Summary
Die Behandlung der primären Maus Osteoblasten mit Retinsäure erzeugt eine homogene Population von verzweigten Zellen, die morphologischen und molekularen Merkmalen des Osteozyten. Das Verfahren überwindet die Schwierigkeiten bei der Erlangung und Aufrechterhaltung der primären Knochenzellen in Kultur, und kann vorteilhaft sein, Zellen aus transgenen Modellen abgeleitet studieren.
Abstract
Die Notwendigkeit für osteocyte Kulturen ist gut für die Gemeinschaft der Knochenforscher bekannt; Isolierung von primären Knochenzellen ist schwierig und produziert niedrigen Zellzahlen. Daher ist die am meisten verwendete Zellsystem die Osteozyten-ähnliche MLO-Y4-Zelllinie.
Das hier beschriebene Verfahren bezieht sich auf die Verwendung von Retinsäure, um eine homogene Population von Zellen, die mit verzweigten morphologischen und molekularen osteocyte Eigenschaften zu erzeugen.
Nach Isolierung von Maus-Calvaria Osteoblasten, ist all-trans-Retinsäure (ATRA) zur Zellmedium zugegeben und Zellenüberwachung wird täglich unter einem Umkehrmikroskop durchgeführt. Erste morphologische Veränderungen nach 2 Tagen der Behandlung und Differenzierung nachweisbar ist im allgemeinen innerhalb von 5 Tagen vollständig, mit fortschreitenden Entwicklung von Dendriten, Verlust der Fähigkeit, die extrazelluläre Matrix zu erzeugen, die Herunterregulierung der Osteoblastenmarkern und Hochregulierung von Osteozyten-spezifischen Molekülen.
Inhalt "> Tägliche Zellenüberwachung ist wegen der inhärenten Variabilität der Primärzellen benötigt werden, und das Protokoll kann mit minimaler Variation, um Zellen von verschiedenen Mausstämmen erhalten und transgene Modelle angewendet angepasst werden.Das Verfahren ist einfach durchzuführen und erfordert keine spezielle Instrumentierung erforderlich, es in hohem Maße reproduzierbar ist, und erzeugt schnell eine ausgereifte Osteozyten Bevölkerung in vollständiger Abwesenheit von extrazellulären Matrix, was die Verwendung dieser Zellen für unbegrenzte biologische Anwendungen.
Introduction
Osteozyten, die häufigste Knochenzelltyp sind terminal differenzierte, hochverzweigten Zellen tief in das Skelett entfernt. Der Zellkörper der reifen Knochenzellen werden im Knochen Lücken enthalten und haben unterschiedliche Formen; Osteozyten mit länglichen Zellkörper sind in den kortikalen Knochen gefunden, während abgerundete Osteozyten sind häufiger in der trabekulären Knochen ein. Verzweigte Dendriten erstrecken sich vom Zellkörper und befinden sich in winzigen Kanälen Kanälchen genannt, bilden ein komplexes Netz, das mehrere Kontakte nicht nur mit anderen Osteozyten, sondern auch mit anderen Knochenzelltypen, Knochenmark, Blutgefäße und damit verbundene Perizyten macht. Durch die Lücken und Kanälchen in der interstitiellen Flüssigkeit enthalten, sind Osteozyten letztlich auch dem Umlaufsystem verbunden, deshalb sind sie nicht nur lokale, sondern auch systemische Ereignisse, und umgekehrt, ihr Verhalten kann sowohl von lokalen und systemischen Veränderungen 2 geregelt werden, beeinflussen können.
DieStudium der Osteozyten hat vor kurzem an Dynamik gewonnen, dank einiger technischer Verbesserungen, wie die Erzeugung von Gewebe-und zellspezifische transgene Tiere, die Verwendung von leistungsstarken Mikroskopie-Techniken und der Hochdurchsatz-Screening Molekular 3,4. Allerdings ist die Kenntnis dieser Zellen noch unvollständig, vor allem aufgrund der relativen Knappheit von angemessenen in vitro-Modellen. Eigentlich habe Osteozyten immer schwierig, wegen der tiefen Lage zu erhalten und zu pflegen in der Kultur, und das niedrige Niveau der Verbreitung, die eine solche differenzierte Zelltyp charakterisiert.
