Summary
Behandling av primära mus-osteoblaster med retinsyra producerar en homogen population av förgrenade celler som bär morfologiska och molekylära egenskaper hos osteocyter. Metoden övervinner svårigheterna att erhålla och bibehålla primär osteocyter i kultur, och kan vara en fördel att studera celler som härrör från transgena modeller.
Abstract
Behovet av osteocyte kulturer är välkänd för den gemenskap av ben forskare; isolering av primära osteocyter är svårt och ger låga cellantal. Därför är det mest använda cellulära systemet den osteocyte liknande MLO-Y4-cellinjen.
Metoden som beskrivs här hänvisar till användningen av vitamin A-syra för att alstra en homogen population av förgrenade celler med morfologiska och molekylära osteocyte funktioner.
Efter isolering av osteoblaster från mus-kalvaria, är all-trans-retinoinsyra (ATRA) sattes till cellmediet och cellövervakning genomföres dagligen under ett inverterat mikroskop. Första morfologiska förändringar kan detekteras efter 2 dagars behandling och differentiering är vanligen avslutad inom 5 dagar, med gradvisa utvecklingen av dendriter, förlust av förmågan att producera extracellulära matrix, nedreglering av osteoblast markörer och uppreglering av osteocyte specifika molekyler.
innehåll "> Daily cellövervakning är nödvändig på grund av den inneboende variationen av galvaniska element, och protokollet kan anpassas med minimal variation på celler från olika stammar mus och tillämpas på transgena modeller.Metoden är enkel att utföra och kräver ingen speciell instrumentering, det är mycket reproducerbar och snabbt genererar en mogen osteocyte befolkningen i fullständig frånvaro av extracellulär matris, som medger användning av dessa celler för obegränsade biologiska tillämpningar.
Introduction
Osteocyter, den mest förekommande ben celltyp, är obotligt differentierade, mycket förgrenade celler djupt belägna i skelettet. Cellkroppen av mogna osteocyter finns i ben luckor och har olika former; osteocyter med avlånga cellkroppar finns i det kortikala benet, medan rundade osteocyter är vanligare i trabekulärt ben 1. Grenade dendriter sträcker sig från cellkroppen och bor i små kanaler kallade canaliculi, bildar en intrikat väv som gör att flera kontakter inte bara med andra osteocyter, men även med andra typer av ben celler, benmärg, blodkärl och tillhörande pericyter. Genom interstitiell vätska som finns i luckor och canaliculi, osteocyter är också ytterst kopplad till cirkulationssystemet, därför att de kan påverka inte bara lokalt utan även systemiska händelser, och tvärtom deras beteende kan regleras av både lokala och systemförändringar 2.
Denstudie av osteocyter har nyligen tagit fart, tack vare flera tekniska framsteg, exempelvis generering av vävnads-och cellspecifika transgena djur, användning av kraftfulla mikroskopitekniker och av hög genomströmning molekylär screening 3,4. Dock är fortfarande ofullständig kunskap om dessa celler, främst på grund av den relativa bristen på adekvat in vitro-modeller. Egentligen har osteocyter alltid varit svårt att få och bibehålla i kultur på grund av den djupa läge, och den låga spridning som kännetecknar en sådan differentierad celltyp.
Under åren har ett antal metoder utvecklats för att isolera primära osteocyter 5-7, även om de i allmänhet producerar låga cellutbyten och bär risken för att ens några förorenande fibroblaster snabbt kommer att växa över den osteocyter 8. Därför har de flesta experimentella in vitro arbete genomförts hittills på den väletablerade osteocyte cell line MLO-Y4 9.
Ytterligare in vitro-metoder kan öka möjligheten att studera dessa celler och skulle kunna förbättra analysen av osteocyte biologi och patofysiologi. Till stor del antas bör sådana metoder vara lätt att reproducera, och skulle inte kräva speciell instrumentering eller mycket långa tider för att nå cellmognad. Viktigt är, i förekommande fall till primära celler, de skulle göra det möjligt att dra fördel av transgena djur. Vi har nyligen beskrivits att behandling av den osteoblast cellinjen MC3T3-E1 och av primära osteoblaster med retinsyra inducerar en snabb förändring fenotyp som leder till utvecklingen av en homogen population av förgrenade celler med morfologiska och molekylära egenskaperna hos osteocyter 10.
All-trans-retinoinsyra (ATRA) är en aktiv metabolisk produkt av vitamin A, som reglerar gentranskription genom bindning av de nukleära retinsyrareceptorer (RAR). RARbinda till DNA som heterodimererna med retinoid X-receptorer (RXR), vilket slutligen leder till modulering av retinoinsyra (RA)-lyhörd målgener 11. ATRA har visats för att modulera differentiering och mognad av flera celltyper, däribland andra förgrenade celler såsom neuronala celler 12 och podocytes 13.
