Summary
علاج بانيات الماوس الأساسي مع حمض الريتينويك تنتج السكان متجانسة من الخلايا المتشعبة التي تحمل ميزات المورفولوجية والجزيئية من osteocytes. الأسلوب يتغلب على صعوبة الحصول على والحفاظ على osteocytes الأولية في الثقافة، ويمكن أن تكون مفيدة لدراسة الخلايا المشتقة من النماذج المعدلة وراثيا.
Abstract
الحاجة إلى الثقافات خلية عظمية هو معروف جيدا للمجتمع من الباحثين العظام؛ عزل osteocytes الأساسي هو صعبة وتنتج أعداد الخلايا منخفضة. ولذلك، فإن نظام الهاتف الخلوي الأكثر استخداما على نطاق واسع هو خط الخلية MLO-Y4 مثل خلية عظمية.
طريقة وصفها هنا يشير إلى استخدام حمض الريتينويك لتوليد السكان متجانسة من الخلايا المتشعبة مع ميزات خلية عظمية المورفولوجية والجزيئية.
بعد عزل الخلايا بانية العظم من calvaria الماوس، يتم إضافة حمض الريتينويك جميع العابر (ATRA) والمتوسطة الخلية، وتتم المراقبة اليومية الخلية تحت مجهر مقلوب. التغيرات المورفولوجية الأولى هي اكتشاف 2 بعد أيام من العلاج والتمايز اكتمال عموما في 5 أيام، مع التطوير التدريجي للالتشعبات، وفقدان القدرة على إنتاج مصفوفة خارج الخلية، بانخفاض التنظيم من علامات بناء العظم ويصل تنظيم جزيئات خلية عظمية محددة.
المحتويات "> وهناك حاجة للرصد خلية يوميا بسبب تقلب المتأصل في الخلايا الأولية، والبروتوكول يمكن تكييفها مع الحد الأدنى من الاختلاف إلى الخلايا التي تم الحصول عليها من سلالات الفئران مختلفة وتطبيقها على النماذج المعدلة وراثيا.طريقة سهلة لتنفيذ و لا يتطلب أدوات خاصة، هو تكرار للغاية، ويولد بسرعة عدد سكانها خلية عظمية ناضجة في غياب كامل للالمصفوفة خارج الخلية، مما يتيح استخدام هذه الخلايا للتطبيقات البيولوجية غير محدود.
Introduction
Osteocytes، والأكثر وفرة نوع من الخلايا العظمية، هي متباينة من شفائهم، وخلايا متشعبة للغاية وتقع عميقا داخل الهيكل العظمي. وترد خلايا الجسم من osteocytes ناضجة في الثغرات العظام ولها أشكال متنوعة؛ تم العثور على osteocytes مع الهيئات الخلية ممدود في العظام القشرية، في حين osteocytes مدورة هي أكثر شيوعا في العظام تربيقي 1. تمديد التشعبات متفرعة من جسم الخلية ويقيم في قنوات صغيرة تسمى نفيق، وتشكيل شبكة معقدة تجعل عدة جهات اتصال ليس فقط مع osteocytes الأخرى، ولكن أيضا مع أنواع أخرى خلايا العظام ونخاع العظام والأوعية الدموية وpericytes المرتبطة بها. من خلال السائل الخلالي الواردة في الثغرات ونفيق، osteocytes هي أيضا مرتبطة في نهاية المطاف إلى نظام تداول، وبالتالي فإنها يمكن أن تؤثر المحلي فحسب، بل أيضا الأحداث النظامية، والعكس بالعكس سلوكهم يمكن أن ينظم من قبل كل من التغيرات المحلية والنظامية 2.
الاكتسبت دراسة osteocytes مؤخرا الزخم، وذلك بفضل العديد من التطورات التقنية، مثل توليد الأنسجة والخلايا محددة الحيوانات المعدلة وراثيا، واستخدام تقنيات الفحص المجهري قوية وعالية الإنتاجية الفحص الجزيئي 3،4. ومع ذلك، ومعرفة هذه الخلايا لا تزال غير مكتملة، ويرجع ذلك أساسا إلى الندرة النسبية للنماذج كافية في المختبر. في الواقع، كانت osteocytes دائما من الصعب الحصول على والحفاظ في الثقافة نظرا للموقع العميقة، وانخفاض مستوى انتشار الذي يميز هذا نوع من الخلايا المتمايزة.
