Summary
Retinoic एसिड के साथ प्राथमिक माउस अस्थिकोरक के उपचार osteocytes की रूपात्मक और आणविक सुविधाओं असर डालियां फैला कोशिकाओं का एक सजातीय जनसंख्या पैदा करता है. विधि प्राप्त करने और संस्कृति में प्राथमिक osteocytes बनाए रखने की कठिनाई पर काबू पा, और ट्रांसजेनिक मॉडल से ली गई कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है.
Abstract
osteocyte संस्कृतियों के लिए की जरूरत को अच्छी तरह से हड्डी शोधकर्ताओं के समुदाय के लिए जाना जाता है; प्राथमिक osteocytes के अलगाव मुश्किल है और कम सेल नंबर पैदा करता है. इसलिए, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल सेलुलर प्रणाली osteocyte तरह MLO-Y4 सेल लाइन है.
यहाँ वर्णित विधि रूपात्मक और आणविक osteocyte सुविधाओं के साथ डालियां फैला कोशिकाओं का एक सजातीय जनसंख्या उत्पन्न करने के लिए retinoic एसिड का उपयोग करने के लिए संदर्भित करता है.
माउस calvaria से अस्थिकोरक के अलगाव के बाद, सब पार retinoic एसिड (ATRA) सेल के माध्यम से जोड़ा जाता है, और सेल निगरानी एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत दैनिक आयोजित किया जाता है. सबसे पहले morphological परिवर्तन उपचार और भेदभाव के 2 दिन बाद detectable हैं डेन्ड्राइट, बाह्य मैट्रिक्स का उत्पादन करने की क्षमता की कमी है, अस्थिकोरक मार्कर के नीचे विनियमन और के क्रमिक विकास के साथ, 5 दिनों में आम तौर पर पूरा हो गया है ऊपर विनियमन osteocyte विशिष्ट अणुओं की.
सामग्री "> दैनिक सेल निगरानी क्योंकि प्राथमिक कोशिकाओं के निहित परिवर्तनशीलता की जरूरत है, और प्रोटोकॉल अलग माउस उपभेदों से प्राप्त की है और ट्रांसजेनिक मॉडल को लागू कोशिकाओं को कम से कम बदलाव के साथ अनुकूलित किया जा सकता.विधि प्रदर्शन करने के लिए आसान है और विशेष उपकरण की आवश्यकता होती नहीं है, यह अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और तेजी से असीमित जैविक अनुप्रयोगों के लिए इन कोशिकाओं के उपयोग की अनुमति, बाह्य मैट्रिक्स का पूर्ण अभाव में एक परिपक्व osteocyte आबादी उत्पन्न करता है.
Introduction
Osteocytes, सबसे प्रचुर मात्रा में हड्डी सेल प्रकार, गहरा कंकाल भीतर स्थित अत्यधिक डालियां फैला कोशिकाओं टर्मिनली भेदभाव कर रहे हैं. परिपक्व osteocytes के सेल शरीर हड्डी खामियों में रखी जाती है और विविध आकार दिया जाता है; गोल osteocytes घरनदार हड्डी 1 में अधिक पाये जाते हैं, जबकि लम्बी सेल शरीर के साथ osteocytes, cortical हड्डी में पाए जाते हैं. Branched डेन्ड्राइट अन्य osteocytes के साथ, लेकिन यह भी अन्य हड्डी प्रकार की कोशिकाओं, अस्थि मज्जा, रक्त वाहिकाओं और एसोसिएटेड pericytes साथ न केवल एकाधिक संपर्क में आता है कि एक जटिल वेब के गठन, canaliculi बुलाया छोटे चैनलों में सेल शरीर से विस्तार और रहते हैं. खामियों और canaliculi में निहित मध्य द्रव के माध्यम से, osteocytes इसलिए वे स्थानीय बल्कि प्रणालीगत घटनाओं, और इसके विपरीत उनके व्यवहार दोनों स्थानीय और प्रणालीगत परिवर्तन 2 द्वारा विनियमित किया जा सकता है न केवल प्रभावित कर सकते हैं, यह भी अंत में परिसंचारी प्रणाली से जुड़े हैं.
