Anvendelse af retinsyre hentes osteocytter kulturer fra Primary Mouse Osteoblaster

Summary

Behandling af primære muse osteoblaster med retinsyre producerer en homogen population af forgrenede celler, der bærer morfologiske og molekylære egenskaber af osteocytter. Fremgangsmåden overvinder vanskeligheden ved at opnå og bevare primære osteocytter i kultur og kan være fordelagtigt at undersøge celler afledt fra transgene modeller.

Abstract

Behovet for osteocyt kulturer er velkendt for samfundet i knogle forskere; isolering af primære osteocytter er vanskelig og medfører lave celleantal. Derfor er den mest udbredte cellulært system er osteocyt-lignende MLO-Y4 cellelinie.

Fremgangsmåden beskrevet her henviser til brugen af ​​retinsyre til at generere en homogen population af forgrenede celler med morfologiske og molekylære osteocyt funktioner.

Efter isolering af osteoblaster fra mus calvaria er all-trans retinoid syre (ATRA) tilsat til celle medium, og celle kontrollen udføres dagligt under et inverteret mikroskop. Første morfologiske ændringer kan påvises efter 2 dages behandling og differentiering er i almindelighed fuldstændig i 5 dage, med den gradvise udvikling af dendritter, tab af evnen til at producere ekstracellulære matrix, nedregulering af osteoblast markører og opregulering af osteocyt-specifikke molekyler.

indhold "> er nødvendig Daglig overvågning celle på grund af den iboende variabilitet af primærelementer, og protokollen kan tilpasses med minimal variation celler opnået fra forskellige musestammer og anvendes på transgene modeller.

Fremgangsmåden er let at udføre og kræver ikke specielle instrumenter, er meget reproducerbar og hurtigt frembringer et modent osteocyt befolkning i fuldstændigt fravær af ekstracellulær matrix, der tillader anvendelse af disse celler til ubegrænset biologiske anvendelser.

Introduction

Osteocytter, den mest rigelige knogle celletype, er terminalt differentierede, stærkt forgrenede celler dybt placeret inden skelettet. Cellen kroppen af ​​modne osteocytter er indeholdt i knogle mangler og har forskellige former; osteocytter med aflange celle organer findes i barkbenet, mens afrundede osteocytter er hyppigere hos knogletrabecula ^1.. Forgrenede dendritter strækker sig fra cellen kroppen og opholde sig i bittesmå kanaler kaldes canaliculi, danner et indviklet net, der gør flere kontakter, ikke kun med andre osteocytter, men også med andre knogle celletyper, knoglemarv, blodkar og tilhørende pericytes. Gennem interstitielle væske, der er indeholdt i lakuner og canaliculi, osteocytter er også i sidste ende er forbundet til det cirkulerende system, og derfor kan de ikke kun have indflydelse lokale, men også systemiske hændelser, og vice versa deres adfærd kan reguleres af både lokale og systemiske ² ændringer.

Denundersøgelse af osteocytter har for nylig fået momentum, takket være adskillige tekniske fremskridt, såsom generation af vævs-og celle-specifikke transgene dyr, brug af stærke mikroskopi teknikker og af høj-throughput molekylære screening ^3,4. Men viden af disse celler er stadig ufuldstændig, hovedsagelig på grund af den relative knaphed på passende in vitro-modeller. Faktisk har osteocytter altid været vanskeligt at opnå og vedligeholde i kultur på grund af den dybe placering, og det lave niveau af spredning, der kendetegner en sådan differentieret celletype.

Langs år er der blevet udviklet en række metoder til at isolere primære osteocytter ^5-7, selvom de generelt producerer lave celleudbytter og medføre en risiko for, at selv nogle få kontaminerende fibroblaster hurtigt vil overvokse osteocytter ^8. Af denne grund, har mest eksperimenterende in vitro arbejde hidtil blevet gennemført på den veletablerede osteocyt celle line MLO-Y4 ^9.