Metoden beskrivs här är baserad på tillsats av ATRA primära osteoblaster. För att vara effektivt måste ATRA som skall tillsättas vid en exakt mognadsstadiet på celler ströks ut med en definierad densitet; i vår erfarenhet dessa villkor är avgörande för att få fenotypen övergången från osteoblaster till osteocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt den nationella och europeiska gällande regler om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och har granskats och godkänts av den etiska kommittén i Milanos universitet.
1. Isolering av primära Osteoblaster
Metoden, med mindre modifiering, följer det förfarande som beskrivs av Dodig et al 14.
- Förbered digesting medium, genom att tillsätta 0,1% kollagenas P och 0,05% trypsin (från 2,5% trypsin 10X, utan fenolrött) med HBSS-medium (Hanks balanserade saltlösning, utan kalcium, magnesium eller fenolrött).
- Använd 3-4 dagar gamla möss (kan förfarandet tillämpas på så få som 1 mus).
- Offra genom halshuggning. Spraya huvudet med 70% etanol och hålla på is. Ta bort hud och muskelskikten av pincett och dissekera / kirurgisk sax.
- Ta försiktigt bort de parietalben ochseparera dem genom att följa den sagittala suturen i två halvor. Se till att benen är fria för suturer och angränsande vävnad och placera enskilda benbitar i brunnsplattor innehållande HBSS-medium tills proceduren är klar.
- Kassera HBSS och lägga till varje brunn i digesting medium under 15 min vid 37 ° C.
- Kasta bort supernatanten.
- Lägg åter den smälta medium för 15 minuter vid 37 ° C.
- Denna tid spara supernatanten och placera den i alfa-MEM (Minimum Essential Medium) kompletterat med 10% FBS (fetalt bovint serum) och 1% streptomycin / penicillin.
- Upprepa steg 1,7 och 1,8 2x.
- Pool tre insamlade fraktioner spin cellerna genom centrifugering vid 425 g i 5 min, kassera supernatanten, tillsätt 3 ml kompletterat alfa-MEM för att resuspendera cellpelleten, och överför till en 25 cm 2-kolv.
- Ändra mediet efter 24 h för att avlägsna skräp och döda celler.
- Tillsätt 50 | ig / ml askorbinsyra (AA) och 3 mM glycerol 2-fosfat-dinatriumsalt-hydrat (GP) till alfa-MEM-medium.
- Därefter ändrar medium (alfa-MEM plus AA / GP) varannan dag.
2. ATRA Protocol
- Utför alla experiment med ATRA (all-trans-retinoinsyra) i ett mörkt rum för att förhindra inaktivering.
- Förbered en 1X trypsin lösning i HBSS medium och hålla vid 37 ° C fram till användning.
- Ta ut mediet från subkonfluenta celler och försiktigt tvätta dem med HBSS.
- Tillsätt 1 ml trypsin, rotera försiktigt kolven så att alla celler som skall täckas av trypsin, och inkubera under 3 minuter vid 37 ° C.
- Kontrollera om den faktiska avlossning av celler under ett inverterat mikroskop.
- Tillsätt 3 ml alfa-MEM-medium för att inaktivera trypsin.
- Recover cellerna och centrifugera i 15 min vid 425 g.
- Resuspendera cellpelleten i färskt medium.
- Placera en droppe i en hemocytometer räkningskammare, låt stå några minuter och räkna cell nummer.
- Placera cellerna i 25 cm 2-kolvar vid en densitet av 10.000 celler / cm 2 med alfa-MEM plus AA / GP. Var medveten om att celltätheten är relevant för en optimal utveckling av cellprocesser och intercellulära kontakter. En startdensitet högre än 10.000 celler / cm 2 försämrar god utveckling av cellprocesser, men lägre cellantal leda till för tidig celldöd, på grund av avsaknaden av intercellulära kontakter.
- Lägg 5 pM ATRA till mediet varje 24 timmar.
- Övervaka celler dagligen för att bedöma morfologi: morfologiska förändringar i allmänhet observeras efter 48 timmar. Om, efter den första 24-48 tim, celler fortfarande förökar sig, förnyad utbredning på ovanstående densitet. En homogen population av mogna osteocyter är närvarande efter 4-5 dagar. Beroende på behov, använder celler som helst punkt, upp till 12-15 dagar.
- När cellerna stryks ut på andra stöd (t.ex. täckglas eller brunnsplattor), se till att ovanstående tätheten bibehålls ochfortsätta att lägga ATRA varje 24 tim fram till användning. Lämna celler att hålla sig till det nya stödet för minst 24 timmar före försöket.
3. Immunfärgning
- För immunfärgning, tallrik cellerna på täckglas och följa etablerade metoder (se till exempel Burry 15).
