Summary
אנו מתארים שיטות לייצור כמויות גדולות של חמצן microbubbles שומנים מבוסס (LOMs) המיועד לאספקת חמצן לוריד באמצעות הומוגניזציה גבוהה גזירה וריכוז סדרתי.
Abstract
microbubbles גז מלא פותחו כניגוד אולטרסאונד וסוכני משלוח סמים. יכול להיות מיוצר על ידי עיבוד microbubbles פעילי שטח באמצעות sonication, תסיסה מכאנית, מכשירי microfluidic, או הומוגניזציה. לאחרונה, microbubbles חמצן שומנים מבוסס (LOMs) תוכנן כדי לספק חמצן לווריד במצבי חירום רפואי, היפוך היפוקסמיה מסכנת חיים, ומניעת פגיעה באיבר שלאחר מכן, דום לב ומוות. אנו מציגים שיטות לייצור מוגדל של microbubbles מחומצן מאוד באמצעות homogenizer גבוה גזירה לולאה סגורה. התהליך יכול לייצר 2 ליטר של LOMs המרוכז (90% לפי נפח) ב90 דקות. יש בועות וכתוצאה מקוטר ממוצע של ~ 2 מיקרומטר, ופרופיל rheologic בקנה אחד עם זה של דם כאשר מדולל ל60% בנפח. טכניקה זו מייצרת LOMs בקיבולת גבוהה ועם טוהר חמצן גבוה, טוען כי טכניקה זו עשויה להיות שימושית עבור מעבדות מחקר translational.
Introduction
Microbubbles המורכב מחלבון, פולימר, ופגזי שומנים פותחו כוקטורים למשלוח סמים, ריפוי גנטי, וסוכנים בניגוד אולטרסאונד 1-5. בגלל שימושים טיפוליים אלה דורשים התמדת microbubble intravascular, microbubbles כזה מלא בדרך כלל עם גזים אצילים, גבוהים מולקולרי משקל כגון perfluorocarbons 6, שבו יש מסיסות נמוכה בדם ולייצב את 3,4 הבועה.
לאחרונה, microbubbles חמצן שומנים מבוסס (LOMs) תוכנן כדי לספק מינונים טיפוליים של חמצן, אשר עשוי לשמר את אספקת חמצן באיברי מטרה ולמנוע חוסר יציבות המודינמית בתקופות של חסימה בדרכי הנשימה או היפוקסמיה 7. תחליב המיועד לאספקת גז לוריד דורש תכונות עיצוב שונות מאלה המשמשים סוכנים בניגוד אולטרסאונד או משלוח תרופות ממוקד. ראשית, משום שהגוף צורך כמויות גדולות של גז חמצן (~ 200 מיליליטר / דקה), LOMs חייב להיות מיוצר והזריק בקנה מידה גדול. זה דורש שתהליך הייצור יהיה יעיל. שנית, תהליך הייצור צריך להיות בלולאה סגורה על מנת למנוע זיהום חנקן באמצעות החשיפה של LOMs (שאמור להיות מלאות ב100% חמצן) לסביבת אוויר. שלישית, משום שהמטרה של LOMs היא אספקת גז לוריד, את החלק היחסי של גז LOMs צריך להיות מוגדל, תוך הכרה במגבלות שהוטלו על ידי צמיגות תחליב 7. לבסוף, כמו בכל הזרקה תוך ורידית, שליטה מדויקת התפלגות גודל חלקיקים היא חיונית למניעת חסימת כלי הדם 8.
ישנן מספר שיטות שהוקמו לייצור microbubble. Sonication מנצל בעוצמה גבוהה, אולטרסאונד בתדירות נמוכה להחיל את ממשק אוויר הנוזל של תחליב הכולל פעילי שטח, כגון פוספוליפידים amphipathic, בנוכחותו של אמיץ גז לייצר microbubbles 7,9. תהליך זה הוא לשליטה על ידי שינוי אולטרהתדירות צליל, עוצמה ומשך דופק, והתפלגות גודל וכתוצאה מכך יכולים להיות מותאם כדי לייצר microbubbles של התפלגות גודל מסוימת, אם כי sonication משמשת רק לעתים נדירות בייצור של microbubbles קליני בשימוש. מיזוג הוא התסיסה מכאנית האינטנסיבית של פעילי שטח וגז במערכת סגורה, שהוא גם קשה בהיקף של עד כדי להכיל כמויות גדולות 2. מיקרופלואידיקה מבוסס אגל מאפשר שליטה מדויקת של התפלגות גודל microbubble 10-13. אמנם קשה באופן מסורתי בהיקף של עד, רב ערוצים, מיקרופלואידיקה מהירות גבוהה תוארו בו להגביר את יעילות ייצור microbubble 13. Microbubbles מיוצר באמצעות כל אחת מהשיטות הללו עשויים לדרוש תהליכי גודל הפחתה לאחר ייצור, כגון חלוקה צנטריפוגלי 14,15 ו הנפקת microbubble 16,17.
