Summary
Tratamento de osteoblastos primários de rato com ácido retinóico produz uma população homogênea de células ramificadas que carregam características morfológicas e moleculares de osteócitos. O método supera a dificuldade de obtenção e manutenção de osteócitos primárias em cultura, e pode ser vantajosa para o estudo de células derivadas de modelos transgénicos.
Abstract
A necessidade de culturas osteócitos é bem conhecido para a comunidade de pesquisadores de osso; isolamento de osteócitos primário é difícil e produz números de celular de baixa. Portanto, o sistema celular mais extensamente utilizado é a linha de células MLO-Y4-osteócito semelhantes.
O método aqui descrito refere-se à utilização de ácido retinóico para gerar uma população de células homogéneas ramificadas com características morfológicas e osteócitos moleculares.
Após o isolamento de osteoblastos de calvárias de ratinho, o ácido all-trans retinóico (ATRA) é adicionado ao meio celular, e monitorização celular é conduzida por dia, sob um microscópio invertido. Primeiros alterações morfológicas são detectáveis após 2 dias de tratamento e diferenciação está geralmente completa em 5 dias, com o desenvolvimento progressivo de dendrites, a perda da capacidade para produzir matriz extracelular, a infra-regulação de marcadores de osteoblastos e a sobre-regulação de moléculas específicas de osteócitos.
conteúdo "> monitoramento de células diária é necessária devido à variabilidade inerente de pilhas, eo protocolo pode ser adaptado com variação mínima de células obtidas a partir de diferentes linhagens de camundongos e aplicadas a modelos transgênicos.O método é fácil de realizar e não requerem instrumentação especial, que é altamente reprodutível, e rapidamente gera uma população osteócito madura em completa ausência de matriz extracelular, que permite a utilização destas células para aplicações biológicas ilimitadas.
Introduction
Osteócitos, o tipo de célula mais abundante do osso, são terminalmente diferenciados, células altamente ramificados profundamente situadas dentro do esqueleto. O corpo celular de osteócitos maduros estão contidas em lacunas de osso e têm diversas formas; osteócitos com corpos celulares alongados são encontrados no osso cortical, enquanto osteocytes arredondadas são mais freqüentes no osso trabecular 1. Dendritos ramificados estender a partir do corpo celular e residem em pequenos canais chamados canalículos, formando uma intrincada rede que faz com que vários contatos não só com outros osteócitos, mas também com outros tipos de células do osso, medula óssea, vasos sanguíneos e pericitos associados. Através do fluido intersticial contido nas lacunas e canalículos, osteócitos estão também em última análise, ligado ao sistema de circulação, pelo que pode influenciar não só local, mas também efeitos sistémicos, e vice-versa, o seu comportamento pode ser regulada por ambas as alterações locais e sistémicas 2.
Oestudo de osteócitos recentemente ganhou impulso, graças a uma série de avanços técnicos, tais como a geração de-tecidos e animais transgénicos específicos de células, a utilização de técnicas de microscopia potentes e de rastreio molecular de alto rendimento 3,4. No entanto, o conhecimento destas células ainda é incompleta, principalmente devido à escassez relativa de adequada em modelos in vitro. Na verdade, osteócitos sempre foram difíceis de obter e manter na cultura devido à localização profunda, e ao baixo nível de proliferação que caracteriza esse tipo de célula diferenciada.
Ao longo dos anos, um número de métodos tem sido desenvolvida para isolar osteócitos primário 5-7, embora eles geralmente produzem rendimentos celulares baixas e comporta o risco de que mesmo poucos fibroblastos contaminantes irá cobrir rapidamente osteócitos 8. Por esta razão, a maior parte do trabalho experimental in vitro tem sido realizada até agora para a célula osteócito bem estabelecida line MLO-Y4 9.