Yderligere in vitro metoder kan øge muligheden for at studere disse celler og kunne forbedre analysen af osteocyt biologi og patofysiologi. Stort set at blive vedtaget, bør sådanne metoder være let at reproducere, og vil ikke kræve specielle instrumenter eller meget lange gange for at nå cellemodning. Vigtigere er det, hvis det er relevant for primærelementer, ville de gøre det muligt at drage fordel af transgene dyr. Vi har for nylig beskrevet, at behandling af osteoblast cellelinien MC3T3-E1 og primære osteoblaster med retinsyre fremkalder en hurtig ændring fænotype, der fører til udviklingen af en homogen population af forgrenede celler, der bærer morfologiske og molekylære egenskaber af osteocytter ^10.

All-trans-retinoinsyre (ATRA) er en aktiv metabolisk produkt af vitamin A, som regulerer gentransskription ved at binde nukleare retinoinsyrereceptorerne (RAR). RAR'erbinder til DNA som heterodimere med retinoid-X-receptorerne (RXR'er), der førte til modulering af retinsyre (RA)-responsiv målgener ^11. ATRA vist sig at modulere differentiering og modning af flere celletyper, heriblandt andre forgrenede celler, såsom neuronale celler ¹² og podocytes ^13.

Metoden beskrives her, er baseret på tilsætning af ATRA til primære osteoblaster. For at være effektiv, ATRA tilføjes på en præcis modning etape celler udpladet ved en defineret tæthed; i vores erfaring disse forhold er afgørende for at opnå den fænotype skifte fra osteoblaster til osteocytter.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til de nationale og europæiske gældende regler om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål og blev gennemgået og godkendt af den etiske komité på Milanos universitet.

1.. Isolering af Primære Osteoblaster

Metoden med mindre ændringer, følger fremgangsmåden beskrevet af Dodig et al ^14.

1. Forbered fordøje medium ved tilsætning af 0,1% collagenase P og 0,05% trypsin (fra 2,5% trypsin 10X, ingen phenolrødt) til HBSS medium (Hanks Balanced Salt Solution, ingen calcium, magnesium eller phenolrødt).
2. Brug 3-4 dage gamle mus (Proceduren kan anvendes til så få som 1 mus).
3. Sacrifice ved halshugning. Spray hovedet med 70% ethanol og holde på is. Fjern hud og muskel lag af pincetter og Dissecting / kirurgiske saks.
4. Fjern forsigtigt parietale knogler ogadskille dem ved at følge sagittale sutur i to halvdele. Sørg knogler er fri for suturer og andet vedhængende væv og placere individuelle knoglestykker i godt plader indeholdende HBSS medium, indtil proceduren er afsluttet.
5. Kassér HBSS og tilsættes til hver brønd fordøje medium i 15 minutter ved 37 ° C.
6. Supernatanten.
7. Læg igen fordøje medium i 15 minutter ved 37 ° C.
8. Denne gang redde supernatanten og placer den i alfa-MEM (Minimum Essential Medium) suppleret med 10% FBS (føtalt bovint serum) og 1% streptomycin / penicillin.
9. Gentag trin 1.7 og 1.8 2x.
10. Pool de tre indsamlede fraktioner, spin celler ved centrifugering ved 425 g i 5 min, supernatanten, tilsættes 3 ​​ml suppleret alpha-MEM til resuspender cellepelleten, og overføres til en 25 cm ² kolbe.
11. Skift mediet efter 24 timer for at fjerne snavs og døde celler.
12. Tilføj 50 pg / ml ascorbinsyre (AA) og 3 mM glycerol 2-phosphatdinatriumsalt hydrat (GP) til alfa-MEM-medium.
13. Derefter ændre mediet (alfa-MEM plus AA / GP) hver anden dag.