- Till exempel för indirekt immunofluorescens, fixera i 4% paraformaldehyd eller kall aceton, inkubera i följd med den primära antikroppen vid rumstemperatur under 1 tim i en fuktig kammare, sedan med den sekundära fluorescensmärkt antikropp i mörker vid RT i 30 min, i en fuktig kammare.
- Använd DAPI eller analoger för nukleär motfärgning, och montera i anti-fading medium.
4. Alizarin färgning och Extraction
- Plate cellerna på täckglas.
- Fixera cellerna genom nedsänkning av täckglas i 70% etanol under 10 min.
- Täck cellerna med några droppar alizarin red färgningslösning (1 mg / ml, pH 5,5)under 30 min.
- Tvätta täckglas med kranvatten. Montera med en droppe av glycerol på objektglas och ta bilder med en upprätt mikroskop vid 10X och 20X förstoring.
- Efter ovanstående procedur, återställa täckglasen genom nedsänkning av objektglasen i kranvatten.
- Lägg varje täckglas i en brunnsplatta.
- Tillsätt 60% perklorsyra (den kvantitet måste vara tillräckligt för att fullständigt täcka cellerna) och lämna O / N vid 4 ° C med försiktig omrörning.
- Läs av den optiska densiteten av supematanten genom spektrofotometri vid 450 nm våglängd.
- För att normalisera värdena för cellantal, till Janus Gröna (0,2% lösning i PBS) för att täcka cellpreparatet under 10 min.
- Tvätta noga med ultrarent vatten.
- Tillsätt 0,5 N HCI (mängden måste vara tillräckligt för att täcka alla celler) och skaka försiktigt för hand i några sekunder.
- Läs av absorbansen vid 615 nm genom spektrofotometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultat erhölls från 5 till 10 oberoende experiment.
Cellmorfologin
AA / GP behandlade primära celler har mestadels kullerstensliknande egenskaper, kännetecken av mogna osteoblaster. Varvat förgrenade celler (som indikeras med röda pilar i figur 1 A) kan hittas, som sannolikt utgör en del osteocyter.
Med ATRA behandling, celler börjar snabbt visar förgreningar, som vanligtvis observeras efter 2 dagar. Som visas i figur 1B, förgrenade celler kräver utrymme för att utöka sina dendriter. Eftersom behandling med ATRA intäkterna, förgreningar successivt öka i antal och komplexitet, figurerna 1C och 1D. Färgning av fintrådiga aktin genom rodaminmärkt falloidin belyser cellprocesser, som är märkta med phalloidin, figur 2.
Matrisproduktion
<p class = "jove_content"> Primära osteoblaster producerar stora mängder av förkalkad matris, som ackumuleras över och mellan celler och kan visualiseras genom alizarin red färgning, figur 3A. Osteocyter producerar inte förkalkade extracellulär matrix, och alizarin red färgningsresultat helt negativ i ATRA ruvade celler, figur 3B. Således kan ingen eller en minimal mängd alizarin red mätas efter extraktionsproceduren, figur 3C.Osteocyte Markörer och Produkter
Sclerostin uttrycks av ATRA-behandlade celler, avslöjar figur 4. Immunofärgning intensiv cytoplasmisk expression och närvaron av positiva punkter längs cellprocesser. Med immunofluorescens, är en stark FGF23 positivitet detekterbart i ATRA-behandlade celler, Figur 5, antingen i cellkroppen eller längs cellprocesser.
er.within-page = "alltid"> 
Figur 1. Ljusmikroskopi. Primära osteoblaster visar en dominerande cuboidal utseende efter 5 dagars inkubation med AA / GP (A) (skal 100 mikrometer). Glesa förgrenade celler kan identifieras (A) (pilar). Efter 2 dagar av ATRA behandling (B) (skal 100 um), celler visar en mer långsträckt form och dendriter verkar klart kan spåras. Endast arborized celler kan observeras efter 5 dagars ATRA inkubation (C) (skal 100 um), och är bättre upptäckas vid högre förstoring (D) (skal 50 mikrometer).
jpg "src =" / files/ftp_upload/51465/51465fig2.jpg "/>
Figur 2. Aktin fila färgning. Aktinfilament identifieras av rodamin-falloidin-färgning. Figuren visar ett representativt resultat som erhållits från celler som behandlats med ATRA under 3 dagar. Redan vid denna tidpunkt, verkar rådiga aktin som en viktig komponent i utvecklingen av cellprocesser. Skala bar: 50 pm.
Figur 3. Calcified insättningar. Alizarin red färgning diffust observeras i osteoblaster efter fem dagars inkubation med AA / GP (A) (skalstock 100 um), under det är negativt i ATRA-inkuberade cellerna (B) (skala bar 50 | im). En stor skillnad kan mätas genom SPECTroscopy efter alizarin utvinning (C).
