres på et fleksibelt substrat som kan festes til motorene tillater en å eksponere cellene til komplekse, dynamiske, og rommessig varierende belastningsfelt. Omvendt, ved å inkorporere en kraft som lastcelle, kan man også beregne de mekaniske egenskapene til primær-vev som de er utsatt for deformasjon sykluser.I begge tilfeller må et passende sett av klemmene være utformet og montert på BAXS plattform motorer for å holde fast det fleksible substrat eller vev av interesse. Den BAXS plattformen kan monteres på en invertert mikroskop for å utføre simultan fallende lys og / eller fluorescens-avbildning for å undersøke de strukturelle og biokjemiske reaksjon av prøven i løpet av strekkforsøk. Denne artikkelen gir eksperimentelle detaljene i utformingen og bruken av BAXS plattformen og presenterer resultater for enkelt celle og hele vev studier. Den BAXS plattformen ble brukt til å måle deformasjon av kjerner i enkelt mus myoblast-cellene i respons til underlaget belastning og for å måle stivheten av isolerte mus aortas. Den BAXS plattformen er en allsidig verktøy som kan kombineres med en rekke optiske microscopies for å tilveiebringe nye mechanobiological innsikt i de sub-cellulære, cellulær og hel vevsnivåer.
Introduction
Den mekaniske mikromiljøet spiller en viktig rolle i mange cellefunksjoner, som proliferasjon, migrering og differensiering, som har en betydelig innflytelse på utvikling og homeostase av vev, og også i sykdommer 1-6. Gjennom årene har en rekke eksperimentelle verktøy blitt brukt til mekanisk stimulere celler eller vev og måle mekaniske egenskapene til biologiske vev med mål om å øke vår forståelse av grunnleggende mechanobiology og studere utbruddet og progresjon av sykdommer 6-17. Imidlertid må man ofte avhengige av flere ulike eksperimentelle enhetene for å oppnå målene i en bestemt studie. Denne artikkelen presenterer et enkelt multi-funksjonelle, dual-aksen strekker (BAXS) plattform, som gjør det mulig for studier som undersøker den rollen som mekaniske egenskaper og mekaniske krefter spille i biologi ved sub-mobilnettet til hele vev lengdeskalaer. Den BAXS plattformen ikke bare åpner for quantification av de mekaniske egenskapene til isolerte vev, men også forenkler muligheten til å bruke enkle, komplekse og dynamiske belastnings felt til levende celler for å forstå sine svar til strekking som skjer in vivo. Den BAXS plattformen opprettholder også kapasitet til å utføre live-cell mikros under mekanisk testing og forstyrrelser på celler og vev.
Den BAXS plattformen er en spesialbygd anordning som kan brukes for å undersøke effekten av substratet deformasjon på cellenivå, og å utføre strekk-tester av biologiske vev (Figur 1a). En aluminiumvarmeanordning ble fremstilt for å få plass til en standard 10 cm petriskål og opprettholde noen fysiologiske løsninger ved 37 ° C ved hjelp av en temperaturregulator og Kapton beredere (figur 1B). Denne BAXS plattformen kan integreres på en omvendt fasekontrast-og / eller fluorescens mikroskop og muliggjør simultan avbildning (figur 1C).I korte trekk består BAXS plattform av fire lineære talespole motorer hvorav de bevegelige delene er montert på miniatyr lineær bevegelse kulelager lysbilder orientert langs to vinkelrette akser (figur 1D). En lineær posisjonering stadium er montert på hver av de fire motorer for å tillate vertikal bevegelse av klemsystemet som skal brukes (figur 1E). Posisjonen til hver motor er overvåket av en optisk giver med en oppløsning på 500 nm (fig. 1F). Alle fire motorene styres uavhengig av hverandre med en bevegelseskontroller ansette optisk encoder tilbakemelding til å utføre bevegelseskommandoer (figur 1G). En LabVIEW grensesnitt gir full kontroll over omfanget forskyvning, hastighet og akselerasjon for hver motor for å generere helt tilpasses, statisk og dynamisk, deformasjon av cellene eller vevsprøver.
Den teknikk som brukes for å fremkalle en deformasjon i cellene er oppnådd ved ganske enkelt å allowing celler for å feste seg til en fleksibel og gjennomsiktig substrat, og deretter strekking av dette substrat ved hjelp av de fire motorene i BAXS plattformen. Den BAXS plattformen tillater montering av noen spesialdesignede sett med klemmer for å feste underlaget på talespole motorer. For dette formål utformet vi et sett av klemmer til hvilke en fleksibel og gjennomsiktig substrat, som består av polydimetylsiloksan (PDMS), kan festes (figurene 2A-C og figur 3). Ettersom klemmene vil bli utsatt for fysiologiske løsninger, alle deler maskinert av rustfritt stål for å gi rom for sterilisering. Disse klemmene har blitt nøye designet for å bringe underlaget så nært som mulig til mikroskop mål å forbedre bildekvaliteten, samtidig som belastningen på underlaget under stretching (figur 2D).
Den samme BAXS plattformen kan også brukes til å kvantifisere stivhet i små vevsprøver, med et passende sett av klemmer med tilpasted støtter for vevsprøver og en lastcelle for å overvåke krefter. Flere tilnærminger kan tas for å montere en vev til BAXS plattform motorer; i dette tilfelle rustfrie insekt minutiens nålene kan hekte gjennom åpningen i vaskulære vev for å utføre strekk-tester (Fig. 4A-B). Alternativt, for tykke vev uten en naturlig åpning, vev kanter kan enten holdes i posisjon med klemmene festet til talespole motorer eller limt til små glassplater med biologisk lim og festet til motorene med klemmene. For å utføre strekk-tester en miniatyr-lastcelle er nødvendig, og kan lett tas bort på BAXS plattformmotorer og benyttes for å måle kraft som virker på vevet under et strekk syklus (figur 4C). Som BAXS plattformen er sammensatt av fire motorer, innføring av en andre lastcelle gjør det mulig å utføre strekk-testing langs to ortogonale retninger. Denne evnen gjør det mulig å quantify den mekaniske stivhet av en enkelt vev langs to vinkelrette retninger i samme eksperiment.
