Summary
Behandling av primære muse osteoblaster med retinsyre produserer en homogen populasjon av ramified celler som bærer morfologiske og molekylære funksjoner i osteocytter. Fremgangsmåten overvinner vanskeligheten med å oppnå og opprettholde primære osteocytter i kultur, og kan være fordelaktig å undersøke celler avledet fra transgene modeller.
Abstract
Behovet for osteocyte kulturer er godt kjent til fellesskapet av bein forskere; isolering av primær osteocytter er vanskelig og produserer lave celletall. Derfor er det mest brukte mobilsystemet den osteocyte lignende MLO-Y4 cellelinje.
Metoden som her beskrives gjelder bruken av retinsyre for å generere en homogen populasjon av celler med ramified morfologiske og molekylære osteocyte egenskaper.
Etter isolering av osteoblaster fra mus calvaria, er all-trans retinsyre (ATRA) tilsatt til cellen medium, og celle overvåkning utføres daglig, i henhold til et invertert mikroskop. Første morfologiske forandringer kan påvises etter 2 dagers behandling og differensiering er generelt fullført i 5 dager, med progressiv utvikling av dendritter, tap av evnen til å produsere ekstracellulære matriks, nedregulering av osteoblast markører og oppregulering av osteocyte-spesifikke molekyler.
innhold ">, hver celle overvåkning er nødvendig på grunn av den iboende variabilitet av primære celler, og protokollen kan tilpasses med minimal variasjon i celler oppnådd fra forskjellige musestammer og anvendt til å transgene modeller.Fremgangsmåten er enkel å utføre og krever ingen spesielle instrumenter, det er meget reproduserbart, og genererer hurtig en moden osteocyte populasjon i fullstendig fravær av ekstracellulær matriks, slik at bruken av disse celler for ubegrenset biologiske anvendelser.
Introduction
Osteocytter, den mest tallrike beincelletype, er terminalt differensiert, svært ramified celler dypt plassert i skjelettet. Cellen kroppen av modne osteocytter finnes i bein lakuner og har ulike former; osteocytter med langstrakte celle organer er funnet i den kortikale beinet, mens avrundede osteocytter er hyppigere i trabekulært bein en. Forgrenede dendritter strekker seg fra cellekroppen og bor i små kanaler som kalles canaliculi, danner et intrikat nett som gjør at flere kontakter, ikke bare med andre osteocytter, men også med andre beincelletyper, benmarg, blodårer og tilhørende pericytes. Gjennom den interstitielle væsken inneholdt i lacunae og canaliculi, osteocytter er også til slutt er koblet til sirkulasjonssystemet, og derfor kan de påvirker ikke bare lokalt, men også systemiske reaksjoner, og vice versa deres oppførsel kan reguleres av både lokale og systemiske forandringer 2.
DenStudiet av osteocytter har nylig fått fart, takket være en rekke tekniske fremskritt, slik som genereringen av vev-og celle-spesifikke transgene dyr, er bruken av kraftige mikroskopimetoder og high-throughput screening molekyl 3,4. Imidlertid er kjennskap til disse cellene fremdeles ufullstendig, hovedsakelig på grunn av den relative mangelen på tilstrekkelig in vitro modeller. Egentlig har osteocytter alltid vært vanskelig å oppnå og opprettholde i kulturen på grunn av det dype plassering, og den lave grad av spredning som kjennetegner en slik differensiert celletype.
Langs årene, er det utviklet en rekke metoder for å isolere primære osteocytter 5-7, selv om de som regel gi lave celleutbytte og bære risikoen for at enda noen forurensende fibroblaster vil raskt overgrow den osteocytter åtte. Av denne grunn har mest eksperimentelle in vitro arbeid blitt gjennomført så langt på de veletablerte osteocyte celle line MLO-Y4 ni.
Andre in vitro-metoder kan forbedre muligheten for å studere disse cellene, og kan forbedre analysen av osteocyte biology og patofysiologi. Å være stor grad vedtatt, bør slike metoder være lett å reprodusere, og ville ikke kreve spesielle instrumenter eller svært lange tider for å nå celle modning. Viktigere, eventuelt i primærceller, vil de gjøre det mulig å dra nytte av transgene dyr. Vi har nylig beskrevet at behandling av osteoblastcellelinjen MC3T3-E1 og av primære osteoblaster med retinsyre forårsaker en hurtig fenotype forandring som fører til utvikling av en homogen populasjon av celler som bærer ramified morfologiske og molekylære trekk ved osteocytter 10..