2.. ATRA Protocol

1. Gennemføre alle eksperimenter med ATRA (All-transretinsyre) i et mørkt rum for at forhindre inaktivering.
2. Forbered en 1X trypsin løsning i HBSS medium og holde ved 37 ° C indtil brug.
3. Fjern mediet fra subkonfluente celler og omhyggeligt vaske dem med HBSS.
4. Tilsæt 1 ml trypsin, drej forsigtigt kolben at give alle celler, der skal dækkes af trypsin, og inkuberes i 3 min ved 37 ° C.
5. Check for den faktiske frigørelse af celler under et inverteret mikroskop.
6. Tilsæt 3 ml a-MEM-medium til inaktivering af trypsin.
7. Recover cellerne og centrifugeres i 15 minutter ved 425 g..
8. Resuspender cellepelleten i frisk medium.
9. Placer en dråbe i et hæmocytometer tællekammer, henstår i et par min og tælle cell nummer.
10. Place celler i 25 ^cm2 kolber til en densitet på 10.000 celler / cm ² med a-MEM plus AA / GP. Vær opmærksom på at celledensiteten er relevant for en optimal udvikling af celle processer og intercellulære kontakter. Et udgangspunkt densitet højere end 10.000 celler / cm ² forringer en korrekt udvikling af celleprocesser, men lavere celleantal resultere i for tidlig celledød på grund af fraværet af intercellulære kontakter.
11. Tilsæt 5 uM ATRA til mediet hver 24 timer.
12. Overvåg celler dagligt for at vurdere morfologi: morfologiske ændringer er generelt observeret efter 48 timer. Hvis der efter den første 24-48 timer, er cellerne stadig prolifererende, replate på ovenstående tæthed. En homogen population af modne osteocytter er til stede efter 4-5 dage. Afhængigt af behov anvende celler, på noget tidspunkt op til 12-15 dage.
13. Når celler udstryges på andre understøtninger (såsom dækglas eller godt plader), skal du sørge for, at ovenstående tæthed er vedligeholdt ogfortsætter med at tilføje ATRA hver 24 timers indtil brug. Lad celler til at holde sig til den nye støtte i mindst 24 timer før forsøget.

3. Immunfarvning

1. For immunfarvning, tallerken cellerne på dækglas og følge de etablerede metoder (se f.eks Burry ^15).
2. For eksempel, for indirekte immunfluorescens fastsætte i 4% paraformaldehyd eller kold acetone, inkuberes sekventielt med det primære antistof ved stuetemperatur i 1 time i et fugtigt kammer, derefter med den sekundære fluorescensmærket antistof i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter, i et fugtigt kammer.
3. Brug DAPI eller analoger til nukleare kontrastfarvning, og montere i anti-fading medium.

4.. Alizarin Red Farvning og Extraction

1. Plate cellerne på dækglas.
2. Fikseres cellerne ved at nedsænke dækglas i 70% ethanol i 10 min.
3. Dæk cellerne med nogle dråber alizarin rødfarvning-opløsning (1 mg / ml, pH 5,5)i 30 minutter.
4. Vask dækglassene med ledningsvand. Monter med en dråbe glycerol på objektglas og tage billeder ved hjælp af en opretstående mikroskop ved 10X og 20X forstørrelse.
5. Efter ovennævnte procedure, inddrive de dækglas ved at nedsænke dias i vand fra hanen.
6. Sætte hver dækglas i en brønd plade.
7. Tilføj 60% perchlorsyre (mængden må være nok til helt at dække cellerne), og lad O / N ved 4 ° C med forsigtig rystning.
8. Aflæs den optiske densitet af supernatanten ved spektrofotometri ved 450 nm bølgelængde.
9. At normalisere værdier for celle nummer, tilføje Janus Grøn (0,2% opløsning i PBS) til at dække cellepræparat i 10 min.
10. Vask grundigt med ultrarent vand.
11. Tilsæt 0,5 N HCI (mængden må være nok til at dække alle celler) og ryst forsigtigt med hånden i et par sekunder.
12. Læs absorbansen ved 615 nm ved spektrofotometri.

Representative Results

Resultaterne blev opnået fra 5 til 10 uafhængige forsøg.

Cellemorfologi

AA / GP behandlede primære celler har det meste brosten-lignende funktioner, karakteristisk af modne osteoblaster. Afbrudt forgrenede celler (som angivet med røde pile i figur 1A) kan findes, som sandsynligvis repræsenterer nogle osteocytter.