Viktigere, i alle konfigurasjoner, cellene eller vevsprøver av interesse blir alltid opprettholdt i et temperaturkontrollert bad som er tilgjengelig for brukeren. Denne evnen gjør det mulig for innføring av farmakologiske midler i prøven som strekker seg for å undersøke tidsmessige reaksjon av prøven. I tillegg, som den optiske aksen til det inverterte mikroskop forblir uforstyrret, alle former for mikroskopi er fremdeles tilgjengelig for brukeren. Til slutt, som alle fire motorene i BAXS plattformen er uavhengige, er det mulig å anvende svært konfigurerbar belastningsfelt til prøven av interesse. In vivo-celler og vev er utsatt for komplekse og anisotrop strekking som kan være mer hensiktsmessig etterlignet i denne plattformen i motsetning til tradisjonell uniaxial strekker plattform 7,13,15,18,19. Dessuten, de fysiske egenskapeneav belastningen feltet kan endres på fly under et eksperiment. Disse egenskaper tillater at brukeren kan undersøke cellulær-og vevsnivå respons på et stort antall svært komplekse, anisotropisk, er tidsmessig og rommessig varierende belastningsfelt. Denne artikkelen beskriver de fordeler og begrensninger av BAXS plattform samt dens design, operasjonelle prinsipper, og de eksperimentelle detaljer for enkelt celle og hele vev eksperimenter.
Figur 1. Oversikt over BAXS plattformen. A) toppriss av BAXS plattform som viser de fire talespolemotorer. B) detaljert bilde av petriskålen varmeapparatet benyttes til å opprettholde celler og vev ved 37 ° C. C) Plattformen kan monteres på en invertert mikroskop for å utføre levende cell imaging under strekker eksperimenter.D) Detaljert bilde av talespolen motor; den bevegelige del av plattformen. E) detaljert bilde av den lineære posisjonstrinn som tillater vertikal forskyvning av klemmesystemer. F) detaljert bilde av den optiske giver som gir sanntid posisjonen av motoren til bevegelsesregulatoren. G) Detaljert bilde av bevegelseskontrolleren som viser de fire optiske enkoderinnganger og effekter til de fire talespole motorer.
Figur 2. Klem system for celle strekker eksperimenter. AB) i bilder som viser detaljene av klemmer som brukes til å feste PDMS substrat til talespole-motorer for strekking. C) Substratet blir viklet rundt den sylindriske del av klemmen med dens forankring features sitter i sporet på toppen. Da underlaget er sikret ved hjelp av justeringsskruene som presser underlaget / forankring funksjoner inn i topp groove. D) Illustrasjon av BAXS plattform med klemmer som holder underlaget på plass. Det innfelte viser en detaljert visning av underlaget med celler som er knyttet til det sittende rett over et dekkglass og mikroskop mål.
Fig. 3. Bill av materialer av membranen og dens klemsystemet. Tegninger som viser dimensjonene av de viktigste delene er integrert på biaksial plattformen for å utføre celle strekker eksperimenter.
Figur 4. Exrikelig av et klemsystem for stivhet vurdering av småkalibrede fartøy. AB) detaljerte bilder av klemsystemet brukt til å indusere deformasjon i en 1 mm diameter mus aorta. Rustfritt stål nålene ble omhyggelig formet til åpne trekanter for å tillate fartøyet å gli på begge pinnene. C) Illustrasjon av BAXS plattform med klemmene som holder fartøyet og en lastcelle koblet mellom den faste motor, og den venstre klemme. Det innfelte viser et detaljert topp visning av montert på pinnene fartøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Mekanisk deformasjon av enkeltceller
- Fabrikasjon av en PDMS Underlag med Embedded fluoriserende perler
Før fremstilling av substratet, er fluorescerende mikrosfærer i vann-løsning på nytt oppslemmet i isopropanol for å forbedre kuleblanding i PDMS på grunn av sin hydrofobe karakter.- Pipetter 500 pl av fluorescerende mikrosfærer til en 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 16 200 xg i 10 min.
- Kast supernatanten og tilsett 500 pl isopropanol fulgt med 5 min av virvling. Plasser flasken til side natten over i mørket for å tillate eventuelle store partikler aggregerer til å sedimentere.
- Neste morgen, fjern forsiktig supernatanten til en ren ampulle mikrosentrifuge. Denne vulsten løsningen kan brukes til å fremstille mer enn 5 substrater. MERK: Perlen løsningen vil fortsette å sedimentere for de neste tre dagene. Vær forsiktig for å unngå resuspending pellet.
- Hell 0,5 g av den herder gittmed PDMS sett i et 1,5 ml mikrosentrifuge ampullen ved hjelp av et vitenskapelig balanse. Ved suksessive trinn, til et totalt 90 pl av perler (i seks 15 mL tilsetninger), vortex-blanding i 1 min mellom hver tilsetning. Sett til side.
- Vei opp 10 g av PDMS og bland i minst 12 minutter med 0,5 g av herdemiddel supplert med fluoriserende perler.
- Dikte en SU-8 2050 cross-formet mold ved hjelp av standard fotolitografi teknikk etter produsentens anvisninger. Formen som brukes har en høyde på 320 mikrometer og et areal på 13,4 cm 2 (figur 3). Formen kan bestå av 428 pl eller 440 mg av PDMS.
- Hell 400 mg av PDMS med perler i den korsformede formen ved hjelp av en overførings pipette og herde i 2 timer ved 80 ° C. Etter herding, skrelle av substratet fra formen (figur 5A). Substratet kan oppbevares i en petriskål ved romtemperatur i 2 uker uten å vise betydelige endringer i de mekaniske egenskaper. Hell dråper av PDMS (herder: PDMS med et forhold på 01:20) i en petriskål med en endelig størrelse på ca 4 mm i diameter og kurere dem opp-ned i 2 timer ved 80 ° C (figur 5B). Disse ankrings funksjonene kan holdes i en petriskål for uker. MERK: Opprettholde fatet opp ned for å hindre at dråpene fra utflating under herdeprosessen.
