Summary
Tratamiento de los osteoblastos primarios de ratón con ácido retinoico produce una población homogénea de células ramificadas que llevan características morfológicas y moleculares de los osteocitos. El método supera la dificultad de obtención y mantenimiento de osteocitos primarios en cultivo, y puede ser ventajoso para estudiar las células derivadas de los modelos transgénicos.
Abstract
La necesidad de las culturas osteocitos es bien conocido por la comunidad de investigadores de hueso; aislamiento de osteocitos primaria es difícil y produce números bajos de células. Por lo tanto, el sistema celular más utilizado es la línea celular MLO-Y4-osteocitos similares.
El método aquí descrito se refiere al uso de ácido retinoico para generar una población homogénea de células ramificadas con características de osteocitos morfológicos y moleculares.
Después del aislamiento de los osteoblastos de bóveda craneal de ratón, se añade ácido trans-retinoico (ATRA) a medio celular, y seguimiento de células se lleva a cabo todos los días en un microscopio invertido. Primeros cambios morfológicos son detectables después de 2 días de tratamiento y la diferenciación se completa generalmente en 5 días, con el desarrollo progresivo de las dendritas, la pérdida de la capacidad de producir la matriz extracelular, la regulación por disminución de los marcadores de los osteoblastos y la regulación de las moléculas-osteocitos específico.
contenido "> monitoreo de celda diaria es necesaria debido a la variabilidad inherente de las células primarias, y el protocolo se puede adaptar con una mínima variación de las células obtenidas a partir de diferentes cepas de ratón y aplicados a los modelos transgénicos.El método es fácil de realizar y no requiere instrumentación especial, es altamente reproducible, y genera rápidamente una población de osteocitos maduros en ausencia completa de la matriz extracelular, permitiendo el uso de estas células para aplicaciones biológicas ilimitadas.
Introduction
Los osteocitos, el tipo de célula ósea más abundantes, son terminales diferenciadas, células altamente ramificadas profundamente ubicadas dentro del esqueleto. El cuerpo de la célula de osteocitos maduros están contenidas en las lagunas de hueso y tener diversas formas; osteocitos con cuerpos celulares alargados se encuentran en el hueso cortical, mientras que los osteocitos redondeadas son más frecuentes en el hueso trabecular 1. Dendritas ramificadas se extienden desde el cuerpo celular y residen en pequeños canales llamados canalículos, formando una intrincada red que hace múltiples contactos no sólo con otros osteocitos, sino también con otros tipos de células de hueso, médula ósea, vasos sanguíneos y los pericitos asociados. A través del fluido intersticial contenida en lagunas y canalículos, osteocitos son también conectado en última instancia al sistema de circulación, por lo tanto, pueden influir no sólo local, sino también eventos sistémicos, y viceversa su comportamiento puede ser regulada por ambos cambios locales y sistémicos 2.
Laestudio de osteocitos ha cobrado impulso recientemente, gracias a varios avances técnicos, tales como la generación de tejidos y animales transgénicos específicos de células, el uso de técnicas de microscopía de gran alcance y de alto rendimiento de cribado molecular de 3,4. Sin embargo, el conocimiento de estas células es todavía incompleta, debido principalmente a la escasez relativa de adecuada en modelos in vitro. En realidad, los osteocitos han sido siempre difíciles de obtener y mantener en cultivo debido a la ubicación de profundidad, y el bajo nivel de proliferación que caracteriza a un tipo de célula diferenciada tal.
A lo largo de los años, un número de métodos se han desarrollado para aislar osteocitos primaria 5-7, a pesar de que generalmente producen bajos rendimientos celulares y llevan el riesgo de que incluso unos pocos fibroblastos contaminantes se crecer demasiado rápidamente la osteocitos 8. Por esta razón, la mayor parte experimental en el trabajo in vitro ha llevado a cabo hasta ahora en la bien establecida de células osteocitos Line MLO-Y4 9.