Entlang der Jahre eine Reihe von Methoden entwickelt worden, um primäre Knochenzellen 5-7 isolieren, obwohl sie produzieren in der Regel niedriger Zellausbeuten und tragen das Risiko, dass sogar ein paar verunreinigen Fibroblasten schnell überwuchern die Osteozyten 8. Aus diesem Grund sind die meisten experimentellen in vitro Arbeit wurde bisher auf die etablierten osteocyte Zelle l durchgeführtine MLO-Y4 9.
Weitere In-vitro-Methoden könnte die Möglichkeit der Untersuchung dieser Zellen zu erhöhen und könnte die Analyse der osteocyte Biologie und Pathophysiologie verbessern. Um weitgehend angenommen werden, sollten diese Methoden einfach zu reproduzieren, und würde nicht verlangen, spezielle Instrumente oder sehr lange Zeiten Zellreifung zu erreichen. Wichtig ist, wenn für Primärzellen, würden sie machen es möglich, die Vorteile von transgenen Tieren zu nehmen. Wir haben kürzlich beschrieben, dass die Behandlung der Osteoblasten-Zelllinie MC3T3-E1 und der primären Osteoblasten mit Retinsäure induziert eine rasche Änderung Phänotyp führt zu der Entwicklung einer homogenen Population von Zellen, die verzweigte morphologische und molekulare Merkmale von Osteozyten 10.
All-trans-Retinsäure (ATRA) ein aktives Stoffwechselprodukt von Vitamin A, die Gen-Transkription reguliert durch Bindung der Kern Retinsäure-Rezeptoren (RARs). RARan DNA binden als Heterodimere mit dem Retinoid-X-Rezeptoren (RXRs), letztlich auf die Modulation von Retinsäure (RA) ansprechenden Zielgene 11 führt. ATRA ist gezeigt worden, die Differenzierung und Reifung von mehreren Zelltypen zu modulieren, darunter andere verzweigte Zellen, wie Nervenzellen 12 und 13 podocytes.
Das hier beschriebene Verfahren wird nach Zugabe von ATRA an primären Osteoblasten basiert. Um wirksam zu sein, muss ATRA an einer präzisen Reifestufe auf Zellen in einem definierten Dichte ausplattiert hinzugefügt werden; Nach unserer Erfahrung diese Bedingungen sind für den Phänotyp Schalter von Osteoblasten Osteozyten erhalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche wurden nach der aktuellen nationalen und europäischen Vorschriften über den Schutz von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken verwendet und überprüft wurden und von der Ethikkommission der Universität Mailand durchgeführt genehmigt.
1. Isolierung von Primär Osteoblasten
Die Methode, mit geringfügigen Änderung, nach dem von Dodig et al 14 beschrieben ist.
- Vorbereitung Digestionsmittel, durch Zugabe von 0,1% Collagenase P und 0,05% Trypsin (ab 2,5% Trypsin 10X, ohne Phenolrot) mit HBSS-Medium (Hanks Balanced Salt Solution, ohne Calcium, Magnesium oder Phenolrot).
- Verwenden Sie 3-4 Tage alten Mäusen (das Verfahren kann so wenig wie 1-Maus angewendet werden.)
- Sacrifice durch Enthauptung. Sprühen Sie den Kopf mit 70% Ethanol und auf Eis zu halten. Entfernen Sie Haut-und Muskelschichten durch Pinzette und Seziersaal / chirurgische Schere.