- Air-plasma godbit (30 sek på 30 W) underlaget og åtte forankring funksjoner. Bind funksjonene på hver side av substratet i en avstand på 4 mm fra den firkantede inntrykningen stede på substratet (figur 5C).
- Montering Membran på Klemmer
- Pakk hver ende av substratet rundt den rillete sylindriske del av klemmene, og feste den på plass med de to settskruene fra toppen (Fig. 2B og fig 5D-E).
- Skru de fire klemmer på klemmefeste og hell PDMS (forholdet 1:20) ved hjelp av en disponibel transfer pipette ved grenseflaten mellom substratet og den rillete sylindriske del av klemmene. Spre uherdet PDMS rundt rillet sylindriske delen ved hjelp av en 1,5 mm sekskantnøkkel.
- Hell PDMS (1:20) inn i sporene til det er helt fylt ved kapillærvirkning og kurere monteringen ved 80 ° C i 2 timer (figur 5F).
- Seeding Celler på Membrane
- Air-plasma godbit (30 sek på 30 W) hele forsamlingen til å sterilisere og functionalize underlaget for å tillate kollagen belegg.
- Functionalize område av substratet hvor cellene blir sådd med 1 ml 0,02 M eddiksyre supplert med 16 ug / ml rotte-hale kollagen ved romtemperatur i 1 time. Den ønskede endelige kollagen tetthet er 5 mikrogram / cm 2.
- Skyll underlaget 3 ganger med fosfatbuffer og la det tørke ved romtemperatur i minst 10 min.
- Legg 40 mL av kulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin inneholder 2000 celler i senterdelen av substratet for å dekke et område på 1 cm 2 (celle-densitet: 20 celler / mm 2). Celletettheten kan bli endret i henhold til forsøks krav.
- Sett hele sammenstillingen i en standard cellekulturinkubator med substratet som vender opp med slipp av kulturmedium inneholdende celler på den. MERK: Forsamlingen må holdes med underlaget vendt opp i minst 3 timer for å tillate celler å festes skikkelig. For å unngå fordampning, blir 30 pl av varmt kulturmedium lagt inn i dråpe på substratet hvert 45 min i 3 timer.
- Etter 3 timer, vende hele sammenstillingen inn i en petriskål fylt med ferskt kulturmedium for å senke underlaget og inkuber over natten for å tillate celler å formere seg.
- Den neste dag, klar HEPES-bufret saltløsning (HBSS, 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 0,8 mM MgSo4, 1,8 mM CaCl 2, og 11,1 mM av dextrose). Juster pH-verdien til 7,4. MERK: HBSS-løsningen skal være fremstilt daglig og oppbevares ved 37 ° C under forsøkene. Denne fysiologisk oppløsning brukes til å opprettholde celler på objektbord ved å etterligne den normale vev / blod-miljø.
- Monter set-up på omvendt fase kontrast eller fluorescerende mikroskop Mount klemmen-substrat montering på BAXS plattform og motorer. Fyll petriskål inne i petriskål ovn med HEPES buffer (figur 2D).
2. Stivhet Måling av Small Caliber Vessels
- Forberedelse
- Krebs fysiologisk oppløsning: Fremstill en løsning av 118,1 mM NaCl, 11,1 mM D-glukose, 25 mM NaHCO3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSo4, 1,2 mM KH PO 2 til 4, og 2,5 mM CaCl 2. Juster pH til 7,4 og oxygenate løsning med carbogen medisinsk gass (95% O 2/5% CO2) i 30 min. MERK: Krebs solutiden må fremstilles hver dag og holdt ved 37 ° C under forsøkene. Denne fysiologisk oppløsning brukes for å opprettholde den levende vev ved å etterligne den normale vev / blod-miljø.
- Samle instrumentering for disseksjon og mekanisk vurdering av aorta fartøy: kirurgisk saks, bøyde pinsett, mikro-saks, kirurgisk dissekere mikroskop, 50 ml polypropylen sentrifugerør, og 10 ml serologiske pipetter. Den kirurgiske og eksperimentere prosedyren ikke krever noen sterile forhold. Monter klemmene av BAXS plattformen sammen med belastningscellen på forhånd.
- Tissue Isolering og Dissection
Alle eksperimentelle prosedyrer som involverer forsøksdyr må godkjennes av Animal Care og bruk komité brukernes institusjon, som er i samsvar med Helse Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i brukernes landet.- Utfør mus eutanasi med inhalasjon av 99% CO 2 (7 psi)i et pleksiglasskammer (figur 6A).
- Åpen mus magen og kutte thorakalaorta å blø musen.
- Fjern mellomgulvet, brystkassen og lungelapper (figur 6B). MERK: For å minimere risikoen for skade på vev, holde hjertet festet til aorta og unngå å berøre skipet direkte, men manipulere den ved hjelp av hjertet.
- Fjern hjerte, aorta roten og den torakale aorta ved forsiktig å skjære mellom fartøyet og ryggraden. MERK: Ikke frem noen forlengelse i fartøyet under excision å holde den indre strukturen i vevet intakt (figur 6C).
- Umiddelbart nedsenkes og holde hjertet og aorta i Krebs-løsning.
- Klipp og nøye vask aorta i Krebs-løsning for å fjerne eventuelle blodpropper. Fjern bindevev via mikro saks, pinsett og kirurgisk dissekere mikroskop (Figur 6D-E). MERK: Oppbevar alle fartøyets lengde og bruke aortic roten for å bestemme fartøyets orientering.
- Vessel Dimension Fastsettelse og Montering
For å bestemme stivheten av fartøyet, blir losset fartøyets dimensjoner som kreves og kan bestemmes med et kalibrert mikroskop.- Skjær en aorta-ring på omtrent 2 mm i lengde, og nøyaktig måling av dens lengde ved hjelp av et kalibrert mikroskop innstilling (figurene 6F-G). Sett dette segmentet til side i Krebs løsning.