All-trans retinsyre (ATRA) er en aktiv metabolsk produkt av vitamin A som regulerer gen-transkripsjon ved binding av de nukleære retinsyre-reseptorer (RARs). RARsbinder seg til DNA som heterodimerer med retinoid X reseptorer (RXRs), til slutt fører til modulasjon av retinsyre (RA)-responsive målgener 11.. ATRA er vist å modulere differensiering og modning av flere celletyper, deriblant andre ramified celler slik som nerveceller 12 og podocytes 13.
Metoden som her beskrives er basert på tilsetning av ATRA til primære osteoblaster. For å være effektiv, har ATRA til å bli lagt på en presis modningsstadiet for cellene belagt med en definert densitet; i vår erfaring disse forholdene er avgjørende for å oppnå fenotype bytte fra osteoblaster til osteocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til nasjonale og europeiske gjeldende forskrift om vern av dyr som brukes til vitenskapelige formål og ble gjennomgått og godkjent av etisk komité av Universitetet i Milano.
En. Isolering av primær Osteoblaster
Fremgangsmåten, med mindre modifikasjoner, følger den fremgangsmåte som er beskrevet av Dodig et al 14..
- Forbered bearbeider medium, ved tilsetning av 0,1% Collagenase P og 0,05% Trypsin (som starter fra 2,5% Trypsin 10X, uten fenolrødt) til HBSS medium (Hanks Balanced Salt Solution, noe kalsium, magnesium, eller fenolrødt).
- Bruk 3-4 dager gamle mus (fremgangsmåten kan anvendes på så få som en mus).
- Sacrifice ved halshogging. Spray hodet med 70% etanol og holde på is. Fjern hud og muskel lag av pinsett og dissecting / kirurgisk saks.
- Forsiktig fjerne parietalbena ogskille dem ved å følge sagittal suturen i to halvdeler. Sørg for at bein er fri for sting og noen tilhenger vev og plassere individuelle bein stykker i brønnplater som inneholder HBSS medium før prosedyren er fullført.
- Kast HBSS og legge til hver brønn på fordøye medium i 15 min ved 37 ° C.
- Kast supernatanten.
- Legg igjen bearbeider medium i 15 min ved 37 ° C.
- Denne gangen spare supernatanten og legg den i alpha-MEM (Minimum Essential Medium) supplert med 10% FBS (Fetal Bovine Serum) og 1% streptomycin / penicillin.
- Gjenta trinn 1,7 og 1,8 2x.
- Pool de tre samlede fraksjoner, spin-celler ved sentrifugering ved 425 g i 5 minutter, kaste supernatanten, tilsett 3 ml supplert a-MEM til cellepelleten suspenderes, og overfør til en 25 cm2 kolbe.
- Endre mediet etter 24 timer for å fjerne rusk og døde celler.
- Tilsett 50 ug / ml askorbinsyre (AA) og 3 mM glycerol 2-fosfat dinatriumsalt-hydrat (GP) til alfa-MEM medium.
- Deretter bytter mediet (alpha-MEM plus AA / GP) annenhver dag.
2. Atrå Protocol
- Gjennomføre alle eksperimenter med Atrå (All-trans retinsyre) i et mørkt rom for å hindre inaktivering.
- Forbered en 1X trypsinoppløsning i HBSS medium og holde ved 37 ° C før bruk.
- Fjern mediet fra subconfluent celler og nøye vask dem med HBSS.
- Tilsett 1 ml trypsin, forsiktig rotere i kolben, slik at alle celler som skal dekkes av trypsin, og inkuberes i 3 min ved 37 ° C.
- Kontroller for selve løsgjøring av celler under et invertert mikroskop.
- Tilsett 3 ml alfa-MEM medium for å inaktivere trypsin.
- Gjenopprette celler og sentrifuger i 15 minutter ved 425 g.
- Resuspender cellepelleten i friskt medium.
- Plasser en dråpe i et hemocytometer telling kammer, tillate å betale for et par min og telle cell nummer.
- Plasser-celler i 25 cm 2 kolber ved en tetthet på 10.000 celler / cm 2 med alfa-MEM pluss AA / GP. Vær oppmerksom på at celletettheten er relevant for optimal utvikling av celleprosesser og inter kontakter. En start densitet høyere enn 10.000 celler / cm 2 svekker riktig utvikling av celleprosesser, men lavere celleantall resultere i for tidlig celledød, på grunn av fraværet av intercellulære kontakter.
- Legg fem mikrometer Atrå til mediet hver 24 time.