osteocytes के अध्ययन हाल ही में, इस तरह के ऊतक और सेल विशिष्ट ट्रांसजेनिक जानवरों की पीढ़ी, शक्तिशाली तकनीक माइक्रोस्कोपी और उच्च throughput आणविक स्क्रीनिंग 3,4 के उपयोग के रूप में कई तकनीकी प्रगति के लिए धन्यवाद रफ्तार पकड़ ली है. हालांकि, इन कोशिकाओं का ज्ञान मुख्य कारण इन विट्रो मॉडल में पर्याप्त के सापेक्ष कमी करने के लिए, अभी भी अधूरा है. दरअसल, osteocytes क्योंकि गहरे स्थान प्राप्त और संस्कृति में बनाए रखने के लिए हमेशा मुश्किल हो गया है, और इस तरह के एक विभेदित सेल प्रकार की विशेषता है कि प्रसार का स्तर कम है.
वे आम तौर पर कम सेल पैदावार का उत्पादन और भी कुछ contaminating fibroblasts तेजी osteocytes 8 बढ़ना होगा कि जोखिम उठाने हालांकि साल के साथ, तरीकों का एक नंबर, प्राथमिक osteocytes 5-7 अलग करने के लिए विकसित किया गया है. इस कारण से, इन विट्रो काम में सबसे प्रयोगात्मक अच्छी तरह से स्थापित osteocyte सेल एल पर अब तक आयोजित किया गया हैine MLO-Y4 9.
अतिरिक्त इन विट्रो तरीके से इन कोशिकाओं का अध्ययन करने की संभावना में वृद्धि कर सकता है और osteocyte जीवविज्ञान और pathophysiology के विश्लेषण में सुधार सकता है. मोटे तौर पर अपनाया जाना, इस तरह के तरीकों को पुन: पेश करने के लिए आसान होना चाहिए, और सेल परिपक्वता तक पहुँचने के लिए विशेष इंस्ट्रूमेंटेशन या बहुत लंबे समय की आवश्यकता नहीं होगी. प्राथमिक कोशिकाओं को यदि लागू महत्वपूर्ण बात, वे यह संभव ट्रांसजेनिक जानवरों का लाभ लेने के लिए करना होगा. हमने हाल ही में अस्थिकोरक सेल लाइन MC3T3-E1 की और retinoic एसिड के साथ प्राथमिक अस्थिकोरक के उपचार osteocytes 10 की रूपात्मक और आणविक सुविधाओं असर डालियां फैला कोशिकाओं का एक सजातीय आबादी के विकास के लिए अग्रणी एक तेजी से phenotype परिवर्तन लाती है कि वर्णित.
अखिल पार retinoic एसिड (ATRA) परमाणु retinoic एसिड रिसेप्टर्स (RARs) बंधन से जीन प्रतिलेखन को नियंत्रित करता है जो विटामिन ए का एक सक्रिय चयापचय उत्पाद है. RARsअंततः retinoic एसिड (आरए) उत्तरदायी लक्ष्य जीन 11 के मॉडुलन के लिए अग्रणी, retinoid एक्स रिसेप्टर्स (RXRs) के साथ heterodimers के रूप में डीएनए के लिए बाध्य. ATRA ऐसे neuronal कोशिकाओं 12 और podocytes रूप में 13 अन्य डालियां फैला कोशिकाओं उनमें से, कई प्रकार की कोशिकाओं के भेदभाव और परिपक्वता मिलाना दिखाया गया है.
यहाँ वर्णित विधि प्राथमिक अस्थिकोरक को ATRA के अलावा पर आधारित है. प्रभावी हो, ATRA एक परिभाषित घनत्व पर चढ़ाया कोशिकाओं पर एक सटीक परिपक्वता के स्तर पर जोड़ा जाना है; हमारे अनुभव में इन शर्तों अस्थिकोरक से osteocytes को phenotype स्विच प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों राष्ट्रीय और वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया है और समीक्षा की और मिलान विश्वविद्यालय की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया पशुओं के संरक्षण के संबंध में यूरोपीय मौजूदा नियमों के अनुसार किया गया.