- Entfernen Sie vorsichtig die Scheitelbeine undtrennen Sie diese, indem Sie die Pfeilnaht in zwei Hälften. Stellen Sie sicher, Knochen sind frei von Nähten und anhaftendem Gewebe und legen einzelnen Knochenstücke in gut-Platten mit HBSS Medium, bis das Verfahren abgeschlossen ist.
- Entsorgen HBSS und fügen Sie in jede Vertiefung der Digestionsmittel für 15 min bei 37 ° C
- Überstand verwerfen.
- Fügen Sie die Verdauung wieder Medium für 15 min bei 37 ° C
- Diese Zeit zu sparen den Überstand und legen Sie sie in alpha-MEM (Minimum Essential Medium) mit 10% FBS (Fetal Bovine Serum) und 1% Streptomycin / Penicillin.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.7 und 1.8 2x.
- Pool der drei Fraktionen gesammelt, Spin-Zellen durch Zentrifugation bei 425 g für 5 min den Überstand verwerfen, 3 ml ergänzten alpha-MEM, um das Zellpellet resuspendieren und in ein 25 cm 2-Kolben.
- Ändern Sie das Medium nach 24 Stunden, um Schmutz und abgestorbene Zellen zu entfernen.
- Dann werden 50 &mgr; g / ml Ascorbinsäure (AA) und 3 mM GlyCEROL 2-phosphat Dinatriumsalz-Hydrat (GP) an die alpha-MEM-Medium.
- Danach ändern Sie die Medium (MEM alpha-Plus AA / GP) jeden zweiten Tag.
2. ATRA-Protokoll
- Führen Sie alle Experimente mit ATRA (All-Trans-Retinsäure) in einem abgedunkelten Raum, um die Inaktivierung zu verhindern.
- Bereiten Sie eine 1X Trypsin-Lösung in HBSS Medium und halten bei 37 ° C bis zur Verwendung.
- Entfernen Sie das Medium aus subkonfluente Zellen und waschen Sie sie sorgfältig mit HBSS.
- 1 ml Trypsin, sanft drehen Sie den Kolben, damit alle Zellen durch Trypsin abgedeckt werden, und Inkubation für 3 min bei 37 ° C
- Überprüfen Sie für die eigentliche Ablösung von Zellen unter einem inversen Mikroskop.
- 3 ml alpha-MEM-Medium, um Trypsin zu inaktivieren.
- Recover die Zellen und Zentrifugieren für 15 min bei 425 g.
- Zellpellet in frischem Medium.
- Geben Sie einen Tropfen in einer Zählkammer Zählkammer, zu ermöglichen, für ein paar Minuten absetzen und zählen die cell Nummer.
- Ort Zellen in 25 cm 2-Kolben in einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 mit Alpha-MEM sowie AA / GP. Seien Sie sich bewusst, dass die Zelldichte, die für die optimale Entwicklung von Zellprozessen und interzellulären Kontakten. Ein Ausgangsdichte von mehr als 10.000 Zellen / cm 2 beeinträchtigt die richtige Entwicklung von Zellprozessen, aber niedrigere Zellzahlen führen zu vorzeitigem Zelltod aufgrund der Abwesenheit von interzellulären Kontakten.
- In 5 uM ATRA auf das Medium alle 24 Stunden.
- Überwachen Sie die Zellen täglich Morphologie beurteilen: morphologische Veränderungen werden in der Regel nach 48 Stunden beobachtet. Wenn nach der ersten 24-48 Stunden werden die Zellen noch proliferierenden, Ausstrich auf die oben Dichte. Eine homogene Population von reifen Knochenzellen vorhanden ist, nach 4-5 Tagen. Abhängig von den Anforderungen, zu verwenden Zellen zu jedem Zeitpunkt, bis zu 12-15 Tagen.
- Wenn Zellen auf anderen Trägern (wie Deckgläser oder Well-Platten) plattiert, sicher sein, dass die oben Dichte beibehalten wird undATRA weiterhin alle 24 Stunden bis zur Verwendung hinzufügen. Zellen lassen sich an die neue Träger für mindestens 24 h vor dem Experiment zu haften.