שיטה נוספת שהוקמה לייצור microbubbles מאוד יציב היא homogeniz גזירהation 6, אשר יכול לגרום לדפוס פוספוליפידים משושה ייצוב על משטח microbubble 18. בונה על המושג הזה, אנו מתארים את השילוב של homogenizer גזירה גבוהה בקו כדי ליצור LOMs הרכבה עצמית 19. בתהליך זה, homogenizer מנצל במהירות סיבוב להבים בסמוך למסכי emulsor הרשת בסדר כפולים, יצירת גזירה מכאנית והידראולית גבוהה ליצירת microbubbles. ריכוז סידורי של תחליב השומנים באמצעות מערכת זו מניב שבריר גז מרוכז יותר ויותר, אשר יכול להיות אפילו עוד יותר מרוכז על ידי צנטריפוגה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מערכת Set-up
המערכת מורכבת מאחזקה וריכוז טנק (HCT) מצויד במיקסר בשלב אחד, homogenizer גזירה גבוהה ב-line, משאבת הרים כדי להעביר נוזל בין HCT וhomogenizer, ומחליף חום (איור 1).
- הנח מעוקר, מצוידים עם 2 יציאות בסיס ו -3 יציאות בצד מתחת למיקסר שלב אחד כלי איסוף זכוכית 4 L פעור פה. מנמיכים את ראש המיקסר לפה של כלי השיט ולהבטיח הולם גז חזק באמצעות חותמות גומי או קלטת (על מנת למנוע את זיהום אוויר בסביבת מרחב הראש).
- תתאים אחד נמלי הבסיס (איור 1, # נמל 1) לHCT עם סטרילי "3/8 צינורות (ID) ברורים, כ 10" ארוך, מצויד בברזלי 3 כיוונים בקצה לאוסף של התחליב המרוכז .
- התאם את יציאת הבסיס השנייה צינורות, approximatel (איור 1, # יציאה 2) עם 3/8 סטרילי "(תעודת זהות)y 36 "באורך. להאכיל את הצינור הזה באמצעות משאבת הרים. התאם את המפרצון של homogenizer הגזירה הגבוה עם T-חתיכה כולל שתי יציאות ולחבר באופן הבא: חיבור צינורות מנמל # 2, באמצעות משאבת ההרים ולהתחבר ליציאת הצד של T-החתיכה. צרף את הנמל האחר למכל חמצן באמצעות flowmeter גז חמצן זרימה נמוכה.
- חבר את יציאת השקע של homogenizer הגזירה הגבוה ליציאת הכניסה של מחליף חום באונליין נשמר ב 4 ° C. חבר את יציאת השקע של מחליף החום לנמל השיבה של HCT (איור 1, # נמל 3), יצירת מערכת לולאה סגורה.
- צרף מיכל חמצן (דרך flowmeter) לHCT (איור 1, נמל # 4). צרף צג הרכב גז, כי הוא פתוח לאווירה ליציאה העליונה של HCT (איור 1, # יציאה 5).
- אם עקרות היא רצויים, לעקר את רכיבי זכוכית ומתכת לפני כל שימוש בחיטוי. לעקר את רכיבי צנרת ושיתוף פלסטיקnnectors ידי אתילן אוקסיד לפני כל שימוש. זה חשוב במיוחד אם המוצר הוא להיבדק in vivo.
2. ייצור LOM
- הנח 20 גרם של GMP 1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DSPC) ו10 גרם של כולסטרול בבסיס של HCT. להוסיף 1 ליטר של פלזמה-Lyte לHCT ויד ומערבבים דקות 1, שילוב כמה שיותר שומנים ככל האפשר לשלב מימיים.