प्राथमिक अस्थिकोरक की 1. अलगाव
विधि, मामूली संशोधन के साथ, Dodig एट अल 14 द्वारा वर्णित प्रक्रिया इस प्रकार है.
- 0.1% Collagenase पी और 0.05% जोड़कर, मध्यम पचाने को तैयार HBSS मध्यम (हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान, कोई कैल्शियम, मैग्नीशियम, या फिनोल लाल) के लिए (2.5% trypsin 10X, कोई फिनोल लाल से शुरू) Trypsin.
- 3-4 दिन पुरानी चूहों का उपयोग (1 प्रक्रिया माउस के रूप में कुछ करने के लिए लागू किया जा सकता है).
- कत्ल के द्वारा किया. 70% इथेनॉल के साथ सिर स्प्रे और बर्फ पर रख. चिमटी और विदारक / शल्य कैंची से त्वचा और मांसपेशियों की परतों को दूर.
- धीरे पार्श्विका हड्डियों को हटाने औरदो हिस्सों में बाण के समान सीवन का पालन करके उन्हें अलग. यकीन है कि हड्डियों टांके और किसी भी पक्षपाती ऊतक से मुक्त कर रहे हैं और प्रक्रिया के पूर्ण होने तक HBSS मध्यम युक्त अच्छी तरह से प्लेटों में व्यक्तिगत हड्डी के टुकड़े जगह है.
- HBSS त्यागें और प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पचा मध्यम
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पचा मध्यम जोड़ें
- इस बार सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए और 10% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) और 1% स्ट्रेप्टोमाइसिन / पेनिसिलिन के साथ पूरक अल्फा-सदस्य (न्यूनतम आवश्यक मध्यम) में जगह है.
- दोहराएँ 1.7 और 1.8 2x दोहराएँ.
- 5 मिनट के लिए 425 ग्राम पर centrifuging द्वारा तीन एकत्र भिन्न, स्पिन कोशिकाओं पूल, सतह पर तैरनेवाला त्यागने सेल गोली resuspend करने के लिए पूरक अल्फा-सदस्य के 3 मिलीलीटर जोड़ने, और हस्तांतरण एक 25 सेमी 2 फ्लास्क.
- मलबे और मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए 24 घंटे के बाद मध्यम बदलें.
- 50 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड (एए) और GLY 3 मिमी जोड़ेंcerol 2 फॉस्फेट disodium नमक अल्फा-सदस्य मध्यम को हाइड्रेट (जीपी).
- इसके बाद, हर दूसरे दिन (अल्फा-सदस्य प्लस ए.ए. / जीपी) मध्यम बदल जाते हैं.
2. ATRA प्रोटोकॉल
- निष्क्रियता को रोकने के लिए एक अंधेरे कमरे में ATRA (अखिल पार retinoic एसिड) के साथ सभी प्रयोगों का संचालन.
- HBSS माध्यम में एक 1X trypsin समाधान तैयार करें और उपयोग करें जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर रखना.
- Subconfluent कोशिकाओं से मध्यम निकालें और ध्यान से HBSS के साथ उन्हें धोने.
- 1 मिलीलीटर trypsin जोड़ें, धीरे सभी कोशिकाओं trypsin में शामिल होने की अनुमति देने के लिए कुप्पी बारी बारी से, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेते
- एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का वास्तविक टुकड़ी के लिए जाँच करें.
- Trypsin निष्क्रिय करने के लिए अल्फा-सदस्य माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
- कोशिकाओं को ठीक और 425 ग्राम पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- ताजा मध्यम में सेल गोली Resuspend.
- एक hemocytometer गिनती चैम्बर में एक बूंद प्लेस, कुछ मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति और CE गिनतीडालूँगा संख्या.