- Skjær annen aorta ringen så liten som mulig mellom hver av de 2 mm segmenter (figur 6F). Sett denne lille segment på et objektglass med lumen vendt opp og måle veggtykkelse ved hjelp av et kalibrert mikroskop innstilling (fig. 6H).
- Fyll petriskål på BAXS plattform med Krebs løsning og sette inn 2 mm aorta ring segment på slepebolt (innfelt i Figur 4C).
ge = "always"> 
Figur 5. PDMS substrat fabrikasjon og. Feste) Etter herding, blir substratet nøye skrelles av SU-8 2050 mugg og satt til side i en petriskål. B) Forankrings egenskaper laget av PDMS og hjelpe til å sikre substratet på klemmer. C) Substrat med forankring egenskaper klar for montering. D) Substratet er montert på de fire klemmer, som deretter blir montert på klemmeholderen (se innfelt). E) detaljert bilde av substratet som er montert på de fire klemmer. K ) Fremgangsmåte for å helle PDMS i sporet på undersiden av substratet. Pilen viser PDMS sakte fylle sporet av capillarity.
454fig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 6. Fremstilling og isolering av torakal aorta. A) fremstilling av kirurgiske instrumenter og avlives musen. B) gjennom en langsgående abdominal innsnitt, blir brystkassen og lunge lobs fjernet. C) Aorta ble forsiktig fjernet ved hjelp av hjertet for å manipulere vevet. D) Hjertet og aorta blir satt i Krebs fysiologisk oppløsning. Aorta blir renset ved å fjerne alle bindevev. E) Detaljert bilde som viser hjerte og aorta. F) Aorta segment som brukes for vurdering stivhet sammen med små segmenter som benyttes for tykkelsesmåling. GH) Den nøyaktige lengde (G) og tykkelsen (H) på hvert fartøy er evaluert ved å bruke et inverst mikroskop og et analyseprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cell Stretching
Den BAXS plattformen ble brukt til å undersøke den mekaniske responsen av kjernene i enkelt mus myoblast-celler (C2C12) som utsettes for et substrat deformasjon på 25%. Myoblast celler er funnet i muskelvev og er stadig utsatt for mekanisk strekk og kompresjon in vivo. Formen og mekaniske egenskapene til cellekjernen har vist seg å spille en viktig rolle i reguleringen av genekspresjon og transkripsjonelle aktivitet 20,21, og også i en rekke utviklingsdefekter og sykdommer som Hutchinson-Gilford progeria syndrom (HGPS), Emery -Dreifuss muskeldystrofi (EDMD), dilatert kardiomyopati, for tidlig aldring og kreft 22-25. Derfor forstå hvordan krefter fra det ytre mekanisk mikromiljøet påvirker struktur og funksjon av kjernen er av ekstrem interesse. Den BAXS plattformen ble brukt til å undersøke overføring av makt fra mi croenvironment til kjernen ved å strekke substratet parallelt med dens større eller mindre akse. Figurene 7A-F illustrerer egenskapene til plattformen for å fremkalle en deformasjon i underlaget langs to ortogonale retninger. Dessuten kan BAXS plattformen induserer komplekse belastningsskader felt i underlaget i tillegg til standard uniaxial av Equi-biaksiale belastning felt. Figurene 7G-H illustrerer fleksibiliteten i uavhengig kontroll av belastningen feltet langs to ortogonale retninger, slik at vi kan enten produsere en standard (kompresjons) eller ren (ikke-trykk) uniaksial strekkfeltet. Den BAXS plattformen er i stand til å produsere en ren uniaksial strekkfelt ved svakt å trekke substratet i retning vinkelrett på hovedretningen strekker seg (figur 7G) for å kompensere for kompresjon til stede i substratet langs denne retning under en standard uniaksial strekk (figur 7H ).
ntent "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 7. Displacement-deformasjon relasjoner fra å utføre standard og ren uniaxial stretching. AB) Fluorescent perler velges manuelt på den første rammen i videoen og spores fra ett bilde til det andre inntil maksimal strekning er nådd langs den horisontale (C) og vertikal (D) retninger. En MATLAB script beregner automatisk komponentene i den grønne strekk tensoren for hver ramme og gir en kalibreringskurve av stammen i forhold til motoren 27. forskyvninger. EF) De blå og røde linjer tilsvarer den del av det grønne strekk tensor langs den horisontale og vertikale retninger hhv. G) Stretching samme substratet ved 4 mm langs x-aksen og svakt strekker seg langsy-aksen med 1,5 mm (uthevet i rødt) produserer en ren uniaxial felt uten trykkuregelmessigheter i underlaget. H) Stretching substratet langs x-aksen ved 3,5 mm frembringer en deformasjon på 25%, og en trykk deformasjon av 7% når endene av substratet langs de vertikale akser er faste (uthevet i rødt).
Med muligheten til å opptre live-cell mikros bildebehandling under strekk, ble kjerner farget med en live-celle fluorescerende fargestoff, som binder seg til DNA (Hoescht 33342). Generelt, C2C12-celler har elliptiske atomkjerner med et større og mindre akse. Først ble cellene identifisert i hvilke de større eller mindre atom akser var orientert parallelt med den horisontale strekking retning. På dette tidspunkt ble cellene strukket med 25% langs hver ortogonal strekker akse mens skaffe bilder av den udeformerte og deformert kjerne mellom hver strekker sykluser (figurene 8A-I). På denne måte kan vi vurdere deformerbarhet av kjernenlangs aksene under en nøyaktig kontrollert substrat deformasjon. Ovuscule, en ImageJ plugin, ble brukt til å bestemme lengden på de store og små atom akser. Disse lengder ble registrert i løpet av den ikke-deformerte tilstand, og når kjernen ble sekvensielt strukket langs dens større og mindre akser (figurene 8G-I). For å beregne den deformasjon av kjernen langs dens små og store akser, ble den relative endringen i lengde langs hver akse i strukket og med feilfrie tilstander beregnet:
hvor ε er deformasjonen, L 1 det deformerte lengde og L 0 er den udeformerte lengde.