- מנמיכים את מיקסר שלב אחד אל השלב המימית, להבטיח כי כל ראש המיקסר מכוסה בשלב המימית. ודא שהחלק העליון של HCT הוא גז חזק (ראה שלב 1.1 לעיל), וכי אין תופעות יציאות פתוחות. הפעל את מקור הגז המחובר ליציאת מס '4 ולחכות עד שבר החמצן של אמיץ HCT מגיע> 95%. ב10 ליטר / דקה (LPM), זה צריך לקחת ~ 10 דקות.
- שימוש במיקסר שלב אחד, לערבב התחליב מבשר על 5 דקות בסל"ד 5,000. התערובת המתקבלת צריכה להופיע לבנה חיוור ואינם מכילה שום LIPI גלויגושי ד. מעורב פעם, תערובת שומנים מים שאינם בשימוש ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 30 ימים לפני שימוש יחיד.
- ראש מערכת הלולאה סגורה כולו עם תחליב המבשר ידי הפעלת משאבת ההרים ב1.3 LPM. ברגע שהמערכת דרוכה, לשמור על המשאבה ב1.3 LPM.
- כדי להתחיל ייצור של LOMs, הדלק את homogenizer הגזירה גבוהה באונליין ל -7,500 סל"ד. מייד לאחר מכן, הפעל את זרימת חמצן לחלק המפרצון של homogenizer ב0.5 LPM. שמור את המיקסר בשלב אחד (בHCT) ב3,500 סל"ד. LOMs נוצרים בממשק של להבי הרוטור ומסכי emulsor בתוך homogenizer ב-line (איור 2). בתוך דקות, נוזל צריך להיות גלוי יותר צמיג. גישה מחמירה יותר היא לקבוע צמיגות כפונקציה של זמן, שבו ניתן לעשות זאת על ידי הסרת aliquots מיום 1 בנמל במהלך ייצור וניתוח עם viscometer.
הערה: אם בועות אוויר נראות לעין נמצאות בצינור יציאה מהמיקסר, חמצןתזרום לhomogenizer באונליין הוא גבוה מדי. לכיל את זרימת גז עד הנוזל הוא אטום ולא מכיל בועות גז גלויות. - להפעיל את המערכת במשך 15 דקות, ולאחר מכן לכבות את homogenizer הגזירה הגבוה וכניסת החמצן אליו. תמשיך להפעיל את מיקסר שלב אחד בHCT עד תחליב מוסר; זה מפחית את הסיכון הפרדת פאזות ושומר על המוצר יחסית אחיד בתוך HCT.
הערה: הנפח של תחליב הגז מלא צריך להגדיל בכ 2-3x בשלב ריכוז סדרתי. אם זה לא, בדוק כדי להבטיח חמצן שזורם לתוך homogenizer הגזירה הגבוה וכי ריכוזי שומנים בתחליב המבשר נכונים. יעילות של ייצור יורדת ככל שריכוז שומנים בדם יורד.
3. איסוף, ריכוז, הערכה, וחפצים של LOMs
- צרף סטריליים, שונה 140 מיליליטר מזרק luer נעילה לברזלים צמודים לנמל בסיס המס '1 בכלי האיסוף. צייר את 100 מיליליטר של נוזל. חוזקה כובע מזרק וחזור על פעולה עד שכל הנוזל הוסר.
- שינוי מזרקים על ידי נסיגה של אוויר 100 מיליליטר לתוך המזרק ולאחר מכן מנסר את בוכנת מזרק וחומר עודפים מעל סימן מיליליטר 140. מלא ומזרקים ריקים באמצעות מלקחיים שיניים לצייר את הבוכנה. שינוי זה מאפשר לצנטריפוגה קלה יותר.
- מזרקים צנטריפוגה עם הסוף הכתיר אוריינטציה כלפי מטה בצנטריפוגה דלי (4 מעלות) בקירור ב 225 XG 10 דקות.
- שלוש שכבות של חומר יופיעו לאחר צנטריפוגה. לגרש את השכבה התחתונה של שלב מימיים מעונן עודף וזורק. השכבה השנייה היא לבנה בוהקת ומכילה LOMs המרוכז. העבר את הקצף מרוכז למזרק גז חדיר באמצעות ברזלים שלוש דרך על מנת למנוע זיהום גז סביבה. מחק את השכבה הסופית, המכילה גז חמצן חופשי מLOMs מקרע.