- 10,000 कोशिकाओं / अल्फा-सदस्य प्लस ए.ए. / जीपी के साथ 2 सेमी की एक घनत्व में 25 सेमी 2 बोतल में जगह कोशिकाओं. सेल घनत्व सेल प्रक्रियाओं और कहनेवाला संपर्कों के इष्टतम विकास के लिए प्रासंगिक है कि अवगत रहें. एक प्रारंभिक घनत्व अधिक से अधिक 10,000 कोशिकाओं / 2 सेमी सेल प्रक्रियाओं का समुचित विकास impairs, लेकिन कम सेल नंबर वजह कहनेवाला संपर्क के अभाव में समय से पहले कोशिका मृत्यु में परिणाम.
- हर 24 घंटा मध्यम करने के लिए 5 माइक्रोन ATRA जोड़ें.
- Morphological परिवर्तन आम तौर पर 48 घंटे के बाद मनाया जाता है: आकारिकी का आकलन करने के लिए दैनिक कोशिकाओं मॉनिटर. पहले 24-48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को अभी भी proliferating हैं, तो ऊपर घनत्व पर replate. परिपक्व osteocytes के एक सजातीय जनसंख्या 4-5 दिनों के बाद मौजूद है. आवश्यकता के आधार पर 12-15 दिनों के लिए, किसी भी समय बिंदु पर कोशिकाओं का उपयोग करें.
- कोशिकाओं (जैसे coverslips या अच्छी तरह से प्लेटों के रूप में) अन्य समर्थन करता है पर चढ़ाया जाता है, जब ऊपर घनत्व को बनाए रखा है यह सुनिश्चित करें कि हो सकता है औरउपयोग करें जब तक ATRA हर 24 घंटा जोड़ने के लिए जारी. प्रयोग से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए नया समर्थन का पालन करने की कोशिकाओं को छोड़ दें.
3. Immunostaining
- Immunostaining के लिए, coverslips पर कोशिकाओं की थाली और (Burry 15 उदाहरण के लिए देखें) स्थापित तरीके का पालन करें.
- उदाहरण के लिए, अप्रत्यक्ष immunofluorescence के लिए, 30 मिनट के लिए आरटी पर, अंधेरे में माध्यमिक फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के साथ तो, एक humidified कक्ष में 1 घंटे के लिए आरटी पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ क्रमिक रूप से सेते हैं, 4% paraformaldehyde या ठंड एसीटोन में तय एक humidified कक्ष में.
- परमाणु counterstaining के लिए DAPI या analogues का प्रयोग करें, और मध्यम विरोधी लुप्त होती में माउंट.
4. Alizarin लाल धुंधला और निष्कर्षण
- Coverslips पर कोशिकाओं थाली.
- 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में coverslip डुबो कर कोशिकाओं को ठीक करें.
- Alizarin लाल धुंधला समाधान की कुछ बूँदें (1 मिलीग्राम / एमएल, पीएच 5.5) के साथ कोशिकाओं को कवर30 मिनट के लिए.
- नल के पानी के साथ coverslips धो लें. गिलास स्लाइड पर ग्लिसरॉल की एक बूंद के साथ माउंट और एक ईमानदार 10X पर माइक्रोस्कोप और 20X बढ़ाई छवियों का उपयोग कर ले.
- उपरोक्त प्रक्रिया के बाद, नल के पानी में स्लाइड्स डुबो कर coverslips ठीक हो.
- एक अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक coverslip रखो.
- 60% परक्लोरिक एसिड (मात्रा पूरी तरह से कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त हो गया है) जोड़ें और कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस हे / एन छोड़ दें.
- 450 एनएम तरंगदैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री से सतह पर तैरनेवाला के ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें.
- सेल नंबर के लिए मूल्यों को सामान्य करने के लिए, 10 मिनट के लिए सेल तैयारी को कवर करने के जानूस ग्रीन (पीबीएस में 0.2% समाधान) जोड़ें.
- Ultrapure पानी के साथ सावधानी से धो लें.