Deformerbarheten av kjernene i C2C12 oppviser en mekanisk anisotropi som det viser en betydelig høyere formbarhet langs den lille aksen (6,3 ± 1,1%) i forhold til dens hovedakse (3.077, 0,6%) (figur 8J). I tillegg har vi også undersøkt hvilken rolle aktin og mikrotubuli cytoskjelettet i å regulere atom formbarhet. Dette ble oppnådd ved depolymerisering av aktin filamenter eller mikrotubuli selektivt ved hjelp av cytokalasin D og nocodazole hhv. Depolymerisering av aktin filamentene eller mikrotubuli ble funnet å indusere et tap av den anisotropiske deformasjonsegenskaper av kjernen (figur 8J). Disse resultatene støtter funnene at cytoskeletal komponenter overfører krefter til kjernen fra underlaget, og er også viktig for å bevare den naturlige mekaniske oppførselen til kjernen under deformasjonen 25.
Figur 8. Stretching protokollen og atom formbarhet. AC) Skjematisk illustrasjon av stre tching protokollen for en enkelt celle med sin kjerne orientert horisontalt. Bilder fase kontrast (DF) og epi-fluorescerende bilder (GI) i en celle farget med DNA-spesifikke fluorescerende fargestoff. Denne bildesekvens illustrerer en typisk celle som strekker eksperiment hvor den samme cellen er utsatt for deformasjon ortogonale felt. Scale barer er 25 mikrometer. J) C2C12 viser anisotropisk atom deformasjonsevne med den mindreårige aksen deformeres betydelig mer enn den store aksen. I aktin-eller microtubule-fratatt celler (Cyt-d og nocodazole, henholdsvis), forsvinner dette anisotropi. I alle forhold, nucleus deformasjoner er vesentlig forskjellige fra null under et substrat deformasjon på 25%. ** P-verdi <0,01, paret t-test. † † p-verdi <0,01, † † † p-verdi <0,001, ett-utvalgs t-test.
Vessel Stivhet Assessment
t "> Nylig har vår gruppe undersøkte effekten av kronisk over-ekspresjon av Heat Shock Protein-27 (HSP27 o / e) på dannelsen av plakk i aorta en aterosklerose utsatt musemodell (apoE - / -). 26. Vi viste at HSP27 fungerer som en atheroprotective protein som reduserer plakk lipid og makrofag overflod og øker intimal glatte muskelceller og kollagen innhold (Tall 9A-B). For å fastslå effekten av dette histologisk ombygging på fartøyets mekaniske egenskaper, ble BAXS plattformen som brukes å måle aorta stivhet.Figur 9C viser en typisk spennings-tøyningskurve fra strekk-strekking av en aorta-ring. For å kvantifisere stivhet, ble den inkrementelle modulus beregnet fra stress-belastningskurver ved en deformasjon på 30%. Stivheten er helningen til tangenten til kurven. Ved å innføre en veiecelle på en av de BAXS plattform motorer, samtidig oppkjøp av displacement og styrkedata er mulig. Den forskyvning-force kurver ble omgjort til stress-belastning kurver basert på de feilfrie dimensjoner av hver aorta ringen. Stress og belastning er beregnet ved hjelp av følgende formel:
hvor ε er deformasjonen, L 1 det deformerte lengde, L 0 er den udeformerte lengde, s er stress, F er kraften, og A 0 er den udeformerte område av vevet under lasting. I det spesielle tilfelle av et aorta ring, er den ikke-deformerte område (A 0) to ganger tykkelsen av de ring ganger lengden av segmentet.
Hver prøve ble deformert syklisk med en maksimal deformasjon på 40% ved en forskyvningshastighet på 50 mikron / sek for 12 sykluser med de første 11 sykluser slik prekondisjonering av vev og last en for datainnsamling. Vi fant ut at stivheten i aorta segmenter av APOE - / - HSP27 o / e muse (62,8 ± 3,0 kPa) var signifikant økt med 41% sammenlignet med APOE - / - kontroll mus modell (44,4 ± 3,8 kPa) (figur 9D) .
Tatt sammen, mekanisk vurdering kombinert med fartøyet og plakk histologi viste at over-ekspresjon av HSP27 er karakterisert ved økt fartøy stivhet og kollagen / glattmuskelcelle-innhold. Disse resultatene tyder på at HSP27 kunne potensielt øke stabiliteten av aterosklerotiske lesjoner og dermed redusere risikoen for plaque ruptur.
Figur 9. Effekt av HSP27 over-uttrykk på fartøy stivhet. Vi viste at HSP27 endret histologisk composetningen av ateroskleroselesjoner ved å øke intimale glatte muskelceller (A: anti-α-SMA) og kollageninnhold (B: picrosirius rød flekk) C) Typisk spennings-tøynings-kurven oppnådd fra strekking av en aorta skar hvor stivhet er beregnet ved 30. % av belastningen. . Stivheten er helningen på tangenten (rød linje) til kurven D) Kronisk overuttrykk av HSP27 øker fartøy stivhet i forhold til kontroll apoE - / - mus modell (D). Skala stolpene i (A) og (B) begge er 40 mikrometer og 400 mikrometer i innfellinger. L = lumen, I = intima, stiplede linjer skisserer media. * P-verdi <0,05, enveis ANOVA. *** P-verdi <0,001, enveis ANOVA. Figur tilpasset fra arbeidet med Cuerrier et al 26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den BAXS plattform som presenteres her muliggjør tallrike eksperimenter i studiet av mechanobiology, fra undersøkelser av enkeltceller til hele vev. I tillegg er plattformen svært fleksibel og konfigurerbar, slik at for en rekke mekaniske stimulering eksperimenter og multi-aksial strekkprøving. Plattformen muliggjør også vedlikehold av celler og vev i fysiologiske betingelser, og gir mulighet for samtidig mikroskopi under strekkforsøk. De to forsøkene som er beskrevet i forrige avsnitt viser allsidigheten til BAXS plattformen når du bruker et skikkelig sett med festeklemmer. En modulbasert og kan tilpasses prøvemonteringssystem, optisk tilgang og mulighet til å legge til flere sensorer (for eksempel en last celle), åpner opp mange muligheter for flere typer eksperimenter som skal utføres.