- Overvåke cellene daglig for å vurdere morfologi: morfologiske endringer generelt observert etter 48 timer. Dersom det etter den første 24 til 48 timer, blir cellene fremdeles prolifererende, replate på den ovennevnte tetthet. En homogen populasjon av modne osteocytter er til stede etter 4-5 dager. Avhengig av behovene, bruke celler som helst punkt, opp til 12 til 15 dager.
- Når cellene er belagt på andre støtter (for eksempel dekkglass eller godt plater), være sikker på at ovennevnte tetthet opprettholdes ogfortsette å legge ATRA hver 24. time inntil bruk. La cellene til å følge den nye støtten for minst 24 timers før forsøket.
Tre. Immunostaining
- For farging, plate cellene på Dekk og følge etablerte metoder (se for eksempel Burry 15).
- For eksempel, for indirekte immunfluorescens, løse i 4% paraformaldehyd eller kald aceton, inkuberes i rekkefølge med det primære antistoff ved RT i 1 time i en fuktet kammer, og deretter med den sekundære fluorescent-merket antistoff i mørke ved RT i 30 min, i et fuktet kammer.
- Bruk DAPI eller analoger for atomkontra, og montere i anti-fading medium.
4. Alizarin Red Farging og Utvinning
- Plate cellene på dekkglass.
- Fikser cellene ved å dyppe dekk i 70% etanol i 10 min.
- Dekk cellene med noen dråper av alizarin rød farging løsning (1 mg / ml, pH 5,5)i 30 min.
- Vask Dekkglass med vann fra springen. Monter med en dråpe glyserol på glassplater og ta bilder ved hjelp av en oppreist mikroskop på 10X og 20X forstørrelse.
- Etter prosedyren over, gjenopprette Dekkglass ved å dyppe lysbildene i vann fra springen.
- Sett hver dekkglass i en bra plate.
- Til 60% perklorsyre (mengden må være tilstrekkelig til å fullstendig dekke cellene) og la O / N ved 4 ° C med forsiktig omrøring.
- Les den optiske tetthet av supernatanten ved spektrofotometri ved 450 nm bølgelengde.
- For å normalisere verdier for cellenummer, tilsett Janus Grønt (0,2% løsning i PBS) for å dekke celle preparatet i 10 minutter.
- Vask nøye med ultrarent vann.
- Tilsett 0,5 N HCl (mengde må være tilstrekkelig til å dekke alle celler) og ristes forsiktig for hånd i noen sek.
- Les absorbansen ved 615 nm ved spektrofotometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene ble erholdt fra 5 til 10 uavhengige eksperimenter.
Cellemorfologi
AA / GP behandlet primære celler har det meste brosteins har, karakteristisk for modne osteoblaster. Ispedd ramified celler (som angitt med røde piler i figur 1A) kan bli funnet, som sannsynligvis representerer noen osteocytter.
Med Atrå behandling, celler raskt begynne å vise konsekvenser, som generelt er observert etter 2 dager. Som vist i figur 1B, ramified celler krever plass for å forlenge deres dendritter. Som behandling med ATRA provenyet, ramifications gradvis øke i antall og kompleksitet, Figures 1C og 1D. Farging av trådformede aktin ved rhodamin-merket phalloidin høydepunkter celleprosesser, som er merket med phalloidin, Figur 2.
Matrix Produksjon
<p class = "jove_content"> Primær osteoblasts produsere store mengder forkalket matrise, som akkumuleres over og blant celler og kan visualiseres ved alizarin rød flekker, figur 3A. Osteocytter produserer ikke forkalket ekstracellulær matriks, og alizarin red fargingsresultater fullstendig negativ i ATRA-inkuberte celler, figur 3B. Følgelig kan ingen eller minimal mengde av alizarin red bli målt etter ekstraksjon fremgangsmåte, Figur 3C.Osteocyte Markører og produkter
Sklerostin uttrykkes av ATRA-behandlede celler, viser figur 4. Immunostaining intens cytoplasmisk ekspresjon, og tilstedeværelsen av positive punkter langs celleprosesser. Ved immunofluorescens, er en sterk FGF23 positivitet påvist i ATRA-behandlede celler, figur 5, enten i cellekroppen eller langs celleprosesser.
er.within-page = "always"> 
Figur 1. Lysmikroskopi. Primære osteoblaster viser en overveiende kubisk utseende etter 5 dager inkubasjon med AA / GP (A) (Målestokk 100 pm). Sparse ramified celler kan identifiseres (A) (piler). Etter to dager med Atrå behandling (B) (skala bar 100 mikrometer), cellene vise en mer langstrakt form og dendritter vises tydelig synlig. Bare arborized celler kan observeres etter fem dager med Atrå inkubasjon (C) (skala bar 100 mikrometer), og er bedre påvises ved høyere forstørrelse (D) (skala bar 50 mikrometer).
jpg "src =" / files/ftp_upload/51465/51465fig2.jpg "/>
Figur 2. Actin filament flekker. Actin filamenter er identifisert av Rhodamine-falloidin farging. Figuren viser et representativt resultat som oppnås fra celler behandlet med ATRA i 3 dager. Allerede på dette tidspunkt vises trådformede aktin som en hovedkomponent for å utvikle celleprosesser. Målestokk: 50 mikrometer.