3. Immunfärbung
- Für Immunfärbung Platte die Zellen auf Deckgläsern und folgen etablierten Methoden (siehe zB Burry 15).
- Zum Beispiel kann für die indirekte Immunfluoreszenz, fix in 4% Paraformaldehyd oder kaltem Aceton inkubiert sequentiell mit dem primären Antikörper bei RT für 1 Stunde in einer feuchten Kammer, dann mit der fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper im Dunkeln bei RT für 30 min, in einer befeuchteten Kammer.
- Verwenden DAPI oder Analoga für die Kerngegenfärbung, und montieren in der Anti-Fading-Medium.
4. Alizarinrot Färbung und Extraktion
- Platte die Zellen auf Deckgläsern.
- Fixieren die Zellen durch Eintauchen des Deck in 70% Ethanol für 10 min.
- Decken Sie die Zellen mit einigen Tropfen Alizarin-Rot-Färbung-Lösung (1 mg / ml, pH 5,5)für 30 min.
- Mit Leitungswasser waschen Sie die Deckgläser. Montieren Sie mit einem Tropfen Glycerin auf Glasobjektträger und nehmen Sie Bilder mit einem aufrechten Mikroskop bei 10X und 20X Vergrößerung.
- Nach dem obigen Verfahren erholen die Deckgläser durch Eintauchen der Objektträger in Leitungswasser.
- Setzen jedes Deckglas in einem Well-Platte.
- In 60% Perchlorsäure (die Menge hat, genug, um die Zellen vollständig bedeckt sein) und lassen O / N bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
- Messen der optischen Dichte des Überstands durch Spektrophotometrie bei 450 nm Wellenlänge.
- Um Werte für die Zellzahl zu normalisieren, fügen Janus Green (0,2% ige Lösung in PBS), um die Zellpräparation für 10 Minuten abdecken.
- Sorgfältig mit hochreinem Wasser waschen.
- In 0,5 N HCl (die Menge hat, genug, um alle Zellen zu decken) und schütteln mit der Hand ein paar Sekunden.
- Die Absorption bei 615 nm spektralphotometrisch.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ergebnisse wurden zwischen 5 und 10 unabhängigen Experimenten erhalten.
Zellmorphologie
AA / GP behandelt Primärzellen haben meist Kopfsteinpflaster-ähnliche Funktionen, die charakteristisch für reife Osteoblasten. Dazwischen verzweigten Zellen (wie durch die roten Pfeile in 1A angegeben) gefunden werden kann, die wahrscheinlich einige Osteozyten stellen.
Mit ATRA-Behandlung, Zellen beginnen rasch Anzeige Verzweigungen, die nach 2 Tagen in der Regel eingehalten werden. Wie in 1B gezeigt, verzweigte Zellen benötigen Platz, um ihre Dendriten erstrecken. Da die Behandlung mit ATRA Erlöse, Verzweigungen progressiv in Anzahl und Komplexität zu erhöhen, 1C und 1D. Färbung von filamentösen Aktin durch Rhodamin-markiertem Phalloidin hebt Zellprozesse, die durch Phalloidin, Abbildung 2 gekennzeichnet sind.
Matrix-Produktion
<p class = "jove_content"> Primär Osteoblasten produzieren große Mengen an verkalkte Matrix, die über und unter den Zellen anreichert und durch Alizarin-Rot-Färbung, 3A visualisiert werden. Osteozyten produzieren nicht verkalkt extrazellulären Matrix und Alizarin-Rot-Färbung Ergebnisse völlig negativ in ATRA-Zellen inkubiert, 3B. Dementsprechend kann keine oder eine minimale Menge von Alizarin Rot nach dem Extraktionsverfahren, 3C gemessen werden.Osteocyte Marker und Produkte
Sclerostin von ATRA-behandelte Zellen, Abbildung 4. Intensive Immunfärbung zeigt cytoplasmatische Expression und die Anwesenheit von positiven Punkten entlang Zellprozesse. Durch Immunfluoreszenz, ist eine starke Positivität FGF23 in ATRA-behandelte Zellen, Fig. 5 erkennbar ist, entweder in der Zellkörper oder entlang Zellprozesse.