على طول السنين، وقد وضعت عددا من الأساليب لعزل osteocytes الأولية 5-7، على الرغم من أنها تنتج عادة غلة الخلية منخفض وتحمل المخاطر التي حتى عدد قليل من الخلايا الليفية تلويث سوف اكتسى بسرعة osteocytes 8. لهذا السبب، وقد أجريت معظم التجارب في المختبر حتى الآن العمل على راسخة خلية خلية عظمية لالمعهد الوطني للإحصاء MLO-Y4 9.
في المختبر منهجيات إضافية يمكن أن تعزز إمكانية دراسة هذه الخلايا ويمكن تحسين تحليل البيولوجيا والفيزيولوجيا المرضية خلية عظمية. أن يعتمد إلى حد كبير، وينبغي أن تكون مثل هذه الأساليب من السهل على الإنجاب، ولن تتطلب أجهزة خاصة أو أوقات طويلة جدا للوصول إلى نضوج الخلية. الأهم من ذلك، إن وجدت إلى الخلايا الأولية، فإنها تجعل من الممكن الاستفادة من الحيوانات المعدلة وراثيا. وصفنا مؤخرا أن العلاج من خط الخلايا العظمية MC3T3-E1 وبانيات الأولية مع حمض الريتينويك يؤدي الى تغيير النمط الظاهري السريع الرائدة في تطوير مجموعة من السكان متجانسة من الخلايا متشعبة تحمل الميزات المورفولوجية والجزيئية من osteocytes 10.
جميع العابر حمض الريتينويك (ATRA) هو منتج الأيض نشطة من فيتامين (أ) الذي ينظم النسخ الجيني بواسطة ربط مستقبلات حمض الريتينويك النووية (RARS). RARSربط الحمض النووي كما heterodimers مع ريتينويد X مستقبلات (RXRS)، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى التشكيل من حمض الريتينويك (RA) استجابة الجينات المستهدفة 11. وقد تبين ATRA لتعديل التمايز والنضج العديد من أنواع الخلايا، ومن بينها الخلايا المتشعبة الأخرى مثل الخلايا العصبية 12 و 13 podocytes.
طريقة وصفها هنا يقوم على إضافة ATRA لبانيات الأولية. لكي تكون فعالة، يجب أن ATRA أن تضاف في مرحلة النضج دقيقة على الخلايا مطلي في مناطق ذات كثافة محددة؛ في تجربتنا هذه الظروف الحرجة للحصول على مفتاح النمط الظاهري من بانيات لosteocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للوائح الحالية الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية وتم مراجعتها والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية من جامعة ميلان والوطنية.
1. عزل بانيات الابتدائية
الأسلوب، مع تعديلات طفيفة، يتبع الإجراء التي وصفها دوديج وآخرون 14.
- إعداد هضم المتوسطة، وذلك بإضافة 0.1٪ كولاجيناز P و 0.05٪ التربسين (بدءا من 2.5٪ التربسين 10X، لا أحمر الفينول) لHBSS المتوسطة (هانكس محلول الملح المتوازن، لا الكالسيوم، المغنيسيوم، أو أحمر الفينول).
- استخدام الفئران القديمة 3-4 يوم (يمكن تطبيق الإجراء لبضعة مثل الماوس 1).
- التضحية بقطع الرأس. رذاذ الرأس مع الايثانول 70٪ والحفاظ على الجليد. إزالة طبقات الجلد والعضلات بواسطة ملاقط وتشريح / مقص جراحي.
- بلطف إزالة العظام الجداري وتفصل بينهما باتباع الدرز السهمي إلى نصفين. تأكد من العظام هي خالية من أي نوع من الأنسجة والخيوط ملتصقة ووضع قطعة عظم الفردية في جيدا لوحات تحتوي على HBSS متوسطة حتى يتم الانتهاء من الإجراء.