- 0.5 एन एचसीएल (मात्रा सभी कक्षों को कवर करने के लिए पर्याप्त हो गया है) जोडें और कुछ सेकंड के लिए हाथ से धीरे से मिलाने.
- स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री से 615 एनएम पर absorbance पढ़ें.
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Representative Results
परिणाम 5 से 10 स्वतंत्र प्रयोगों को प्राप्त किया गया.
सेल आकारिकी
ए.ए. / जीपी प्राथमिक कोशिकाओं ज्यादातर पत्थर की तरह सुविधाओं, परिपक्व अस्थिकोरक की विशेषता है इलाज. Interspersed डालियां फैला कोशिकाओं (चित्रा 1 ए में लाल तीर द्वारा संकेत के रूप में) की संभावना कुछ osteocytes का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो पाया जा सकता है.
ATRA उपचार के साथ, कोशिकाओं के तेजी से आम तौर पर 2 दिन बाद मनाया जाता है जो असर दिखाने की शुरुआत. चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, डालियां फैला कोशिकाओं उनके डेन्ड्राइट का विस्तार करने के लिए अंतरिक्ष की आवश्यकता है. ATRA आय के साथ उपचार के रूप में, असर उत्तरोत्तर संख्या और जटिलता में वृद्धि, 1 सी और 1 डी आंकड़े. Rhodamine लेबल phalloidin द्वारा filamentous actin का धुंधला phalloidin, चित्रा 2 से चिह्नित कर रहे हैं, जो सेल प्रक्रियाओं, पर प्रकाश डाला गया.
मैट्रिक्स उत्पादन
<पी वर्ग = "jove_content"> प्राथमिक अस्थिकोरक पर और कोशिकाओं के बीच जम जाता है और लाल धुंधला हो जाना, चित्रा 3A Alizarin से देखे जा सकते हैं जो calcified मैट्रिक्स, की बड़ी मात्रा में उत्पादन. Osteocytes calcified बाह्य मैट्रिक्स उत्पादन, और ATRA-incubated कोशिकाओं, चित्रा 3 बी में पूरी तरह से नकारात्मक Alizarin लाल धुंधला परिणाम नहीं है. तदनुसार, Alizarin लाल से कोई भी या एक न्यूनतम मात्रा निष्कर्षण प्रक्रिया, चित्रा -3 सी के बाद मापा जा सकता है.Osteocyte मार्करों और उत्पाद
Sclerostin ATRA इलाज कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की है, चित्रा 4. Immunostaining तीव्र cytoplasmic अभिव्यक्ति और सेल प्रक्रियाओं के साथ सकारात्मक डॉट्स की उपस्थिति का पता चलता है. Immunofluorescence द्वारा एक मजबूत FGF23 सकारात्मकता सेल शरीर में या सेल प्रक्रियाओं के साथ, या तो ATRA इलाज कोशिकाओं, चित्रा 5 में detectable है.
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चित्रा 1. लाइट माइक्रोस्कोपी. प्राथमिक अस्थिकोरक ए.ए. / जीपी (ए) (पैमाने बार 100 मीटर) के साथ 5 दिन ऊष्मायन के बाद एक प्रमुख आयातफलकी उपस्थिति दिखाते हैं. विरल डालियां फैला कोशिकाओं (ए) (तीर) की पहचान की जा सकती है. ATRA उपचार (बी) (पैमाने बार 100 मीटर) के 2 दिन बाद, कोशिकाओं एक अधिक लम्बी आकार प्रदर्शित और dendrites स्पष्ट रूप से पता लगाने योग्य दिखाई देते हैं. केवल arborized कोशिकाओं ATRA ऊष्मायन (सी) (पैमाने बार 100 मीटर) के 5 दिन बाद मनाया, और उच्च आवर्धन (डी) (पैमाने बार 50 माइक्रोन) पर बेहतर detectable हैं किया जा सकता है.