er.within-page = "always"> 
Abbildung 1. Lichtmikroskopie. Primäre Osteoblasten zeigen eine vorherrschende quaderförmige Erscheinungs nach 5 Tagen Inkubation mit AA / GP (A) (Maßstab 100 um). Sparse verzweigten Zellen identifiziert werden können (A) (Pfeile). Nach 2 Tagen von ATRA-Behandlung (B) (Maßstab 100 um)-Zellen zeigen eine längliche Form und Dendriten deutlich erkennbar angezeigt. Nach 5 Tagen der Inkubation ATRA (C) (Maßstab 100 um) kann nur arborized Zellen beobachtet werden und sind bei höherer Vergrößerung (D) (Maßstab 50 Mikrometer) besser nachweisbar.
jpg "src =" / files/ftp_upload/51465/51465fig2.jpg "/>
Aktin-Filament-Färbung 2.. Aktinfilamente durch Rhodamin-falloidin Färbung identifiziert. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives Ergebnis aus Zellen mit ATRA für 3 Tage behandelt worden sind. Bereits zu diesem Zeitpunkt erscheint filamentösen Aktin als Hauptbestandteil der Entwicklung von Zellprozessen. Maßstab: 50 um.
Abbildung 3. Verkalkte Ablagerungen. Alizarin-Rot-Färbung diffus in Osteoblasten nach 5 Tagen Inkubation mit AA / GP (A) (Maßstab 100 um) beobachtet, wohingegen negativ in ATRA-Zellen inkubiert (B) (Maßstab 50 um). Eine tiefgreifende Unterschied kann durch SPECT gemessen werdenroscopy nach Alizarin Extraktion (C).
Abbildung 4. Sclerostin. Sclerostin Positivität ist im Zytoplasma und Zellprozesse entlang der Zellen mit ATRA (Maßstab 50 Mikrometer) inkubiert erkannt.
Abbildung 5. FGF23. FGF23 Immunfärbung ist in ATRA-behandelten Zellen (Maßstab 50 Mikrometer) intensiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In den letzten Jahren hat sich die Osteozyten als die zentrale Zelle im Knochen entstanden. Fortschritte in der Forschung schrittweise enthüllt eine Reihe von bisher unbekannten oder unbewiesen osteocyte Eigenschaften, die für die Gestaltung von neuen und besseren Behandlung für eine Vielzahl von Knochenerkrankungen von enormem Wert sind. Allerdings hat die Untersuchung von osteocyte Biologie an der begrenzten Verfügbarkeit von in-vitro-Modelle leidet so sehr, dass Osteoblasten haben als Ersatzzellen über einen langen Zeitraum verwendet wurden, bevor die osteocyte-Zelllinie MLO-Y4 zur Verfügung gestellt wurde. Vor kurzem wurde eine bedingt immortalisierte Zelllinie von der gleichen Gruppe 16, die differenziert kann bis Ende der Osteozyten verzweigte Sclerostin und FGF23 ausdrücken werden eingeführt. Obwohl der Extremwert dieser Zelllinien ist nicht in Frage, es ist sehr wohl bekannt, dass primäre Zellen ähneln mehr den in-vivo-Situation und bieten die Möglichkeit, primäre Osteozyten fr erhaltenom transgenen Tieren zu funktionellen Studien zu spezifischen molekularen Wege durchzuführen.
Isolierung und Kultur der primären Osteozyten, zuerst von Küken Knochen 5,6 und anschließend von Ratte und Maus Knochen 17,7 erhalten werden, sind extrem nützlich, aber ihre Isolierung erzeugt nur eine kleine Anzahl von Zellen pro Verfahren und Zell Reinheit beruht weitgehend auf einzelnen Know-how. Daher wird das Verfahren, das gegenwärtig nur von einer begrenzten Anzahl von Laboratorien.