Protokollen presentert ovenfor inneholder mange viktige skritt som må utføres endequately for å produsere de beste resultatene. Innenfor cellen strekker protokollen, montering av PDMS substratet videre til klemmene krever delikat og nøyaktig manipulasjon. Den PDMS substratet må være vel sentrert i forhold til de fire klemmer for å unngå uønskede sideveis bevegelser av substratet under strekking. Slike sidebevegelser kan gjøre sporing av cellene vanskelig under strekking eksperimenter. Dessuten er det viktig å kontrollere fordampningen av slipp av kulturmediet i løpet av celle seeding når substratet er vendt opp i inkubatoren. Avhengig av hvor ofte inkubatoren døren åpnes i løpet av prosessen, kan fordampingen endre. Innenfor karet strekker protokollen, er det mest kritiske trinn ved måling av dimensjonene av prøven som skal testes. Disse dimensjonene må være så nøyaktig som mulig når de er involvert i beregningen av vevet stivhet og derfor ha en direkte innvirkning på resultatene. Etter å ha samme person utføre fartøy dimension målingene vil hjelpe til å redusere variasjonen mellom prøvene.
Fabrikasjon av klemmene som brukes til å trekke på PDMS underlaget under celle strekker eksperimenter omfattet flere utviklingssykluser. Den første versjon av klemmene ikke har et forankringsspor som ligger på bunnen av de sylindriske deler (figur 2B). Uten dette sporet, substratet gled langs den sylindriske del, som induserer en betydelig variasjon i substratet deformasjon over tid. Med tilstedeværelse av sporet, og tilsetning av herdede PDMS (figur 5F), substratet ikke lenger glir. Det eksperimentelle oppsettet frembringer en konstant deformasjon i substratet over tid. For vev som strekker eksperimenter, å velge den riktige lastcelle er også svært viktig. Den lastcelle som er brukt her har en lav belastningsområdet (inntil 150 g), noe som er tilstrekkelig for de prøvene som ble testet her. Den svært følsomme veiecelle som kreves for tiltakuring trekke styrkene på små prøver besatt en relativt lav signal til støy (s / n) ratio. For å forbedre S / N-forhold, og dermed forbedre oppløsningen ble belastningscelle er elektrisk isolert fra svingspole-motor og noen metalldeler ved hjelp av skruer og avstandsstykker av plast. På denne måte kan et høyt S / N-forhold med en oppløsning på 0,03 g ble oppnådd. For mykere prøver, er bruken av et nedre område lastcelle som anbefales for å opprettholde høy oppløsning.
For tiden, er den viktigste begrensning av BAXS plattformen evnen til å utføre langtids strekker eksperimenter på grunn av fordampning av HBSS-buffer over tid. Vann fordampning øker oppløst stoff-konsentrasjon som eventuelt kan ha en effekt på cellene. Med den nåværende konfigurasjonen av BAXS plattform, er det vanskelig å ha et eksperiment som ville mekanisk stimulere celler eller vev over dager som buffer i hvilken cellene og vevet er neddykket må være kompletteres ented med væske over tid. I den gjeldende innstilling, er fordampningshastigheten ca 0,9 ml / time fra en opprinnelig volum på 25 ml HBSS-buffer-løsning. Den aktuelle innstillingen er ideell for kortvarige forsøk. For å utføre pålitelig celler og vev som strekker eksperimenter over lenger tidsperioder, er to tilsetninger foreslått: 1) En fluidic system for å opprettholde buffervolum, og 2) tilsetning av en kommersiell eller hjemmeinne inkubator kammer omslutter hele systemet for å opprettholde konstant fuktighet og temperatur og gi en 5% / 95% CO 2 / luftatmosfære. Når det gjelder muligheten til å strekke vaskulære vev, oppsettet beskrevet ovenfor tillatt oss å måle stivhet av mindre kaliber fartøy. Det er viktig å benytte pinner med en passende diameter for å sikre at de ikke vil deformeres under strekk, men er små nok til å passe inn i fartøyet lumen. Ikke ta denne detaljen hensyn kunne innføre unøyaktighet i den målte deformasjon av vev.
ve_content ">In-vivo, er vev-embedded celler utsatt for mekaniske krefter og påkjenninger som varierer både i tid og rom, men enda viktigere er de ofte multi-aksial. Et godt eksempel er den mekaniske oppførsel av blodkar vegger som reaksjon på hemodynamiske krefter. Kombinasjonen av lokale hemodynamiske krefter 28-30 med de anisotropiske egenskapene til vaskulære vev 13,14,16,27 resultere i en kompleks mekanisk mikromiljøet, noe som eksponerer endotelceller og vaskulære glatte muskelceller til komplekse multi-aksielle og syklisk belastning felt. Selv om eksisterende celle strekker eksperimenter har i stor grad bidratt til den grunnleggende forståelsen av mechanotransduction og mechanobiology, har de tradisjonelt støttet seg på idealiserte enaksete eller equi-biaksiale belastningsskader felt som ikke reproduserer komplekse in vivo belastningsskader felt 8-10,19,29,31-34 . Den BAXS plattformen tillater anisotropisk biaksiale celle strekker med samtidig levende-cell mikroskopi. Evnen til å kontrollere deformasjonen av substratet langs to ortogonale retninger gjør det mulig å ha full kontroll over strekkfeltet. Dette muliggjør produksjon av komplekse belastningsfelt i tillegg til enkle uniaksiale og konta-biaksial strekkfelt. Videre tillater plattformen oss til dynamisk å endre retningen av strekkfelt innenfor den samme strekking eksperimentet.