- تجاهل HBSS وإضافة إلى كل بئر المتوسطة هضم لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تجاهل طاف.
- إضافة مرة أخرى وسيلة هضم لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- هذه المرة حفظ طاف ووضعه في ألفا MEM (الحد الأدنى متوسطة الأساسية) تستكمل مع FBS 10٪ (مصل بقري جنيني) و 1٪ الستربتوميسين / البنسلين.
- كرر الخطوات من 1.7 و 1.8 2X.
- تجميع الكسور التي جمعت ثلاثة، تدور الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 425 غ لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف، إضافة 3 مل من MEM تستكمل ألفا إلى resuspend الكرية الخلية، ونقل إلى 25 سم 2 القارورة.
- تغيير المتوسطة بعد 24 ساعة لإزالة الحطام والخلايا الميتة.
- إضافة 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك (AA) و 3 ملي الغليسينcerol 2 فوسفات ثنائي الصوديوم هيدرات الملح (GP) إلى المتوسطة ألفا MEM.
- بعد ذلك، قم بتغيير المتوسطة (ألفا MEM بالإضافة إلى AA / GP) كل يوم.
2. البروتوكول ATRA
- إجراء جميع التجارب مع ATRA (جميع العابر حمض الريتينويك) في غرفة مظلمة لمنع تعطيل.
- إعداد محلول التربسين 1X في HBSS المتوسطة والحفاظ على 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إزالة متوسطة من الخلايا subconfluent وبعناية غسلها مع HBSS.
- إضافة 1 مل التربسين، وتناوب بلطف القارورة للسماح لجميع الخلايا لتكون مشمولة التربسين، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- التحقق من وجود مفرزة الفعلي من الخلايا تحت مجهر مقلوب.
- إضافة 3 مل من MEM ألفا المتوسطة لتعطيل التربسين.
- استرداد خلايا وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 425 غرام.
- resuspend الكرية خلية في متوسطة جديدة.
- وضع قطرة في غرفة عدادة الكريات العد، والسماح لتسوية لبضع دقائق وعد معدد يرة لبنانية.
- خلايا المكان في 25 سم 2 القوارير في مناطق ذات كثافة من 10،000 خلية / سم 2 مع ألفا MEM بالإضافة إلى AA / GP. تكون على علم بأن كثافة الخلية ذات الصلة بتطوير الأمثل للعمليات الخلية والاتصالات بين الخلايا. A الكثافة انطلاق أعلى من 10،000 خلية / سم 2 يعوق التنمية السليمة للعمليات الخلية، ولكن أعداد الخلايا أقل يؤدي إلى موت الخلايا قبل الأوان، وذلك بسبب غياب الاتصالات بين الخلايا.
- إضافة 5 ميكرومتر ATRA إلى المتوسط كل 24 ساعة.
- رصد الخلايا اليومي لتقييم التشكل: لوحظ تغيرات شكلية عادة بعد 48 ساعة. إذا، وبعد ساعة 24-48 الأولى، وخلايا لا تزال تنتشر، replate في كثافة أعلاه. عدد السكان متجانسة من osteocytes ناضجة موجودا بعد 4-5 أيام. اعتمادا على الاحتياجات، واستخدام الخلايا في أي نقطة زمنية، تصل إلى 12-15 يوما.
- عندما ومطلي الخلايا على الدعم الأخرى (مثل coverslips أو جيدا لوحات)، تأكد من أن يتم الحفاظ على كثافة أعلاه والاستمرار في إضافة ATRA كل 24 ساعة حتى الاستخدام. ترك الخلايا التمسك دعم جديد لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التجربة.
3. المناعية
- لالمناعية، لوحة خلايا coverslips على واتباع المنهجيات المقررة (انظر على سبيل المثال بيرى 15).