Metodologías adicionales in vitro podría aumentar la posibilidad de estudiar estas células y podría mejorar el análisis de la biología osteocitos y fisiopatología. Para ser adoptado en gran parte, tales métodos deben ser fáciles de reproducir, y no requieren instrumentos especiales o tiempos muy largos para llegar a la maduración de células. Es importante destacar que, si es aplicable a células primarias, que harían posible tomar ventaja de los animales transgénicos. Recientemente hemos descrito que el tratamiento de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1 y de los osteoblastos primarios con ácido retinoico induce un cambio de fenotipo rápida que conduce al desarrollo de una población homogénea de células ramificadas que llevan características morfológicas y moleculares de los osteocitos 10.
El ácido trans-retinoico (ATRA) es un producto metabólico activa de la vitamina A, que regula la transcripción de genes mediante la unión a los receptores del ácido retinoico nucleares (RAR). RARunirse al ADN como heterodímeros con los receptores de retinoides X (RXRs), en última instancia conduce a la modulación de ácido retinoico (RA)-sensible genes diana 11. ATRA se ha demostrado que modulan la diferenciación y la maduración de varios tipos de células, entre ellos otras células ramificadas tales como las células neuronales 12 y podocitos 13.
El método aquí descrito se basa en la adición de ATRA a osteoblastos primarios. Para ser eficaz, el ATRA tiene que ser añadido en una etapa de maduración precisa sobre células cultivadas en placas a una densidad definida; en nuestra experiencia, estas condiciones son fundamentales para obtener el interruptor fenotipo de osteoblastos a osteocitos.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la normativa vigente de Europa en cuanto a la protección de los animales utilizados para fines científicos y que fueron revisados y aprobados por el comité de ética de la Universidad de Milán y el Nacional.
1. Aislamiento de osteoblastos primarios
El método, con pequeñas modificaciones, sigue el procedimiento descrito por Dodig et al 14.
- Preparar la digestión de medio, mediante la adición de 0,1% de colagenasa P y 0,05% de tripsina (a partir de 2,5% de tripsina 10X, sin rojo de fenol) a medio HBSS (solución salina equilibrada de Hanks, sin calcio, magnesio, o rojo fenol).
- Utilice 3-4 días de edad ratones (el procedimiento se puede aplicar a tan pocos como 1 ratón).
- Sacrificio por decapitación. Rocíe la cabeza con etanol al 70% y mantener en hielo. Retire las capas de piel y músculo por pinzas de disección y / tijeras quirúrgicas.
- Retire con cuidado los huesos parietales ysepararlos siguiendo la sutura sagital en dos mitades. Asegúrese de que los huesos están libres de las suturas y los tejidos adherentes y colocar piezas óseas individuales en placas de pocillos que contenían medio HBSS hasta que se complete el procedimiento.
- Deseche HBSS y añadir a cada pocillo el medio digerir durante 15 minutos a 37 ° C.
- Eliminar el sobrenadante.
- Añadir de nuevo el medio de la digestión durante 15 minutos a 37 ° C.
- Esta vez guardar el sobrenadante y colocarlo en alfa-MEM (medio esencial mínimo) suplementado con 10% de FBS (suero bovino fetal) y 1% de estreptomicina / penicilina.
- Repita los pasos 1.7 y 1.8 2x.
- Reunir las tres fracciones recogidas, las células de spin por centrifugación a 425 g durante 5 min, descartar el sobrenadante, añadir 3 ml de alfa-MEM suplementado para volver a suspender el sedimento de células, y la transferencia a un matraz de 25 cm 2.
- Cambie el medio después de 24 horas para eliminar los desechos y células muertas.
- Añadir 50 mg / ml de ácido ascórbico (AA) y 3 mM de GlyCerol 2-fosfato de hidrato de sal disódica (GP) al medio de alfa-MEM.
- A partir de entonces, cambiar el medio (alfa-MEM más AA / GP) cada dos días.
2. Protocolo de ATRA
- Llevar a cabo todos los experimentos con ATRA (all-trans retinoico) en una habitación a oscuras para evitar la inactivación.
- Preparar una solución de tripsina 1X en medio HBSS y mantener a 37 ° C hasta su uso.
- Retire el medio de las células subconfluentes y lave cuidadosamente con HBSS.
- Añadir 1 ml de tripsina, gire suavemente el frasco para permitir que todas las células que se cubrirán por la tripsina, y se incuba durante 3 min a 37 ° C.
- Compruebe si el desprendimiento real de las células bajo un microscopio invertido.
- Añadir 3 ml de medio alfa-MEM para inactivar la tripsina.