Metodologias in vitro adicionais podem aumentar a possibilidade de estudar essas células e pode melhorar a análise da biologia osteócito e fisiopatologia. Para ser amplamente adotada, tais métodos devem ser fáceis de reproduzir, e não exigiria instrumentos especiais ou tempos muito longos para alcançar a maturação celular. Mais importante, se for o caso de células primárias, elas tornam possível tirar proveito de animais transgénicos. Descrevemos recentemente que o tratamento de células da linha osteoblástica MC3T3-E1 e em osteoblastos primários com ácido retinóico induz uma mudança de fenótipo rápida que leva ao desenvolvimento de uma população de células homogéneas ramificadas rolamento características morfológicas e moleculares de osteócitos 10.
All-trans ácido retinóico (ATRA) é um produto metabólico ativa da vitamina A, que regula a transcrição de genes pelos receptores de ácido retinóico nucleares (RAR) vinculativo. RARse ligam ao DNA, como heterodímeros com os receptores de retinóide X (RXRs), em última análise conduzindo à modulação de ácido retinóico (RA)-responsivo genes alvo 11. ATRA foi mostrado para modular a diferenciação e maturação de vários tipos de células, entre as quais as outras células ramificadas, tais como as células neuronais e podócitos 12 13.
O método aqui descrito baseia-se na adição de ATRA para osteoblastos primários. Para ser eficaz, a ATRA tem de ser adicionado a uma fase de maturação precisas sobre células plaqueadas a uma densidade definida; em nossa experiência essas condições são fundamentais para obter a chave de fenótipo de osteoblastos para osteócitos.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a regulamentação em vigor da Europa em matéria de protecção dos animais utilizados para fins científicos e foram analisados e aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Milão e Nacional.
1. Isolamento de osteoblastos primários
O método, com modificações menores, segue o procedimento descrito por Dodig et al 14.
- Prepare digerindo médio, por adição de 0,1% de colagenase P e 0,05% de tripsina (a partir de 2,5% de tripsina 10x, sem vermelho de fenol) com meio HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hanks, sem cálcio, magnésio, ou vermelho de fenol).
- Use 3-4 dias os ratos velhos (o processo pode ser aplicado para tão poucos como um ratinho).
- Sacrifício por decapitação. Pulveriza-se a cabeça com etanol a 70% e manter em gelo. Remover as camadas da pele e dos músculos por pinças e dissecação / tesoura cirúrgica.
- Remova cuidadosamente os ossos parietais esepará-las após a sutura sagital, em duas metades. Certifique-se que os ossos são livres de suturas e qualquer tecido aderente e coloque pedaços de ossos individuais em bem-placas contendo meio HBSS até que o processo seja concluído.
- Descartar HBSS e adicionar a cada poço meio de digerir durante 15 minutos a 37 ° C.
- Desprezar o sobrenadante.
- Adicionar mais uma vez o meio para digerir durante 15 minutos a 37 ° C.
- Este tempo de guardar o sobrenadante e colocá-lo em alfa-MEM (Meio Essencial Mínimo) suplementado com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino) e 1% de estreptomicina / penicilina.
- Repita os passos 1.7 e 1.8 2x.
- Reúnem-se os três fracções recolhidas, as células de rotação por centrifugação a 425 g durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante, adicionar 3 ml de alfa-MEM suplementado para ressuspender o sedimento de células, e transferir para um frasco de 25 cm 2.
- Mude o meio após 24 horas para remover detritos e células mortas.
- Adicionar 50 ug / ml de ácido ascórbico (AA) e 3 mM de gliCerol 2-fosfato de hidrato de sal de dissódio (GP) para o meio alfa-MEM.
- Depois disso, mudar o meio (alfa-MEM mais AA / PG) a cada dois dias.
2. Protocolo ATRA
- Realizar todos os experimentos com ATRA (ácido trans-retinóico), em uma sala escura para evitar a inativação.
- Prepara-se uma solução de tripsina 1X em meio HBSS e manter a 37 ° C até à sua utilização.