- على سبيل المثال، لالمناعي غير المباشر، وإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ أو الأسيتون البارد، واحتضان بالتتابع مع الأجسام المضادة الأولية في RT لمدة 1 ساعة في غرفة ترطيب، ثم مع الأجسام المضادة الفلورسنت ذات العلامات الثانوية في الظلام، في RT لمدة 30 دقيقة، في غرفة ترطيب.
- استخدام دابي أو نظائرها لcounterstaining النووية، وجبل في مكافحة يتلاشى المتوسط.
4. الصبغ الأحمر الأحمر يلطخ واستخراج
- لوحة الخلايا coverslips على.
- إصلاح الخلايا بغمر ساترة في الايثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة.
- تغطية الخلايا مع بعض قطرات من الآليزارين حل تلطيخ الحمراء (1 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 5.5)لمدة 30 دقيقة.
- غسل coverslips مع مياه الحنفية. جبل مع قطرة من الجلسرين على الشرائح الزجاجية واتخاذ الصور باستخدام المجهر تستقيم في 10X 20X والتكبير.
- بعد الإجراء أعلاه، واستعادة لل coverslips بغمر الشرائح في مياه الحنفية.
- وضع كل ساترة في لوحة جيدا.
- إضافة حمض البيركلوريك 60٪ (كمية يجب أن تكون كافية لتغطية تماما الخلايا) وترك O / N عند 4 درجة مئوية مع الإثارة لطيف.
- قراءة الكثافة الضوئية من طاف بواسطة القياس الطيفي عند 450 نانومتر الطول الموجي.
- لتطبيع القيم لعدد الخلايا، إضافة يانوس الأخضر (حل 0.2٪ في برنامج تلفزيوني) لتغطية إعداد الخلايا لمدة 10 دقيقة.
- غسل بعناية مع الماء عالى النقاء.
- إضافة حمض الهيدروكلوريك 0.5 N (كمية يجب أن تكون كافية لتغطية جميع الخلايا) ويهز بلطف باليد لبضع ثوانى.
- قراءة الامتصاصية في 615 نانومتر بواسطة القياس الطيفي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتم الحصول على نتائج 5-10 تجارب مستقلة.
مورفولوجيا الخلايا
تعامل AA / GP الخلايا الأولية يكون في الغالب مثل الحصوه الميزات، سمة من بانيات ناضجة. الخلايا المتشعبة يتخلل (كما يتبين من السهام الحمراء في الشكل 1A) ويمكن الاطلاع، والتي من المرجح تمثل بعض osteocytes.
مع العلاج ATRA، تبدأ الخلايا بسرعة عرض تشعبات، والتي لوحظ عموما بعد أيام 2. كما هو مبين في الشكل 1B، خلايا متشعبة تتطلب مساحة لتمديد التشعبات بهم. كما معاملة بعائدات ATRA، تداعيات زيادة تدريجية في عدد وتعقيد، أرقام 1C 1D و. تلطيخ أكتين الخيطية التي كتبها المسمى رودامين phalloidin يبرز عمليات الخلية، والتي وصفت من قبل phalloidin، الشكل 2.
إنتاج مصفوفة
< ع الطبقة = "jove_content"> بانيات الابتدائية تنتج كميات كبيرة من مصفوفة متكلسة، والذي يتراكم على مدى وبين الخلايا ويمكن تصور من قبل الصبغ الأحمر تلطيخ الأحمر، الشكل 3A. Osteocytes لا تنتج المصفوفة خارج الخلية متكلسة، والنتائج السلبية الآليزارين تلطيخ حمراء تماما في الخلايا المحتضنة ATRA، الشكل 3B. وفقا لذلك، لا شيء أو كمية ضئيلة من أحمر الآليزارين يمكن قياسها بعد إجراء الاستخراج، الشكل 3C.علامات خلية عظمية والمنتجات
وأعرب عن Sclerostin من قبل خلايا ATRA المعاملة، الشكل 4. المناعية يكشف التعبير حشوية مكثفة وجود نقاط إيجابية على طول عمليات الخلية. بواسطة المناعي، وهو الإيجابية FGF23 قوية قابلا للاكتشاف في الخلايا ATRA المعاملة، الشكل 5، إما في جسم الخلية أو على طول عمليات الخلية.