- Recuperar las células y centrifugar durante 15 minutos a 425 g.
- Resuspender el sedimento de células en medio fresco.
- Coloque una gota en una cámara de recuento del hemocitómetro, dejar reposar durante unos minutos y cuente el cenúmero ll.
- Coloque las células en matraces de 25 cm2 a una densidad de 10.000 células / cm 2 con alfa-MEM más AA / GP. Tenga en cuenta que la densidad celular es relevante para el desarrollo óptimo de los procesos de las células y los contactos intercelulares. Una densidad de partida superior a 10.000 células / cm 2 perjudica el desarrollo adecuado de los procesos celulares, pero menor número de células resulta en la muerte celular prematura, debido a la ausencia de los contactos intercelulares.
- Añadir 5 M ATRA al medio cada 24 horas.
- Monitorear las células diariamente para evaluar la morfología: cambios morfológicos se observan generalmente después de 48 hr. Si, después de las primeras 24-48 horas, las células se siguen proliferando, replate a la densidad anterior. Una población homogénea de osteocitos maduros está presente después de 4-5 días. Dependiendo de las necesidades, utilizar las células en cualquier punto del tiempo, hasta 12-15 días.
- Cuando las células se colocan en otros soportes (como cubreobjetos o-y placas), asegúrese de que se mantiene la densidad de arriba ycontinuar agregando ATRA cada 24 horas hasta su uso. Deja células para adherirse al nuevo soporte para al menos 24 horas antes del experimento.
3. Inmunotinción
- Por inmunoticción, placa las células sobre cubreobjetos y seguir metodologías establecidas (véase, por ejemplo Burry 15).
- Por ejemplo, para inmunofluorescencia indirecta, fijar en paraformaldehído al 4% o acetona fría, se incuban secuencialmente con el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 1 h en una cámara humidificada, a continuación, con el anticuerpo marcado fluorescente secundaria en la oscuridad, a temperatura ambiente durante 30 min, en una cámara humidificada.
- Utilice DAPI o análogos para contratinción nuclear, y montar en un medio de lucha contra la decoloración.
4. Rojo de alizarina Coloración y Extracción
- Placa las células sobre cubreobjetos.
- Fijar las células sumergiendo el cubreobjetos en etanol al 70% durante 10 min.
- Cubrir las células con algunas gotas de solución de tinción con rojo de alizarina (1 mg / ml, pH 5,5)durante 30 min.
- Lavar los portaobjetos con agua del grifo. Montar con una gota de glicerina en portaobjetos de vidrio y tomar las imágenes utilizando un microscopio vertical a 10X y 20X.
- Después de que el procedimiento anterior, la recuperación de los cubreobjetos sumergiendo las muestras en agua del grifo.
- Ponga cada cubreobjetos en una placa.
- Añadir ácido perclórico al 60% (la cantidad debe ser suficiente para cubrir completamente las células) y dejar de O / N a 4 º C con agitación suave.
- Leer la densidad óptica del sobrenadante mediante espectrofotometría a 450 nm de longitud de onda.
- Para normalizar los valores para el número de células, añadir verde de Janus (solución 0,2% en PBS) para cubrir la preparación de células durante 10 min.
- Lave cuidadosamente con agua ultrapura.
- Añadir 0,5 N HCl (la cantidad debe ser suficiente para cubrir todas las células) y agitar suavemente con la mano durante unos segundos.
- Lea la absorbancia a 615 nm por espectrofotometría.
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Representative Results
Resultados Se obtuvieron De 5 a 10 experimentos independientes.
Morfología Celular
AA / GP tratados células primarias tienen características en su mayoría empedradas similar, característico de los osteoblastos maduros. Células ramificadas intercalados (como indican las flechas rojas en la Figura 1A) se pueden encontrar, lo que probablemente representan algunos osteocitos.
Con el tratamiento de ATRA, las células comienzan rápidamente la visualización de ramificaciones, que se observan generalmente después de 2 días. Como se muestra en la Figura 1B, las células ramificadas requieren espacio para extender sus dendritas. A medida que el tratamiento con ATRA procede, ramificaciones aumentan progresivamente en número y complejidad, figuras 1C y 1D. La tinción de actina filamentosa por faloidina marcada con rodamina se destacan los procesos celulares, que están etiquetados por phalloidin, la Figura 2.