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चित्रा 2. एक्टिन रेशा धुंधला हो जाना. Actin filaments rhodamine-falloidin धुंधला द्वारा पहचाने जाते हैं. चित्रा 3 दिनों के लिए ATRA साथ इलाज किया कोशिकाओं से प्राप्त एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है. पहले ही इस समय बिंदु पर, filamentous actin सेल प्रक्रियाओं के विकास का एक प्रमुख घटक के रूप में प्रकट होता है. स्केल बार: 50 माइक्रोन.
चित्रा 3. Calcified जमा. ATRA-incubated कोशिकाओं (बी) (पैमाने बार 50 माइक्रोन) में नकारात्मक है जबकि Alizarin लाल धुंधला विस्तारपूर्वक, ए.ए. / जीपी (ए) (पैमाने बार 100 मीटर) के साथ 5 दिन ऊष्मायन के बाद अस्थिकोरक में मनाया जाता है. एक गहरा फर्क SPECT से मापा जा सकता हैroscopy Alizarin निष्कर्षण (सी) के बाद.
चित्रा 4. Sclerostin. Sclerostin सकारात्मकता कोशिका द्रव्य में और ATRA (पैमाने बार 50 माइक्रोन) के साथ incubated कोशिकाओं की कोशिका प्रक्रियाओं के साथ का पता चला है.
चित्रा 5. FGF23. FGF23 immunostaining ATRA इलाज कोशिकाओं (पैमाने बार 50 माइक्रोन) में तीव्र है.
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Discussion
पिछले वर्षों में osteocyte हड्डी में सबसे केंद्रीय कक्ष के रूप में उभरा है. अनुसंधान अग्रिमों उत्तरोत्तर हड्डी रोगों की एक किस्म के लिए उपन्यास और बेहतर उपचार को डिजाइन करने के लिए भारी मूल्य के हैं, जो पहले से न सोचा या अप्रमाणित osteocyte संपत्तियों के एक नंबर खुलासा कर रहे हैं. हालांकि, osteocyte जीव विज्ञान की जांच osteocyte तरह सेल लाइन MLO-Y4 उपलब्ध कराया गया था पहले अस्थिकोरक एक लंबी अवधि में किराए की कोशिकाओं के रूप में इस्तेमाल किया गया है कि इस हद तक इन विट्रो मॉडल की सीमित उपलब्धता से पीड़ित कर दिया गया है. अभी हाल ही में एक सशर्त अमर सेल लाइन sclerostin और FGF23 व्यक्त देर osteocytes डालियां फैला करने के लिए भेदभाव किया जा सकता है, जो एक ही समूह के 16, द्वारा शुरू की गई थी. इन सेल लाइनों का चरम मूल्य प्रश्न के अंतर्गत नहीं है, यह बहुत अच्छी तरह से प्राथमिक कोशिकाओं को और अधिक vivo स्थिति के समान है और प्राथमिक osteocytes fr प्राप्त करने के लिए संभावना है कि प्रस्ताव में जाना जाता हैओम ट्रांसजेनिक जानवर विशिष्ट आणविक मार्ग पर कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए.
अलगाव और पहले 5,6 और बाद में चूहा और माउस हड्डियों 17,7 से लड़की हड्डियों से प्राप्त प्राथमिक osteocytes, की संस्कृति, अत्यंत उपयोगी हैं, लेकिन उनके अलगाव की प्रक्रिया प्रति कोशिकाओं का केवल एक छोटी संख्या उत्पन्न करता है, और सेल पवित्रता एक बड़ी हद तक निर्भर करता है व्यक्तिगत विशेषज्ञता पर. इसलिए, विधि वर्तमान में केवल प्रयोगशालाओं की सीमित संख्या के द्वारा किया जाता है.