er.within صفحة = "دائما"> 
إظهار الرقم 1. المجهري الخفيفة. بانيات الابتدائية مظهر مكعبي الشكل السائد بعد 5 أيام الحضانة مع AA / GP (A) (شريط مقياس 100 ميكرون). يمكن التعرف على الخلايا المتشعبة متفرق (A) (السهام). 2 بعد أيام من العلاج ATRA (B) (شريط مقياس 100 ميكرون)، وعرض الخلايا شكل أكثر ممدود والتشعبات تظهر كشفها بوضوح. خلايا arborized فقط يمكن ملاحظتها بعد 5 أيام من ATRA الحضانة (C) (مقياس شريط 100 ميكرون)، وأفضل اكتشاف في أعلى التكبير (D) (مقياس شريط 50 ميكرون).
jpg و"سرك =" / files/ftp_upload/51465/51465fig2.jpg "/>
الشكل 2. خيوط أكتين تلطيخ. يتم تحديد خيوط أكتين بواسطة تلطيخ رودامين-falloidin. يوضح الشكل نتيجة ممثل الحصول عليها من خلايا تعامل مع ATRA لمدة 3 أيام. بالفعل عند هذه النقطة الزمن، يبدو أكتين الخيطية باعتبارها عنصرا رئيسيا في تطوير عمليات الخلية. شريط النطاق: 50 ميكرون.
الرقم 3. الودائع متكلسة. لوحظ الصبغ الأحمر تلطيخ حمراء منتشرة في بانيات بعد 5 أيام الحضانة مع AA / GP (A) (شريط مقياس 100 ميكرون)، في حين هو سلبي في الخلايا المحتضنة ATRA (B) (شريط نطاق 50 ميكرون). وهناك فرق عميق يمكن أن تقاس SPECTroscopy بعد الآليزارين استخراج (C).
تم الكشف عن الرقم 4. Sclerostin الإيجابية. Sclerostin في السيتوبلازم وعلى طول العمليات خلية من الخلايا المحتضنة مع ATRA (شريط نطاق 50 ميكرون).
الرقم 5. FGF23. المناعية FGF23 مكثفة في الخلايا ATRA المعاملة (شريط نطاق 50 ميكرون).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في السنوات الأخيرة برزت باعتبارها الخلية خلية عظمية الأكثر مركزية في العظام. التقدم في البحوث ويكشف تدريجيا عدد من الخصائص خلية عظمية لم تكن متصورة أو غير مثبتة سابقا، والتي هي ذات قيمة هائلة لتصميم الرواية وعلاج أفضل لمجموعة متنوعة من أمراض العظام. ومع ذلك، والتحقيق في خلية عظمية الأحياء تعاني من محدودية توافر نماذج في المختبر لدرجة أن بانيات تم استخدام الخلايا البديلة على مدى فترة طويلة قبل اتخاذ خط الخلية مثل خلية عظمية MLO-Y4 المتاحة. وفي الآونة الأخيرة، تم إدخال خط خلية خلد مشروط من قبل نفس المجموعة 16، والتي يمكن أن تكون متباينة لتشعب osteocytes أواخر معربا عن sclerostin وFGF23. على الرغم من أن القيمة القصوى من هذه الخطوط الخلية ليست تحت السؤال، فمن المعروف جيدا أن الخلايا الأولية تشبه أكثر على الوضع في الجسم الحي، وتوفر إمكانية الحصول على الاب osteocytes الابتدائيالحيوانات المعدلة وراثيا ام لإجراء دراسات وظيفية على المسارات الجزيئية محددة.
العزلة وثقافة osteocytes الابتدائية، وحصل أول من العظام الفرخ 5،6 في وقت لاحق من والجرذان والفئران 17،7 العظام، هي مفيدة للغاية ولكن عزلتهم يولد سوى عدد صغير من الخلايا في الإجراء، ويعتمد نقاء الخلية إلى حد كبير على الخبرات الفردية. لذلك، يتم استخدام الأسلوب حاليا فقط من قبل عدد محدود من المختبرات.