- Remova o meio de células confluentes e cuidadosamente lave-os com HBSS.
- Adicionar 1 ml de tripsina, rodar suavemente o frasco para permitir que todas as células a serem cobertas pela tripsina e incubar durante 3 min a 37 ° C.
- Verifique se o desprendimento real de células sob um microscópio invertido.
- Adicionar 3 ml de meio alfa-MEM para inactivar a tripsina.
- Recuperar as células e centrifugar durante 15 min a 425 g.
- Ressuspender o sedimento de células em meio fresco.
- Coloque uma gota de uma câmara de contagem do hemocitômetro, deixar repousar por alguns minutos e contar o cenúmero ll.
- Colocar as células em frascos de 25 centímetros 2 a uma densidade de 10.000 células / cm 2 com alfa-MEM mais AA / GP. Esteja ciente de que a densidade celular é relevante para o melhor desenvolvimento de processos celulares e contatos intercelulares. Uma densidade de partida maior do que 10.000 células / cm 2 prejudica o bom desenvolvimento de processos celulares, mas os números de células mais baixos resultam em morte celular prematura, devido à ausência de contactos intercelulares.
- Adicionar 5 mM ATRA ao meio cada 24 horas.
- Monitorar as células diariamente para avaliar a morfologia: alterações morfológicas são geralmente observadas após 48 horas. Se, após a primeira 24-48 horas, as células estão ainda em proliferação, replate na densidade acima. Uma população homogénea de osteócitos madura está presente após 4-5 dias. Dependendo das necessidades, utilizar as células, em qualquer ponto de tempo, até 12-15 dias.
- Quando as células são colocadas em outros suportes (como lamelas ou bem-placas), certifique-se que a densidade acima é mantido econtinuar a adicionar ATRA cada 24 horas até à sua utilização. Deixar as células a aderir ao novo suporte para, pelo menos, 24 horas antes da experiência.
3. Imunocoloração
- Para imunocoloração, placa das células sobre lamínulas e seguir metodologias estabelecidas (ver, por exemplo Burry 15).
- Por exemplo, por imunofluorescência indirecta, fixar em 4% de paraformaldeído ou acetona fria, sequencialmente incubar com o anticorpo primário, à TA, durante 1 hora numa câmara húmida, em seguida, com o anticorpo secundário marcado com fluorescência, no escuro, à TA, durante 30 min, numa câmara húmida.
- Use DAPI ou análogos para contracoloração nuclear, e montar em meio anti-desbotamento.
4. Alizarin coloração vermelha e Extração
- Placa as células em lamelas.
- Fixar as células imergindo as lamelas com etanol a 70% durante 10 min.
- Cobrir as células com algumas gotas de solução de coloração de vermelho de alizarina (1 mg / ml, pH 5,5)durante 30 min.
- Lave as lamelas com água da torneira. Monte com uma gota de glicerol em lâminas de vidro e tirar fotos usando um microscópio vertical em 10x e 20x de ampliação.
- Após o procedimento acima, recuperar as lamelas por imersão das lâminas em água da torneira.
- Coloque cada lamela em um prato bem.
- Adicionar 60% de ácido perclórico (a quantidade deve ser suficiente para cobrir completamente as células) e deixar de O / N a 4 ° C com agitação suave.
- Leia a densidade óptica do sobrenadante por espectrofotometria a 450 nm de comprimento de onda.
- Para normalizar os valores para o número de células, adicionar Janus verde (solução a 0,2% em PBS) para cobrir a preparação de células durante 10 min.
- Lave cuidadosamente com água ultrapura.
- Adicionar 0,5 N HCl (a quantidade deve ser suficiente para cobrir todas as células) e agitar suavemente com a mão por alguns segundos.
- Leia a absorvância a 615 nm por espectrofotometria.
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Representative Results
Os resultados foram obtidos 5-10 experiências independentes.