Figur 3. Forkalkede avleiringer. Alizarin røde flekker er diffust observert i osteoblasts etter fem dager inkubasjon med AA / GP (A) (skala bar 100 mikrometer), mens er negativ i Atrå-ruges celler (B) (skala bar 50 mikrometer). En enorm forskjell kan måles ved SPECTroscopy etter alizarin ekstraksjon (C).
Figur 4. Sklerostin. Sklerostin positivitet er oppdaget i cytoplasma og langs celleprosesser av celler inkubert med Atrå (skala bar 50 mikrometer).
Figur 5. FGF23. FGF23 farging er intens i Atrå-behandlede celler (skala bar 50 mikrometer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de siste årene har osteocyte har dukket opp som den mest sentrale cellen i beinet. Forskning fremskritt er progressivt avdekke et antall tidligere uventet eller unproven osteocyte egenskaper, som er av enorm verdi for å utforme nye og bedre behandling for en rekke av bensykdommer. Imidlertid har undersøkelser av osteocyte biologi vært plaget av den begrensede tilgjengelighet av in vitro-modeller i en slik grad at osteoblaster har blitt brukt som surrogat celler over en lang periode før osteocyte-lignende cellelinje MLO-Y4 ble gjort tilgjengelig. Mer nylig ble et betinget udødeliggjort cellelinje som innføres av samme gruppe 16, som kan skilles for å ramified sene osteocytter uttrykker sklerostin og FGF23. Skjønt den ekstreme verdien av disse cellelinjer er ikke under spørsmålet, er det vel kjent at primære celler ligner mer in vivo situasjonen og tilbyr muligheten for å oppnå primær osteocytter frOM transgene dyr for å utføre funksjonelle studier på spesifikke molekylære stier.
Isolering og kultur av primære osteocytter, først fremstilt av chick ben 5,6 og senere fra rotte og mus ben 17,7, er meget nyttig, men deres isolasjon genererer bare et lite antall av celler pr prosedyre, og cellerenhet er avhengig i stor grad på individuell kompetanse. Derfor er metoden som benyttes i dag bare av et begrenset antall laboratorier.
Andre forskergrupper har fått modne osteocytter ved å fremkalle terminal differensiering av osteoblaster gjennom progressiv embedding i tredimensjonale mineralisert matriser 18,19, som utgjør en mer fysiologisk miljø, men er til hinder for senere forskning. Det er sant at matrisen mineralisering 20, så vel som lav oksygenspenning 21, er fysiologisk utløser av osteocyte modning. Imidlertid er en oppfylthodology unngå disse to betingelser kan øke gjennomførbarhet og utvide bruken av cellene. Vår foreslåtte fremgangsmåte 10, som består av å legge retinsyre til modne osteoblaster, er enkel, reproduserbar, og unngår celle transfeksjon 22 eller bruk av kostbare vekstfaktorer 23.
Med en serie av preliminære forsøk, fant vi ut at startcellenummer er et kritisk punkt, kondisjone riktig dannelse av flere dendritter og intercellulære kontakter. En for høy pletteringscelletetthet påvirker kompleksitet og utvidelse av celleprosesser, mens for lave tall resultere i tap av intercellulær adhesjon, noe som fører til celle lidelse og død.
Viktigere er justering av ATRA dosering og daglig kontroll av cellemorfologi anbefales på grunn av den iboende variabilitet av primære celler og som kan påvirke sensitiviteten til ATRA. Disse aspektene kan bli særlig relevant When metodikken brukes til å transgene modeller.
Utviklingen av celleprosesser kan overvåkes av aktin flekker, fordi dendritter er rike på filamentøs aktin.
Det er velkjent at osteocytter ikke produserer forkalket matrise, og ATRA inkubering opphever det raskt, som vist ved progressiv reduksjon inntil fullstendig negativitet av alizarin rød farging. I mellomtiden, induserer ATRA ekspresjonen av kjente osteocyte markører, spesielt sklerostin 24, og sørger for produksjon av FGF23, en grunnleggende vekstfaktor involvert i benet og systemisk fosfat håndtering 25.. Derfor vil ytterligere studier for å undersøke den funksjonelle rollen til FGF23 og sklerostin i osteocytter forenkles ved den endogene produksjonen av disse molekyler.