Med ATRA behandling, celler hurtigt begynde at vise forgreninger, der normalt observeres efter 2 dage. Som vist i figur 1B, forgrenede celler kræver plads til at udvide deres dendritter. Da behandlingen med ATRA provenu, forgreninger gradvist stige i antal og kompleksitet figur 1C og 1D. Farvning af trådformede actin ved rhodamin-mærket phalloidin fremhæver celle processer, der er mærket med phalloidin figur 2.

Matrix Produktion

<p class = "jove_content"> Primære osteoblaster producere store mængder af forkalkede matrix, som akkumuleres over og mellem celler og kan visualiseres ved alizarin rødfarvning, figur 3A. Osteocytter producerer ikke forkalket ekstracellulære matrix, og alizarin rød farvningsresultaterne helt negativ i ATRA-rugede celler, 3B. Følgelig kan måles, ingen eller en minimal mængde af alizarin rød efter ekstraktionsproceduren, figur 3C.

Osteocyt Markers og Produkter

Sclerostin udtrykkes af ATRA-behandlede celler, fig. 4. Immunfarvning viser intens cytoplasmatisk ekspression og tilstedeværelsen af positive prikker langs celleprocesser. Ved immunofluorescens, en stærk FGF23 positivitet er påviselig i ATRA-behandlede celler, figur 5, enten i cellen kroppen eller langs celleprocesser.

er.within-side = "altid">
Fig. 1. Lysmikroskopi. Primære osteoblaster viser en overvejende kubisk udseende efter 5 dages inkubering med AA / GP (A) (Målestokken 100 um). Sparsomme forgrenede celler kan identificeres (A) (pile). Efter 2 dages ATRA behandling (B) (skala bar 100 um), viser celler en mere aflang form og dendritter synes klart kan spores. Kun arborized celler kan observeres efter 5 dages inkubation ATRA (C) (Målestokken 100 um), og er bedre detekterbar ved højere forstørrelse (D) (skala bar 50 um).

jpg "src =" / files/ftp_upload/51465/51465fig2.jpg "/>
Figur 2.. Actin glødetråd farvning. Actinfilamenter identificeres ved Rhodamine-falloidin farvning. Figuren viser et repræsentativt resultat opnået fra celler behandlet med ATRA i 3 dage. Allerede på dette tidspunkt, synes trådformede actin som en vigtig del af at udvikle celle processer. Scale bar: 50 pm.

Figur 3.. Kalcificerede indskud. Alizarin rød farvning diffust observeret i osteoblaster efter 5 dages inkubation med AA / GP (A) (skala bar 100 um), mens er negativ i ATRA-rugede celler (B) (skala bar 50 um). En stor forskel kan måles ved SPECTroscopy efter alizarin ekstraktion (C).

Figur 4.. Sclerostin. Sclerostin positivitet detekteres i cytoplasmaet og langs celle processer i celler inkuberet med ATRA (skala bar 50 um).

Figur 5.. FGF23. FGF23 immunfarvning er intens i ATRA-behandlede celler (skala bar 50 mikrometer).

Discussion

I de seneste år er osteocyt har vist sig som den mest centrale celle i knoglen. Forskning fremskridt gradvis afslører et antal tidligere uventede eller uprøvede osteocyt egenskaber, som er af enorm værdi til at designe nye og bedre behandling for en række af knoglesygdomme. Imidlertid har undersøgelse af osteocyt biologi blevet ramt af den begrænsede tilgængelighed af in vitro-modeller til en sådan grad, at osteoblaster har været anvendt som surrogat celler over en lang periode inden osteocyt cellelinje MLO-Y4 blev stillet til rådighed. For nylig blev en betinget udødeliggjort cellelinie introduceret af den samme gruppe ^16, som kan differentieres til forgrenet sene osteocytter udtrykker sclerostin og FGF23. Selvom den ekstreme værdi af disse cellelinjer er ikke under spørgsmål, det er meget velkendt, at primære celler ligner mere in vivo situationen og giver mulighed for at opnå primær osteocytter frabout transgene dyr til at udføre funktionelle undersøgelser af specifikke molekylære veje.