Matriz de Producción
<p class = "jove_content"> osteoblastos primarios producen grandes cantidades de matriz calcificada, que se acumula sobre y entre las células y pueden ser visualizados por tinción con rojo alizarina, la Figura 3A. Los osteocitos no producen matriz extracelular calcificada, y resultados de la tinción roja de alizarina completamente negativos en las células incubadas por ATRA, la Figura 3B. En consecuencia, ninguna o una mínima cantidad de rojo de alizarina se pueden medir después del procedimiento de extracción, la figura 3C.Marcadores osteocitos y Productos
Sclerostin se expresa por las células tratadas con ATRA, Figura 4. Inmunotinción revela intensa expresión citoplasmática y la presencia de puntos positivos a lo largo de los procesos celulares. Por inmunofluorescencia, una fuerte positividad de FGF23 es detectable en las células tratadas con ATRA, la Figura 5, ya sea en el cuerpo celular o a lo largo de los procesos celulares.
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Figura 1. Microscopía de luz. Osteoblastos primarios muestran un aspecto cúbico predominante después de 5 días de incubación con AA / GP (A) (barra de escala 100 micras). Células ramificadas dispersas pueden ser identificados (A) (flechas). Después de 2 días de tratamiento con ATRA (B) (barra de escala 100 micras), las células presentan una forma más alargada y dendritas aparecen claramente detectable. Sólo las células arborized se pueden observar después de 5 días de incubación ATRA (C) (barra de escala 100 micras), y son mejores detectable a mayor aumento (D) (barra de escala 50 micras).
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Figura 2. Tinción de filamentos de actina. Los filamentos de actina se identifican mediante tinción con rodamina-falloidin. La figura muestra un resultado representativo obtenido a partir de células tratadas con ATRA durante 3 días. Ya en este punto de tiempo, actina filamentosa aparece como un componente importante del desarrollo de los procesos celulares. Barra de escala: 50 m.
Figura 3. Depósitos calcificados. Tinción con rojo de alizarina se observa de forma difusa en osteoblastos después de 5 días de incubación con AA / GP (A) (barra de escala 100 micras), mientras que es negativa en las células incubadas-ATRA (B) (barra de escala 50 micras). Una profunda diferencia se puede medir por SPECTroscopy después de la extracción de alizarina (C).
Se detecta la Figura 4. Sclerostin. Sclerostin positividad en el citoplasma y a lo largo de los procesos celulares de las células incubadas con ATRA (barra de escala 50 micras).
Figura 5. FGF23. Inmunotinción FGF23 es intensa en las células tratadas con ATRA (barra de escala 50 micras).
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Discussion
En los últimos años la osteocitos se ha convertido en la celda más central en la médula. Avances de investigación están revelando progresivamente una serie de propiedades de osteocitos antes insospechados o no probados, que son de gran valor para el diseño de nuevos y mejores tratamientos para una variedad de enfermedades óseas. Sin embargo, la investigación de la biología osteocitos ha estado sufriendo de la disponibilidad limitada de modelos in vitro hasta el punto de que los osteoblastos se han utilizado como células de sustitución durante un largo período antes de que se hizo la línea celular-osteocitos como MLO-Y4 disponibles. Más recientemente, una línea celular inmortalizada de forma condicional fue presentado por el mismo grupo de 16, que se puede diferenciar a los osteocitos se ramifica a finales de expresar esclerostina y FGF23. Aunque el valor extremo de estas líneas celulares no está en la pregunta, que es muy bien sabido que las células primarias se asemejan más a la situación in vivo, y ofrecen la posibilidad de obtener fr osteocitos primariaanimales transgénicos om para realizar estudios funcionales sobre las vías moleculares específicas.
Aislamiento y cultivo de osteocitos primarias, primero obtenidos a partir de huesos de pollo 5,6 y, posteriormente, de rata y ratón huesos 17,7, son extremadamente útiles, pero su aislamiento genera sólo un pequeño número de células por procedimiento, y la pureza de células se basa en gran medida en la experiencia individual. Por lo tanto, el método se utiliza actualmente sólo por un número limitado de laboratorios.