- ניתן להעריך איכות קצף על ידי להגיע ≥ גז 90% מקצף מרוכז. Calculאכלתי ריכוז גז באופן הבא:
% בנפח גז = [(משקל קצף / קצף נפח) - 1] x 100- כבקרת איכות שנייה, microbubbles הגודל ידי התקדרות אור כדי לקבוע אם גודל חלקיקים נמצא בטווח הצפוי. יצוין, כי שינוי בזמן הומוגניזציה או ניסוח עשוי לשנות גודל בועה.
- חוזקה מכסה את מזרק הזכוכית עם הולם luer נעילה. יכול להיות מדולל LOMs המרוכז עם פלזמה-Lyte בעת השימוש. ניתן לאחסן את מזרקים ב22, 4, או -20 º C; טמפרטורות קרות יכולות לספק יציבות חיי המדף משופרת 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המגון גזירה גבוה מאפשר ייצור יעיל (כלומר בתוך יום אחד) של LOMs מספיק למחקר בבעלי חיים ואינו דורש מומחיות טכנית. ברגע שבקיא, עד 2 ליטר של LOMs המרוכז יכול להיות מיוצר ב90 דקות.
גודל microbubble ומורפולוגיה הוערכו על ידי מיקרוסקופ אור ועל ידי התקדרות אור. כאשר מדגם 10 μl של LOMs היה דמיינו, LOMs הכדורי היו האמור, כמו גם מיעוט יחסי של שומנים בדם פסולת (איור 3 א). הדבר נכון במיוחד כאשר משמש מוצר GMP. כאשר המדגם זהה של LOMs הוערך על ידי התקדרות אור, קוטר החלקיקים הממוצע היה 2.624 ± 0.332 מיקרומטר (SD). יותר מ 90% מLOMs היו <10 מיקרומטר בקוטר, והאוכלוסייה הייתה polydisperse (איור 3 ב).
צמיגות חומר מתחלב הייתה תלויה במידה רבה בשבריר גז (ולכן, על ריכוז microbubble). שני מיליליטר aliquotsשל LOMs של ריכוזי גז שונים נחקרו באמצעות זרימה לטאטא מצב יציב באמצעות גיאומטריה צלחת מקבילה 40 מ"מ כמו מתח היה מגוון מ0.1 ל10,000 μN · מ '. כל השברים גז LOM תערוכת גזירה דליל התנהגות, ותופעה זו בלטה בשברי דלק גבוהים יותר. LOMs מכיל גז 60% נפח הציג פרופיל rheological (איור 4 א) דומה לדם.
לבסוף, תכולת החמצן (כולל חלק גז וריכוז חלקי של חמצן) של LOMs נבדקה על ידי הוספת כמויות משתנות של חמצן בתוך LOMs 60% נפח לaliquots של דם האנושי desaturated עם גירעון חמצן ידוע. כפי שתואר לעיל, את תכולת החמצן של LOMs ניתן לחשב מהעלייה בריכוז oxyhemoglobin 7. הקשר בין נפח חמצן הוסיף בתוך LOMs ועליית הנפח בתכולת חמצן של הדם היה 1.053 ± .03025 (SD) (95% CI = 0.9865-1.120) (איוריור 4 ב), המצביע על כך LOMs נבדק הכיל חמצן כמעט 100%, הציג כמה כיסי גז לכוד (שלא ביעילות העברת חמצן לדם, אבל לצוף החוצה במהירות), ויעילות העברת מטען החמצן כולו שלהם לדם אדם במבחנה.
איור 1. ייצור ההתקנה סכמטי. LOMs מופק באמצעות, homogenizer גבוה גזירה באונליין במערכת סגורה. LOMs מתקיים בתוך אחזקה וריכוז טנק (HCT) תחת ערבוב מתמיד. התחליב מועבר דרך המערכת באמצעות משאבת הרים. חום שנוצר על ידי homogenizer מוסר באמצעות מחליף חום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. </>
איור 2. הרכבה עצמית של LOMs בתוך מסך emulsor רשת בסדר. להב) מסתובב במהירות עוברת מעל מסך emulsor רשת בסדר, יצירת אפקט סיפון שמושך בשלבים מימיים וגז. בועות חמצן זעירות נוצרות על ידי גזירה, ומוקפות במהירות על ידי זנבות שומנים ההידרופובי של פוספוליפידים amphipathic, יצירת בועת הרכבה עצמית גז מלא (ב ').