Andere Forschungsgruppen haben reifen Knochenzellen durch Induktion der terminalen Differenzierung der Osteoblasten durch progressive Einbettung in dreidimensionalen Matrizen mineralisierten 18,19,, die eine physiologische Umgebung dar, sondern ein Hindernis für eine spätere Forschungsanwendungen erhalten. Es ist wahr, dass Matrix-Mineralisierung 20, sowie niedrige Sauerstoffspannung 21, sind physiologische Auslöser von osteocyte Reifung. Doch eine erfüllthodology Vermeidung dieser beiden Bedingungen konnten Machbarkeits erhöhen und verlängern die Verwendung der Zellen. Unsere vorgeschlagene Verfahren 10, das das Hinzufügen Retinsäure zu reifen Osteoblasten besteht, ist einfach und sehr gut reproduzierbar, und vermeidet Zelltransfektion 22 oder die Verwendung von teuren Wachstumsfaktoren 23.
Mit einer Reihe von Vorversuchen ermittelten wir, dass die Startzellennummer ist ein kritischer Schritt, Anlage korrekte Bildung von mehreren Dendriten und interzellulären Kontakten. Ein zu hoher Zelldichte Beschichtung Komplexität und Ausdehnung der Zellprozesse beeinflusst, während eine zu niedrige Zahlen führen zu einem Verlust der interzellulären Adhäsionen, was zu Zell Leid und Tod.
Wichtig ist, die Anpassung der ATRA Dosierung und tägliche Überwachung der Zellmorphologie sind sehr zu empfehlen, wegen der inhärenten Variabilität der Primärzellen, die die Empfindlichkeit zu ATRA beeinflussen können. Diese Aspekte können besonders relevant WHE werdenn die Methodik, um transgene Modelle angewendet.
Die Entwicklung der Zellprozesse können durch Aktinfärbung überwacht werden, da Dendriten sind reich an filamentösen Aktin.
Es ist bekannt, dass Knochenzellen nicht verkalkte Matrix zu produzieren, und ATRA Inkubation schnell schafft es, durch schrittweise Reduzierung bis zur vollständigen Negativität der Alizarin-Rot-Färbung gezeigt. Inzwischen ATRA induziert die Expression von bekannten osteocyte Marker, vor allem Sclerostin 24, und stellt sicher, Produktion von FGF23, einem grundlegenden Wachstumsfaktor in Knochen und systemischen Phosphat Umgang mit 25 beteiligt. Daher werden weitere Studien bei der Untersuchung der funktionellen Rolle von FGF23 und Sclerostin in Osteozyten Ziel der endogenen Produktion dieser Moleküle erleichtert.
Zusammenfassend zeigen wir, dass die Behandlung mit Retinsäure erzeugt eine homogene Population von reifen Knochenzellen aus primären Zellen Schädeldecke, dierefore ermöglicht eine einfache und schnelle Erstellung von Osteozyten sowohl von Wildtyp und transgenen Tieren. Im Vergleich zu anderen Methoden scheint unser Protokoll zu mehreren Vorteilen, vor allem die einfache Anwendung und die hohe Reproduzierbarkeit zu präsentieren. Der Prozess der Reifung osteocyte können in ausreichender Zahl von Zellen von der ersten Verbreitung der Prozesse durch mehrere Schritte, die in einer 5-Tage-Rahmen auftreten, untersucht werden. Als ein weiterer Vorteil, sind reife Osteozyten in vollständiger Abwesenheit von umgebenden mineralisierten Matrix erhalten, die die Anwendung der unbegrenzten molekulare und funktionelle Assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Finanzierung wurde von "Progetto ein concorso Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico IRCCS 2009-2010", um MD, und Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano bereitgestellt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
References
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J.
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).
- Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