अन्य अनुसंधान समूहों के लिए एक अधिक मनोवैज्ञानिक वातावरण का गठन लेकिन बाद में अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए एक बाधा हैं कि तीन आयामी mineralized matrices 18,19, में प्रगतिशील एम्बेड के माध्यम से अस्थिकोरक के टर्मिनल भेदभाव उत्प्रेरण द्वारा परिपक्व osteocytes प्राप्त किया है. यह मैट्रिक्स खनिज 20, साथ ही कम ऑक्सीजन तनाव 21, osteocyte परिपक्वता के शारीरिक चलाता है कि सच है. हालांकि, एक मुलाकातhodology इन दो स्थितियों से बचने व्यवहार्यता को बढ़ाने और कोशिकाओं के उपयोग का विस्तार कर सकता. अस्थिकोरक परिपक्व करने के लिए retinoic एसिड जोड़ने के होते हैं, जो हमारी प्रस्तावित विधि 10,,, सरल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और सेल अभिकर्मक 22 या महंगा विकास के उपयोग के 23 कारकों से बचा जाता है.
प्रारंभिक प्रयोगों की एक श्रृंखला के साथ, हम शुरू सेल संख्या कई dendrites और कहनेवाला संपर्क का एक महत्वपूर्ण कदम है, कंडीशनिंग उचित गठन है कि निर्धारित. बहुत कम संख्या कहनेवाला आसंजन के नुकसान में परिणाम जबकि एक भी उच्च चढ़ाना सेल घनत्व सेल दुख और मौत के लिए अग्रणी, जटिलता और सेल प्रक्रियाओं के विस्तार को प्रभावित करता है.
महत्वपूर्ण बात है, ATRA खुराक और सेल आकारिकी की दैनिक निगरानी का समायोजन अत्यधिक क्योंकि ATRA को संवेदनशीलता को प्रभावित कर सकता है, जो प्राथमिक कोशिकाओं के निहित परिवर्तनशीलता की सिफारिश कर रहे हैं. इन पहलुओं को विशेष रूप से प्रासंगिक whe बन सकता हैn कार्यप्रणाली ट्रांसजेनिक मॉडल को लागू किया जाता है.
डेन्ड्राइट filamentous actin से समृद्ध होती हैं क्योंकि सेल प्रक्रियाओं का विकास, actin धुंधला द्वारा नजर रखी जा सकती है.
यह अच्छी तरह से osteocytes calcified मैट्रिक्स उपज नहीं है कि जाना जाता है, और Alizarin लाल धुंधला की पूरी नकारात्मकता तक प्रगतिशील कमी के रूप में दिखाया ATRA ऊष्मायन तेजी से, यह समाप्त होता है. इस बीच, ATRA सबसे विशेष रूप से 24 sclerostin प्रसिद्ध osteocyte मार्करों की अभिव्यक्ति लाती है, और FGF23, हड्डी और 25 को संभालने प्रणालीगत फॉस्फेट में शामिल एक मौलिक वृद्धि कारक का उत्पादन सुनिश्चित करता है. इसलिए, osteocytes में FGF23 और sclerostin के कार्यात्मक भूमिका की जांच करने के उद्देश्य से आगे के अध्ययन में इन अणुओं की अंतर्जात उत्पादन द्वारा सुविधा होगी.
संक्षेप में, हम retinoic एसिड के साथ इलाज प्राथमिक calvaria कोशिकाओं से परिपक्व osteocytes का एक सजातीय जनसंख्या उत्पन्न बताते हैं कि,जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक जानवर दोनों से osteocytes की सरल और तेजी से तैयार करने की इजाजत दी refore. अन्य तरीकों की तुलना में हमारे प्रोटोकॉल कई फायदे, मुख्य रूप से साधारण आवेदन और उच्च reproducibility पेश करने के लिए लगता है. osteocyte परिपक्वता की प्रक्रिया एक 5 दिन की सीमा में होती है कि कई चरणों के माध्यम से प्रक्रियाओं का प्रसार प्रारंभिक से कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या में अध्ययन किया जा सकता है. एक और लाभ यह है के रूप में, परिपक्व osteocytes असीमित आणविक और कार्यात्मक assays के आवेदन की अनुमति, mineralized मैट्रिक्स आसपास के पूर्ण अभाव में प्राप्त कर रहे हैं.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
अनुदान "PROGETTO एक concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010 'के प्रबंध निदेशक के लिए, और Associazione बैम्बिनो Nefropatico एबीएन Onlus, मिलानो द्वारा प्रदान किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
References
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