איור 3. אפיון LOMs. Photomicrograph נציג LOMs הכדורי מציג התפלגות גודל polydisperse). סרגל קנה מידה =10 מיקרומטר. B) חלוקת גודל של LOMs כפי שהוערך על ידי התקדרות אור. = נתונים כלומר, שגיאה = SEM.
איור 4. מאפיינים של LOMs centrifuged והמרוכז.) פרופיל rheological של תחליב LOM ב60, גז 70 ו90% בנפח. דילול של קצף מרוכז לגז 60% נפח תשואות פרופיל rheological (המטוקריט 40%) דומה לדם אדם. = נתונים כלומר, שגיאה = SEM. ב) הקשר בין תכולת חמצן של LOMs הוסיף לדם אנושי והעלייה נמדדת בתכולת חמצן של הדם. = נתונים כלומר, שגיאה = SEM, קו = רגרסיה ליניארית עם 95% CI של הקו מיטבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצעדים החשובים ביותר ליצירת LOMs המרוכז, מחומצן מאוד כוללים: 1) להבטיח כי האמיץ בתוך HCT נשאר מחומצן באופן מלא; 2) להבטיח כי הטוהר של חומרים בלתי פעילים שומנים הוא אופטימלי (כולל תנאי אחסון ושימוש במוצרי GMP); 3) להבטיח כי שומני האבקה לערבב לחלוטין עם השלב המימית לפני תחול המערכת; ו4) הקדשת תשומת לב לעלייה בשבריר גז בתוך HCT כדי להבטיח שעוצמת השבר של גז אינו עולה 70%.
השיטה שאנו מתארים כאן מנצלת המגון גזירה גבוה כדי ליצור microbubbles החלול. שומני amphipathic מושעים עם השלב מימיים, המשמש לביצוע השומנים לתוך homogenizer באונליין. שומני כיתה GMP מנוצלים במחקרי vivo, והם מעדיפים בדרך כלל משום שהם מכילים אגרגטים שומנים פחות וזיהומים. שומנים הם גם כפופים לחמצון שומנים בדם (במיוחד כאשר הם מאוחסניםבתוך נוזל חומץ) וזיהום חיידקים. LOMs נוצרים הזנבות הידרופובי כאשר לארגן microbubbles גז סביב קטן חמצן נוצר בתוך homogenizer ב-line (איור 2). מאחד LOMs ב7,500 סל"ד מכפיף microbubbles ללחצים מכאניים נוספים כפי שהם הסתובבו בין קצות להבי הרוטור והקיר הפנימי של גלגל המכון. LOMs גם לעבור גזירה הידראולית כפי שהם נאלצים במהירות גבוהה דרך מסך emulsor רשת Ultra-בסדר, הקטנת גודל חלקיקים נוסף. כוחות הגזירה לייצר חום בתוך homogenizer באונליין ומקומי במיקסר שלב אחד; מחליף חום באונליין לפני ההחזרה לHCT יש צורך להסיר את החום הזה. העדרו של מחליף חום עלול להעלות טמפרטורות מעל טמפרטורת מעבר השלב של השומנים בדם (C ° 55 לDSPC), אשר מגדיל את הנזילות של השומנים בדם ותוצאות בירידה במוצר. יצירת התחליב בתוך סגור, ב-line מכשיר מבטיח כי oxyge הטהורn הוא שולב ליבת LOM על ידי מניעת זיהום אוויר. יתר על כן, LOMs נחשפים ללא הרף לעם אמיץ הגזים של HCT. לכן זה הכרחי כדי להבטיח את אפקט היניקה שנוצר על ידי מערבל המעבדה בתוך HCT אינו יוצר היפוך של זרימת אוויר מן האטמוספרה לתוך HCT (באמצעות צג הרכב גז, שהוא פתוח לאטמוספרה כדי למנוע לחץ קבוע של HCT) . שיעורי זרימת גז החמצן שתוארו כאן צריכים להיות מספיק כדי למנוע את התופעה הזאת.