I sammendrag viser vi at behandling med retinsyre genererer en homogen populasjon av modne osteocytter fra primær Calvaria celler,difor tillater enkel og hurtig fremstilling av osteocytter fra både villtype-og transgene dyr. Sammenlignet med andre metoder, synes vår protokoll for å presentere flere fordeler, først og fremst enkel applikasjon og høy reproduserbarhet. Prosessen med osteocyte modning kan studeres i et tilstrekkelig antall celler fra den første spre av prosesser gjennom flere trinn som forekommer i en 5-dagers rammen. Som en ytterligere fordel, er modne osteocytter oppnådd i fullstendig fravær av omgivende mineralisert matrise, slik at anvendelsen av et ubegrenset antall molekylære og funksjonelle analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Finansieringen ble gitt av "Progetto en Concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" til MD, og Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
References
- Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 47 (5), 848-858 (2010).
- Cheng, F., Hulley, P. The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis. Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).
- Paic, F., et al. Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes. 45 (4), 682-692 (2009).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Ann N Y Acad Sci. 1192, 437-443 (2010).
- van der Plas, A., Nijweide, P. J.
- Nijweide, P. J., van der Plas, A., Alblas, M. J., Klein-Nulend, J.
- Stern, A. R., Stern, M. M., Van Dyke, M. E., Jähn, K., Prideaux, M., Bonewald, L. F. Isolation and culture of primary osteocytes from the long bones of skeletally mature and aged mice. Biotechniques. 52 (6), 361-373 Forthcoming.
- Kalajzic, I., Matthews, B. G., Torreggiani, E., Harris, M. A., Divieti Pajevic, P., Harris, S. E. In vitro and in vivo approaches to study osteocyte. Bone. 54 (2), 296-206 Forthcoming.
- Bonewald, L. F. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 17 (1), 61-65 (1999).
- Mattinzoli, D., et al. A novel model of in vitro osteocytogenesis induced by retinoic acid treatment. Eur Cell Mater. 24, 403-425 (2012).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Clagett-Dame, M., McNeill, E. M., Muley, P. D. Role of all-trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation. J Neurobiol. 66 (7), 739-756 (2006).
- Vaughan, M. R., et al. ATRA induces podocyte differentiation and alters nephrin and podocin expression in vitro and in vivo. Kidney Int. 68 (1), 133-144 (2005).
- Dodig, M., et al. Identification of a TAAT-containing motif required for high level expression of the COL1A1 promoter in differentiated osteoblasts of transgenic mice. J Biol Chem. 271 (27), 16422-16429 (1996).
- Burry, R. W. Immunocytochemistry. A practical guide for biomedical research. , Springer. New York Dordrecht Heidelberg London. (2010).
- Woo, S. M., Rosse, rJ., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. J Bone Miner Res. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Gu, G., Nars, M., Hentune, nT. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro. Cell Tissue Res. 323 (2), 263-271 (2006).
- Boukhechba, F., et al. Human primary osteocyte differentiation in a 3D culture system. J Bone Miner Res. 24 (11), 1927-1935 (2009).
- Krishnan, V., Dhurjati, R., Vogler, E. A., Mastro, A. M. Osteogenesis in vitro: from pre-osteoblasts to osteocytes: a contribution from the Osteobiology Research Group, The Pennsylvania State University. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (1), 28-35 Forthcoming.
- Irie, K., Ejiri, S., Sakakura, Y., Shibui, T., Yajima, T. Matrix mineralization as a trigger for osteocyte maturation. J Histochem Cytochem. 56 (6), 561-567 Forthcoming.
- Hirao, M., et al. Oxygen tension is an important mediator of the transformation of osteoblasts to osteocytes. J Bone Miner Metab. 25 (5), 266-276 (2007).
- Brounais, B., et al. Long term oncostatin M treatment induces an osteocyte-like differentiation on osteosarcoma and calvaria. Bone. 44 (5), 830-839 (2009).
- Gupta, R. R., Yoo, D. J., Hebert, C., Niger, C., Stains, J. P. Induction of an osteocyte-like phenotype by fibroblast growth factor-2. Biochem Biophys Res Commun. 402 (2), 258-264 (2010).
- Poole, K. E., et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation. FASEB J. 19 (13), 1842-1844 (2005).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The Osteocyte: An Endocrine Cell and More. Endocr Rev. 34 (5), 658-690 (2013).