Isolering og dyrkning af primære osteocytter, først opnået fra chick knogler ^5,6 og efterfølgende fra rotter og mus knogler ^17,7, er ekstremt nyttige, men deres isolation genererer kun et lille antal celler pr procedure, og celle renhed beror i stor udstrækning på individuel ekspertise. Derfor er metoden anvendes i dag kun af et begrænset antal laboratorier.

Andre forskergrupper har opnået modne osteocytter ved at inducere terminal differentiering af osteoblaster gennem progressiv indlejring i tre-dimensionelle mineraliseret matricer ^18,19, som udgør en mere fysiologisk miljø, men er en hindring for efterfølgende forskning applikationer. Det er sandt, at matrixen mineralisering ^20, samt lav oxygenspænding ²¹ er fysiologiske udløsere af osteocyt modning. Men en opfyldthodology undgå disse to betingelser kunne øge gennemførlighed og udvide brugen af ​​cellerne. Vores foreslåede metode ^10, der består af tilsætning af retinsyre til at modne osteoblaster er enkel, meget reproducerbar og undgår celletransfektion ²² eller anvendelsen af dyre vækstfaktorer ^23.

Med en række indledende eksperimenter, vi fastslået, at det begynder celle nummer er et afgørende skridt, konditionering ordentlig dannelse af flere dendritter og intercellulære kontakter. En for høj plating celledensitet påvirker kompleksitet og udvidelse af celleprocesser, mens for lave tal resultere i tab af intercellulære adhæsioner, der fører til celle lidelser og død.

Vigtigere, er justering af ATRA dosering og daglig overvågning af cellemorfologi varmt anbefales, på grund af den iboende variabilitet af primære celler, som kan påvirke følsomheden til ATRA. Disse aspekter kan blive særlig relevant when metoden anvendes på transgene modeller.

Udviklingen af ​​celleprocesser kan overvåges ved actinfarvning, fordi dendritter er rige på filamentøse actin.

Det er velkendt, at osteocytter ikke producerer forkalkede matrix og ATRA inkubation hurtigt afskaffer den, som vist ved en gradvis reduktion til fuldstændig negativitet alizarin rødfarvning. I mellemtiden ATRA inducerer ekspressionen af kendte osteocyt markører, især sclerostin ²⁴ og sikrer produktion af FGF23 en fundamental vækstfaktor er involveret i knogle-og systemisk phosphat håndtering ^25. Derfor vil yderligere undersøgelser med henblik på at undersøge den funktionelle rolle FGF23 og sclerostin i osteocytter lettes ved den endogene produktion af disse molekyler.

Sammenfattende viser vi, at behandling med retinsyre genererer en homogen population af modne osteocytter fra primære calvaria celler, denrefore tillader enkel og hurtig fremstilling af osteocytter fra både vildtype-og transgene dyr. Forhold til andre metoder, vores protokol synes at præsentere flere fordele, primært simpel anvendelse og høj reproducerbarhed. Processen med osteocyt modning kan studeres i et passende antal celler fra den indledende spredning af processer gennem flere trin, der opstår i en 5-dages ramme. Som en yderligere fordel er modne osteocytter opnået i fuldstændigt fravær af omgivende mineraliserede matrix, således at anvendelsen af ​​ubegrænsede molekylære og funktionelle assays.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase P	Roche Applied Science	11213857001
Trypsin	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	Pre-warm at 37 °C before use
Alpha-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	Pre-warm at 37 °C before use
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Streptomycin/Penicillin	Sigma-Aldrich	P4333
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403
Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422
ATRA	Sigma-Aldrich	R2625	Protect ATRA from light
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	Can be added to the secondary antibody
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Janus Green	Sigma-Aldrich	201677
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	176745	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips	World Precision Instruments	501981
Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips	World Precision Instruments	501978
Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved	World Precision Instruments	14394
Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S	World Precision Instruments	501218
Culture flasks	Corning	430168
Well-plates	Corning	3335
Thermanox coverslips	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
Microscope	Zeiss Apotome
Spectrometer	Safas Xenius