Otros grupos de investigación han obtenido osteocitos maduros mediante la inducción de la diferenciación terminal de los osteoblastos mediante la incrustación progresiva en matrices mineralizadas tridimensionales 18,19, que constituyen un entorno más fisiológico, pero que son un obstáculo para las aplicaciones de investigación posteriores. Es cierto que la mineralización de la matriz 20, así como una baja tensión de oxígeno 21, son activadores fisiológicos de la maduración de osteocitos. Sin embargo, un conocidohodology evitar estas dos condiciones podría aumentar la viabilidad y extender el uso de las células. Nuestro método propuesto 10, que consiste en la adición de ácido retinoico para madurar los osteoblastos, es simple, altamente reproducible, y evita la transfección de células 22 o el uso de factores de crecimiento caro 23.
Con una serie de experimentos preliminares, se determinó que el número de células de partida es un paso, un acondicionamiento adecuado de formación crítica de múltiples dendritas y contactos intercelulares. Un demasiado alta densidad de célula de recubrimiento afecta a la complejidad y la extensión de los procesos celulares, mientras que los números demasiado bajos dan como resultado la pérdida de adherencias intercelulares, lo que lleva al sufrimiento y muerte celular.
Es importante destacar que el ajuste de la dosis de ATRA y seguimiento diario de la morfología celular son muy recomendables, debido a la variabilidad inherente de las células primarias que pueden afectar a la sensibilidad al ATRA. Estos aspectos pueden llegar a ser particularmente relevante when la metodología se aplica a los modelos transgénicos.
El desarrollo de los procesos de células se puede monitorizar mediante tinción con actina, porque dendritas son ricos en actina filamentosa.
Es bien sabido que los osteocitos no producen matriz calcificada, y la incubación ATRA suprime rápidamente, como se muestra por la reducción progresiva hasta negatividad completa de tinción con rojo de alizarina. Mientras tanto, el ATRA induce la expresión de marcadores de osteocitos bien conocidos, más notablemente Sclerostin 24, y asegura la producción de FGF23, un factor de crecimiento fundamental implicada en el hueso y gastos de envío 25 fosfato sistémica. Por lo tanto, nuevos estudios destinados a investigar el papel funcional de FGF23 y esclerostina en osteocitos se verá facilitada por la producción endógena de estas moléculas.
En resumen, mostramos que el tratamiento con ácido retinoico genera una población homogénea de osteocitos maduros a partir de células primarias calvaria, laRefore permitiendo una preparación sencilla y rápida de los osteocitos tanto de tipo salvaje y animales transgénicos. En comparación con otros métodos, nuestro protocolo parece presentar varias ventajas, principalmente la simple aplicación y la alta reproducibilidad. El proceso de maduración de osteocitos puede ser estudiada en un número adecuado de células de la inicial de la difusión de los procesos a través de varios pasos que tienen lugar en un marco 5-día. Como una ventaja adicional, osteocitos maduros se obtienen en ausencia completa de matriz mineralizada que rodea, lo que permite la aplicación de ensayos moleculares y funcionales ilimitadas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El financiamiento fue proporcionado por el "Progetto una concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" de MD, y Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche Applied Science | 11213857001 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 15400054 | |
| HBSS | Gibco, Life Technologies | 14175129 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Alpha-MEM | Invitrogen, Life Technologies | 22571038 | Pre-warm at 37 °C before use |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Streptomycin/Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| ATRA | Sigma-Aldrich | R2625 | Protect ATRA from light |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in PBS and filter before use. Always work under a chemical hood. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 32670 | Can be added to the secondary antibody |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Janus Green | Sigma-Aldrich | 201677 | |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 176745 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Use with caution (skin and eye protection are recommended) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Fluorsave | Calbiochem - Merck | 345789 | |
| Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5 mm tips | World Precision Instruments | 501981 | |
| Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45 mm tips | World Precision Instruments | 501978 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm curved | World Precision Instruments | 14394 | |
| Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S | World Precision Instruments | 501218 | |
| Culture flasks | Corning | 430168 | |
| Well-plates | Corning | 3335 | |
| Thermanox coverslips | Thermo Scientific Nunc | 12-565-27 | |
| Microscope | Zeiss Apotome | ||
| Spectrometer | Safas Xenius |
References
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