Morfologia celular
AA / GP tratado pilhas têm características principalmente de paralelepípedos-like, característica dos osteoblastos maduros. Células ramificadas intercaladas (conforme indicado pelas setas vermelhas na Figura 1A) pode ser encontrado, o que provavelmente representa cerca de osteócitos.
Com o tratamento com ATRA, as células começam rapidamente visualizadas ramificações, que são geralmente observados após 2 dias. Como mostrado na Figura 1B, as células ramificadas requerem espaço para estender as suas dendrites. Como o tratamento com os rendimentos ATRA ramificações aumentar progressivamente em número e complexidade, Figuras 1C e 1D. Coloração de actina filamentosa por faloidina etiquetada com rodamina destaca processos celulares, que são marcadas por faloidina, Figura 2.
Matrix Produção
<p class = "jove_content"> osteoblastos primários produzir grandes quantidades de matriz calcificada, que se acumula ao longo e entre as células e pode ser visualizado por alizarina coloração vermelha, Figura 3A. Osteócitos não produzem matriz extracelular calcificada, e resultados de coloração vermelho de alizarina completamente negativos em células ATRA-incubadas, Figura 3B. Por conseguinte, nenhum ou uma quantidade mínima de vermelho de alizarina pode ser medida após o processo de extracção, a Figura 3C.Marcadores osteócito e Produtos
Sclerostin é expressa por células tratadas com ATRA, Figura 4. Imunocoloração intensa revela expressão citoplasmática e a presença de pontos positivos ao longo de processos celulares. Por imunofluorescência, uma positividade forte FGF23 é detectável em células tratadas com ATRA, Figura 5, quer no corpo das células, ou ao longo de processos celulares.
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Figura 1. Microscopia de luz. Osteoblastos primários mostram um aspecto cúbico predominante depois de 5 dias de incubação com AA / GP (A) (barra de escala de 100 um). Células ramificadas esparsas podem ser identificados (A) (setas). Após 2 dias de tratamento com ATRA (B) (barra de escala de 100 um), as células exibem uma forma mais alongada e dendritos aparecer claramente detectável. Apenas células arborizadas pode ser observada após 5 dias de incubação ATRA (C) (barra de escala de 100 um), e são melhor detectável em maior ampliação (D) (barra de escala de 50 um).
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Filamentos de actina coloração Figura 2.. Filamentos de actina são identificados por coloração com rodamina-falloidin. A figura mostra um resultado representativo obtido a partir de células tratadas com ATRA durante 3 dias. Já neste ponto de tempo, a actina filamentosa aparece como um dos principais componentes de desenvolvimento de processos celulares. Barra de escala: 50 ^ m.
Figura 3. Depósitos calcificados. Coloração com vermelho de alizarina é difusamente observados em osteoblastos após 5 dias de incubação com AA / GP (A) (barra de escala de 100 mm), enquanto que é negativo em células ATRA-incubadas (B) (barra de escala de 50 um). A profunda diferença pode ser medida pelo SPECTroscopy após extracção alizarina (C).
Figura 4. Sclerostin. Sclerostin positividade é detectada no citoplasma e ao longo de processos celulares de células incubadas com ATRA (barra de escala de 50 um).
Figura 5. FGF23. FGF23 imunocoloração é intensa em células tratadas com ATRA (barra de escala de 50 um).
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Discussion
Nos últimos anos, o osteócito emergiu como a célula mais central do osso. Avanços da pesquisa são progressivamente revelando um número de propriedades osteócitos anteriormente insuspeitas ou não comprovadas, que são de enorme valor para a concepção de novos e melhores tratamentos para uma variedade de doenças ósseas. No entanto, a investigação de biologia osteócito tem vindo a sofrer de disponibilidade limitada de modelos in vitro de tal forma que os osteoblastos têm sido utilizados como substitutos de células ao longo de um longo período antes que a linha de células osteócito-como MLO-Y4 foi disponibilizada. Mais recentemente, uma linha de células imortalizadas condicionalmente foi introduzida pelo mesmo grupo de 16, que podem ser diferenciados para ramificada osteócitos final expressando sclerostin e FGF23. Embora o valor extremo dessas linhas celulares não está em questão, é muito bem conhecido que células primárias assemelham mais a situação vivo e oferecer a possibilidade de obter fr osteocytes primárioanimais transgênicos om para realizar estudos funcionais em vias moleculares específicas.