Figur 4. Sclerostin. Sclerostin positivitet detekteras i cytoplasman och längs cellprocesser i celler inkuberade med ATRA (skala bar 50 | im).
Figur 5. FGF23. FGF23 immunfärgning är intensiv i ATRA-behandlade celler (skal 50 mikrometer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste åren har osteocyte har blivit den mest centrala cellen i benet. Forsknings framsteg successivt avslöjar ett antal tidigare varit misstänkta eller obevisade osteocyte egenskaper, som är av enormt värde för att utforma nya och bättre behandling för en mängd olika skelettsjukdomar. Däremot har utredningen av osteocyte biologi lidit av den begränsade tillgången på in vitro-modeller i en sådan utsträckning att osteoblaster har använts som surrogat celler under lång tid innan osteocyte liknande cellinje MLO-Y4 gjordes tillgänglig. På senare tid har ett villkorligt odödlig cellinje infördes av samma grupp 16, som kan differentieras till förgrenad sena osteocyter uttrycker sclerostin och FGF23. Trots det extrema värdet av dessa cellinjer är inte under fråga, är det väl känt att primära celler liknar mer den vivo situationen och erbjuder möjligheten att erhålla primära osteocyter frOM-transgena djur för att utföra funktionella studier av specifika molekylära vägar.
Isolering och kultur av primära osteocyter, först erhållits från chick ben 5,6 och därefter från råtta och mus ben 17,7, är mycket användbara, men deras isolering genererar endast ett litet antal celler per förfarande, och cell renhet förlitar sig i stor utsträckning på individuell kompetens. Därför är metoden används för närvarande endast av ett begränsat antal laboratorier.
Andra forskargrupper har fått mogna osteocyter genom att inducera terminal differentiering av osteoblaster genom progressiv inbäddning i tredimensionella mineraliserade matriser 18,19, som utgör en mer fysiologisk miljö, men är ett hinder för efterföljande forskningsansökningar. Det är sant att matrismineralisering 20, samt låg syrespänning 21, är fysiologiska utlöser osteocyte mognad. Men en träffathodology undvika dessa två förhållanden skulle kunna öka möjligheten och utvidga användningen av cellerna. Vår föreslagna metoden 10, som består av tillsats av retinsyra till mogna osteoblaster, är enkel, mycket reproducerbar och undviker celltransfektion 22 eller användning av dyra tillväxtfaktorer 23.
Med en rad preliminära försök har vi bestämt att start antalet celler är ett kritiskt steg, konditionering korrekt bildandet av flera dendriter och intercellulära kontakter. En alltför hög pläteringscell densitet påverkar komplexiteten och förlängning av cellprocesser, medan alltför låga siffror resultera i förlust av intercellulära adhesioner, vilket leder till cell lidande och död.
Viktigt justering av ATRA dos och daglig uppföljning av cellmorfologin är rekommenderas, på grund av den inneboende variationen av primära celler som kan påverka känsligheten för ATRA. Dessa aspekter kan bli särskilt relevant when metodiken tillämpas på transgena modeller.
Utvecklingen av cellprocesser kan övervakas med aktin-färgning, eftersom dendriter är rika på filamentöst aktin.
Det är väl känt att osteocyter inte producerar förkalkade matrisen, och ATRA inkubation avskaffar det snabbt, såsom visas av en gradvis minskning till fullständig negativitet av alizarin röd färgning. Samtidigt inducerar ATRA expressionen av välkända osteocyte markörer, notably sclerostin 24 och säkerställer produktion av FGF23, en fundamental tillväxtfaktor inblandad i ben och systemisk fosfat hantering 25. Därför kommer ytterligare studier som syftar till att undersöka den funktionella rollen av FGF23 och sclerostin i osteocyter underlättas av den endogena produktionen av dessa molekyler.
Sammanfattningsvis visar vi att behandling med retinoinsyra alstrar en homogen population av mogna osteocyter från primära calvaria kropparna, denrefore vilket ger en enkel och snabb beredning av osteocyter från både vildtyp och transgena djur. Jämfört med andra metoder, verkar våra protokoll för att presentera flera fördelar, främst den enkelt program och hög reproducerbarhet. Processen för osteocyte mognad kan studeras i tillräckligt många celler från den ursprungliga spridning av processer genom flera steg som förekommer i en 5-dagars ramen. Som en ytterligare fördel, är mogna osteocyter erhålls i fullständig avsaknad av omgivande mineraliserad matrix, vilket gör att tillämpningen av obegränsade molekylära och funktionella analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Finansieringen kom från "Progetto en Concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" till MD och Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
References
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J.
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).
- Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