Muligheten for å integrere en modulær og tilpasset spennsystemet åpner opp muligheten for mange programmer i celle mechanobiology og vev mekanikk ved hjelp av en enkelt strekker plattform. For eksempel, med riktig oppspenningssystem 13,27, kan denne plattform utføre plane uniaksial og biaksial strekkprøving av biologiske vev. På denne måte kan de mekaniske egenskapene til en hvilken som helst vev, skåret i en rektangulær eller kvadratisk form, kan kvantifiseres langs to ortogonale akser i et enkelt eksperiment. I tillegg utfører histologisk ennalyses etter mekanisk stimulering kan avsløre stretch-indusert strukturelle endringer i vev. Torsion er også en svært viktig form for mekanisk belastning for muskler og leddbånd 35. Denne plattformen gir mulighet for å utforme et klemmesystem som kunne indusere en rotasjon rundt aksen strekker seg for å produsere en combinatory mekanisk belastning som omfatter torsjon og spenning. Det er også mulig å vurdere større kaliber fartøy med passende festepinnene. Studerer cellulære responser etter mekanisk deformasjon er også under intens etterforskning. Den BAXS plattformen har en unik egenskap ved retningsendring og kompleksiteten i strekkfeltet innenfor det samme eksperiment i tillegg til at for samtidig avbildning. Viktigere, multimodale former mikros fremdeles er mulig, som plattformen ikke påvirker den optiske akse av mikroskopet. Dette er en viktig funksjon som de strukturelle og biokjemiske lever-celle responser til mekanisk deformation kan måles. Til sammen besitter BAXS plattformen utformingen flere viktige funksjoner som forenkler bruken for enkelt celle og hele vev eksperimenter. Ved å benytte en modulær klemmesystem og tilsetning av opp til fire mulige lasteceller, kan BAXS plattformen skal anvendes for en rekke eksperimenter. Denne artikkelen viser detaljer om to eksempler på eksperimenter; men modularitet og fleksibilitet av systemet kan videre utnyttes til å undersøke mange ulike aspekter av mechanobiology på sub-cellulære, cellulære og hele vev lengdeskala.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
DT ble støttet av en postdoktor studieplass fra le Fonds de recherche du Quebec-Nature et Technologies (FQRNT) og en MITACS Elevate Strategic Fellowship. CMC ble støttet av en postdoktor studieplass fra le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) og Ernest og Margaret Ford kardiologi begavet stipendiat ved Universitetet i Ottawa Heart Institute. EOB ble støttet av driftstilskudd MOP80204 fra Canadian Institute for Health Research (CIHR) og T6335 from the Heart og Stroke Foundation of Ontario. Den CIHR og Medtronic kollektivt gi EOB med en peer-reviewed Research Chair (URC # 57093). AEP er finansiert av naturvitenskap og Engineering Research Council (NSERC) Discovery Grant, en NSERC Discovery Accelerator Supplement og erkjenner takknemlig støtte fra Canada Research Stoler (CRC) program og en tidlig Forsker Award fra provinsen Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | The ratio base to cross-linker used in this protocol is 20:1. Mix in a laminar hood to keep dust from contamining your |
| FluoSpheres fluorescent microspheres | Invitrogen | F8810 | Keep away from light. |
| Linear voice coil | Moticont | LVCM-051-051-01 | The motro comes in two pieces (magnet and coil). It has to be mounted on a ball bearing sytem to be functional. |
| Ball bearing slide | Edmund Optics | NT37-360 | Miniature and Small Linear Motion Ball Bearing Slides |
| Linear positioning stage | Edmund Optics | 38-960 | Center Drive 1.25" Square Linear Translation Stages |
| Optical encoder | GSI microE systems | Mercury II 1600S - 0.5um resolution | reflective incremental encoder. |
| Motion controller | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440 | 4 axis controller with a 4 axis amplifier |
| Load cell | Honeywell | 31 low | miniature load cell with a range of 0-150 g |
| Insect minutiens pins (0.20 mm) | Pin Service Austerlitz Insect pins | Stainless steel pins that are bended in an opened triangle shape | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Permanent epoxy negative photoresist. Keep away from heat and light |
| Air-plasma treatment system | Glowresearch | Autoglow Oxygen Plasma System | |
| Rat-tail collagen | Invitrogen | A10483-01 | Collagen I, Rat Tail 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | DNA-specific fluorescent dye. Keep in the fridge. |
| Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters | omega.ca | KHLV-0504/(10)-P | 28 V flexible heaters; can be supplied with a 24 V |
| 1/16 DIN Autotune Temperature and Process Controllers | omega.ca | CN63200-R1-LV | Temperature controller; supply 24 V. |
| DMEM culture medium | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco’s Modified 30 Eagle Medium. Keep at 4 °C |
| Penicillin-Streptomycin | Hyclone | SV30010 | Keep stock frozen. Keep working solution at 4 °C. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Keep frozen. |
| Trypsin 0.05% | Hyclone | SH30236.02 | Keep frozen. Digestion of cell attachement proteins for subcultivation |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | HEPES-buffered salt solution |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | HEPES-buffered salt solution / Krebs physiological solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Krebs physiological solution |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Krebs physiological solution |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Krebs physiological solution oxygenation |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | Microtubules depolymerization agent |
| Cytochalasin-D | Sigma | C8273 | Actin filaments depolymerization agent |
| Anti-α-SMA-FITC | Sigma | F3777 | Used to stain and quantify smooth muscle cells content |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Used to stain and quantify collagen content |
References
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
- Ingber, D. E.
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. J Cell Sci. 124, 9-18 (2011).
- Bukoreshtliev, N. V., Haase, K., Pelling, A. E. Mechanical cues in cellular signalling and communication. Cell Tissue Res. 352, 77-94 (2013).