Isolamento e cultura de osteócitos primárias, primeiro obtidas a partir de ossos de bico 5,6 e subsequentemente a partir de ratos e camundongos 17,7 ossos, são extremamente útil, mas o seu isolamento gera apenas um pequeno número de células por procedimento, e a pureza das células baseia-se em grande medida na experiência individual. Portanto, o método é actualmente utilizado apenas por um número limitado de laboratórios.
Outros grupos de pesquisa obtiveram osteócitos maduros através da indução de diferenciação terminal dos osteoblastos através de incorporação progressiva em matrizes mineralizadas tridimensionais 18,19, que constituem um ambiente mais fisiológica, mas que são um obstáculo para aplicações de pesquisa subseqüentes. É verdade que a mineralização da matriz 20, bem como a baixa tensão de oxigênio 21, são gatilhos fisiológicos de maturação osteócito. No entanto, um methodology evitar estas duas condições pode aumentar a viabilidade e estender o uso das células. O nosso método proposto 10, o qual consiste na adição de ácido retinóico para amadurecer os osteoblastos, é simples e altamente reprodutível, e evita a transfecção de células 22, ou a utilização de factores de crescimento cara 23.
Com uma série de experiências preliminares, determinou-se que o número de células de partida é um passo crítico, condicionamento adequado formação de dendrites múltiplas e contactos intercelulares. A densidade de células muito alta chapeamento afecta complexidade e extensão dos processos celulares, ao passo que os números demasiado baixas resultam em perda de adesões intercelulares, conduzindo a sofrimento e morte celular.
É importante ressaltar que o ajuste de dosagem ATRA e acompanhamento diário da morfologia das células são altamente recomendados, devido à variabilidade inerente de pilhas que podem afetar a sensibilidade de ATRA. Estes aspectos podem tornar-se particularmente relevante when a metodologia é aplicada a modelos transgênicos.
O desenvolvimento de processos de células pode ser monitorizada por coloração com actina, porque os dendritos são ricos em actina filamentosa.
É bem conhecido que os osteócitos não produzem matriz calcificada, e ATRA incubação abole-se rapidamente, como mostrado por uma redução progressiva até negatividade completa de coloração vermelho de alizarina. Enquanto isso, o ATRA induz a expressão de marcadores de osteócitos conhecidos, mais notavelmente sclerostin 24, e assegura a produção de FGF23, um factor de crescimento fundamental envolvido no osso e fosfato sistémica de manuseamento 25. Portanto, mais estudos destinados a investigar o papel funcional de FGF23 e sclerostin em osteócitos será facilitado pela produção endógena dessas moléculas.
Em resumo, que mostra que o tratamento com ácido retinóico, gera uma população homogénea de osteócitos maduros a partir de células de calvária primárias, oRefore permitindo preparação simples e rápida de osteócitos, tanto do tipo selvagem e animais transgênicos. Comparativamente a outros métodos, o nosso protocolo parece apresentar várias vantagens, principalmente a aplicação simples e a elevada reprodutibilidade. O processo de maturação osteócito pode ser estudada em números adequados de células a partir do espalhamento inicial de processos através dos vários passos que podem ocorrer numa armação 5 dias. Como uma vantagem adicional, osteócitos maduros são obtidos na ausência completa de circundante matriz mineralizada, que permite a aplicação de técnicas moleculares e funcionais ilimitadas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O financiamento foi fornecido por "Progetto um concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" para MD, e Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
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