قد حصلت على مجموعات بحثية أخرى osteocytes ناضجة عن طريق حفز محطة تمايز الخلايا بانية العظم من خلال تضمين التدريجي في مصفوفات المعدنية ثلاثية الأبعاد 18،19، التي تشكل بيئة أكثر الفسيولوجية ولكن هي عقبة في طريق تطبيقات البحوث اللاحقة. صحيح أن مصفوفة تمعدن 20، فضلا عن انخفاض الأكسجين التوتر 21، هي محفزات الفسيولوجية للخلية عظمية النضج. ومع ذلك، التقىقد علم السبل العصبية تجنب هذين الشرطين زيادة الجدوى وتوسيع استخدام الخلايا. الطريقة المقترحة لدينا 10، والذي يتألف من إضافة حمض الريتينويك إلى أن تنضج بانيات، بسيط، استنساخه للغاية، والابتعاد عن خلية ترنسفكأيشن 22 أو استخدام عوامل النمو مكلفة 23.
مع سلسلة من التجارب الأولية، توصلنا إلى أن عدد الخلايا تبدأ خطوة، تكييف تشكيل السليم الحرجة من التشعبات المتعددة والاتصالات بين الخلايا. ويؤثر كثافة الخلايا تصفيح عالية جدا من التعقيد وتمديد عمليات الخلية، في حين أن الأرقام منخفضة جدا ينتج عنه فقدان التصاقات بين الخلايا، مما يؤدي إلى معاناة الخلية والموت.
الأهم من ذلك، ينصح بتعديل الجرعة ATRA والرصد اليومي لمورفولوجيا الخلايا للغاية، وذلك بسبب تقلب المتأصل في الخلايا الأولية التي يمكن أن تؤثر على حساسية لATRA. ويمكن لهذه الجوانب تصبح عرج أهمية خاصةن تطبيق منهجية لنماذج المعدلة وراثيا.
تطوير عمليات الخلية يمكن رصدها من خلال تلطيخ الأكتين، بسبب التشعبات هي غنية في أكتين الخيطية.
ومن المعروف جيدا أن osteocytes لا تنتج مصفوفة متكلسة، وATRA الحضانة يلغي ذلك بسرعة، كما يتضح من التخفيض التدريجي حتى سلبية كاملة من تلطيخ الأحمر الآليزارين. وفي الوقت نفسه، ATRA الحث على التعبير عن علامات خلية عظمية معروفة، وأبرزها sclerostin 24، ويضمن إنتاج FGF23، وهو عامل النمو الأساسية المشاركة في العظام والفوسفات النظامية التعامل مع 25. لذلك، وسيتم تسهيل إجراء المزيد من الدراسات التي تهدف إلى التحقيق في دور وظيفي من FGF23 وsclerostin في osteocytes عن إنتاج هذه الجزيئات الذاتية.
باختصار، وتبين لنا أن العلاج مع حمض الريتينويك يولد السكان متجانسة من osteocytes ناضجة من خلايا calvaria الأولية، وrefore السماح إعداد بسيطة وسريعة لosteocytes من كل نوع البرية والحيوانات المعدلة وراثيا. مقارنة مع أساليب أخرى، يبدو بروتوكول لدينا لتقديم العديد من المزايا، وفي مقدمتها تطبيق بسيط واستنساخ عالية. يمكن دراسة عملية نضوج خلية عظمية في أعداد كافية من الخلايا الأولية من انتشار العمليات من خلال العديد من الخطوات التي تحدث في إطار 5 أيام. كما ميزة إضافية، ويتم الحصول على osteocytes ناضجة في غياب كامل للالمحيطة المصفوفة المعدنية، والسماح للتطبيق المقايسات الجزيئية والوظيفية غير محدود.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
تم توفير التمويل من قبل "PROGETTO على كونكورسو FONDAZIONE IRCCS أسبيدال ماجيوري Policlinico 2009-2010" لدكتوراه في الطب، وAssociazione بامبينو Nefropatico ABN ONLUS، ميلانو
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
References
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J.
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).
- Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