- Chen, Y., Pasapera, A. M., Koretsky, A. P., Waterman, C. M. Orientation-specific responses to sustained uniaxial stretching in focal adhesion growth and turnover. Proc Natl Acad Sci USA. 110, (2013).
- Rosenzweig, D. H., Matmati, M., Khayat, G., Chaudhry, S., Hinz, B., Quinn, T. M. Culture of Primary Bovine Chondrocytes on a Continuously Expanding Surface Inhibits Dedifferentiation. Tissue Eng Part A. 18, 2466-2476 (2012).
- Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 19943-19948 (1994).
- Steward, R., Cheng, C. M., Ye, J., Bellin, R., LeDuc, P. Mechanical stretch and shear flow induced reorganization and recruitment of fibronectin in fibroblasts. Sci Rep. 1, (2011).
- Wang, D., Xie, Y., Yuan, B., Xu, J., Gong, P., Jiang, X. A stretching device for imaging real-time molecular dynamics of live cells adhering to elastic membranes on inverted microscopes during the entire process of the stretch. Integr Biol (Camb). 2, 288-293 (2010).
- Haskett, D., Johnson, G., Zhou, A., Utzinger, U., Van de Geest, J. Microstructural and biomechanical alterations of the human aorta as a function of age and location. Biomech Model Mechanobiol. 9, 725-736 (2010).
- Duprey, A., Khanafer, K., Schlicht, M., Avril, S., Williams, D., Berguer, R. In vitro characterisation of physiological and maximum elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysms using uniaxial tensile testing. Eur J Vasc Endovasc Surg. 39, 700-707 (2010).
- Tremblay, D., et al. A comparison of mechanical properties of materials used in aortic arch reconstruction. Ann Thorac Surg. 88, 1484-1491 (2009).
- Khanafer, K., Duprey, A., Zainal, M., Schlicht, M., Williams, D., Berguer, R. Determination of the elastic modulus of ascending thoracic aortic aneurysm at different ranges of pressure using uniaxial tensile testing. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 142, 682-686 (2011).
- Van de Geest, J. P., Sacks, M. S., Vorp, D. A. The effects of aneurysm on the biaxial mechanical behavior of human abdominal aorta. J Biomech. 39, 1324-1334 (2006).
- Guolla, L., Bertrand, M., Haase, K., Pelling, A. E. Force transduction and strain dynamics in actin stress fibres in response to nanonewton forces. J Cell Sci. 125, 603-613 (2012).
- Wang, J. H., Goldschmidt-Clermont, P., Wille, J., Yin, F. C. Specificity of endothelial cell reorientation in response to cyclic mechanical stretching. J Biomech. 34, 1563-1572 (2001).
- Jungbauer, S., Gao, H., Spatz, J. P., Kemkemer, R. Two characteristic regimes in frequency-dependent dynamic reorientation of fibroblasts on cyclically stretched substrates. Biophys J. 95, 3470-3478 (2008).
- Dahl, K. N., Ribeiro, A. J. S., Lammerding, J. Nuclear shape, mechanics, and mechanotransduction. Circ Res. 102, 1307-1318 (2008).
- Shivashankar, G. V. Mechanosignaling to the cell nucleus and gene regulation. Annu Rev Biophys. 40, 361-378 (2011).
- Chiquet, M., Gelman, L., Lutz, R., Maier, S. From mechanotransduction to extracellular matrix gene expression in fibroblasts. Biochim Biophys Acta. 1793, 911-920 (2009).
- Sullivan, T., et al. Loss of A-type lamin expression compromises nuclear envelope integrity leading to muscular dystrophy. J Cell Biol. 147, 913-920 (1999).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Tremblay, D., Andrzejewski, L., Leclerc, A., Pelling, A. E. Actin and microtubules play distinct roles in governing the anisotropic deformation of cell nuclei in response to substrate strain. Cytoskeleton. , (2013).
- Cuerrier, C. M., et al. Chronic over-expression of heat shock protein 27 attenuates atherogenesis and enhances plaque remodeling: a combined histological and mechanical assessment of aortic lesions. PLoS ONE. 8, (2013).
- Tremblay, D., Cartier, R., Mongrain, R., Leask, R. L. Regional dependency of the vascular smooth muscle cell contribution to the mechanical properties of the pig ascending aortic tissue. J Biomech. 43, 2448-2451 (2010).
- Barker, A. J., Lanning, C., Shandas, R. Quantification of hemodynamic wall shear stress in patients with bicuspid aortic valve using phase-contrast MRI. Ann Biomed Eng. 38, 788-800 (2010).
- Haga, J. H., Li, Y. S. J., Chien, S. Molecular basis of the effects of mechanical stretch on vascular smooth muscle cells. J Biomech. 40, 947-960 (2007).
- Frydrychowicz, A., et al. Time-resolved magnetic resonance angiography and flow-sensitive 4-dimensional magnetic resonance imaging at 3 Tesla for blood flow and wall shear stress analysis. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 136, 400-407 (2008).
- Boccafoschi, F., Mosca, C., Bosetti, M., Cannas, M. The role of mechanical stretching in the activation and localization of adhesion proteins and related intracellular molecules. J Cell Biochem. 112, 1403-1409 (2011).
- Yang, G., Crawford, R. C., Wang, J. H. C. Proliferation and collagen production of human patellar tendon fibroblasts in response to cyclic uniaxial stretching in serum-free conditions. J Biomech. 37, 1543-1550 (2004).
- Goldyn, A. M., Rioja, B. A., Spatz, J. P., Ballestrem, C., Kemkemer, R. Force-induced cell polarisation is linked to RhoA-driven microtubule-independent focal-adhesion sliding. J Cell Sci. 122, 3644-3651 (2009).
- Heo, S. J., et al. Fiber stretch and reorientation modulates mesenchymal stem cell morphology and fibrous gene expression on oriented nanofibrous microenvironments. Ann Biomed Eng. 39, 2780-2790 (2011).
- Zdero, R., et al. Linear and torsional mechanical characteristics of intact and reconstructed scapholunate ligaments. J Biomech Eng. 131, (2009).