מחזור של התחליב דרך homogenizer באונליין בשלב הריכוז הסידורי יוצר LOMs נוסף מפוספוליפידים 'שאינו בשימוש' שנותרו בשלב המימית, וגם מכפיף LOMs שלם למריחה חוזרת ונשנית, אשר עשוי להמשיך להקטין את גודל חלקיקים. ריכוז חלקיקים בגודל וגז יכול להיות מותאם ולכן על ידי התאמת מהירות מיקסר, emulsor מסכים, גודל רשת, וזמן ריצה (משך כלומר של ג הסידוריoncentration צעד). תסיסה מכאנית מייצרת התפלגות גודל polydisperse. התפלגות הגודל רחבה מאפשרת לאריזה הדוקה יותר של microbubbles, ובכך להגדיל את החלק יחסי בגז במארז המרבי בנפח נתון של קצף. שינוי הכימיה ניסוח על ידי סוכנים לשיפור צמיגות הכללה ניתן להשתמש כדי ליצור התפלגות גודל הומוגני יותר אם תרצה בכך. מצאנו כי זמן ריצה של 15 דקות הוא אידיאלי ביותר; עם עלייה בריכוז microbubble, התחליב הופך להיות צמיג יותר ויותר. ברגע שהוא מגיע לצמיגות קריטית, זה כבר לא יעיל נשאב באמצעות משאבת הרים. זה גורם לגז חופשי לעבור homogenizer מבלי ששולב LOMs וניתן לראות בתוך צינורות ברורים. בשלב זה, בדרך כלל אנחנו בוחרים לעצור את צעד ריכוז סדרתי, למרות שאם רוצה, את זרימת גז לשיעור homogenizer באונליין יכול להיות ירידה וקצב זרימת משאבת הרים יכול להיות מוגבר ליצירת שברים דלק גבוהים יותר. עם זאת, מאוד viscouתחליבי ים דורשים יותר כוח לסגת לתוך מזרקים לצעד צנטריפוגה, ועשויים להפחית את התשואה של תהליך זה.
צעד צנטריפוגה כבר בהנחייתם של שינוי 140 מיליליטר מזרקים לחתוך את הבוכנה ואת הבסיס של המזרק, כך שמזרקים עם מילוי טופס אפילו צילינדר. זה מקל מאוד את העמסה ופריקה של מזרקים לצנטריפוגות. בעקבות צנטריפוגה, מזרקים בדרך כלל מכילים שלוש שכבות. השכבה הצפופה ביותר (בסמוך לקצה המזרק כאשר מזרקים נטענים האף למטה) מכילה פוספוליפידים שאינם בשימוש ואת כמות גדולה של השלב המימית. במקרים מסוימים, 'פסולת' מעונן ניתן לראות בקצה המזרק אשר בדרך כלל מכיל גושי שומנים בדם. עבור ניסויים בסיסיים, את תוכנו של 'השלב המימית "הזה עשוי להיות בשימוש חוזר לניסויים הבאים, אם כי מצאנו כי זה באופן משמעותי מפחית את היעילות של התהליך. (כדי למתן בעיה זו, חומרים בלתי פעילי פוספוליפידים נוספים עשוייםיתווסף לתחליב המבשר הממוחזר, מקפיד לשמור על היחס טוחנת של כל חומר לא פעיל.) השכבה האמצעית בתוך כל מזרק היא לבנה בוהקת ומכילה LOMs המרוכז. יש בדרך כלל קו חד של תיחום בין החלק התחתון ושכבות ביניים. השכבה האמצעית של כל מזרק יכולה להיות משולבת לעיבוד נוסף כמפורט להלן. השכבה העליונה מכילה קצף רך המכיל גז חופשי מLOMs נשבר לאורך כל תהליך הייצור. השכבות העליונה ותחתונה מושלכות בדרך כלל. במהלך צנטריפוגה, חשוב להבטיח כי כל מזרק מכוסה בכובע מזרק הדוק על מנת למנוע שחול של התחליב לצנטריפוגות במהלך עיבוד. צנטריפוגה במהירויות גבוהות יותר הייתה מוגבלת על ידי הכוח למחוץ של המזרקים שנהגנו. במידת צורך כדי להשיג קו חד של תיחום בין השכבות התחתונה ואמצע (בדרך כלל כאשר תחליבים המכילים שבריר דלק גבוה היו להיות centrifuged), זמן צנטריפוגה יכול להיותהוארך. שימוש ב, ברזלים 3 כיווני גז חזק לשלב LOMs המרוכז שימושי למניעת זיהום אוויר. כמו כן, חשוב לוודא כי מזרקים LOM המכיל תמיד נשמרים כתרים וכי כל אוויר סביבה מסולק באופן מיידי. כדי להגביל את זיהום אוויר בזמן האחסון, צריכים להיות אטומים מזרקים עם כובעי luer נעילה בלבד. מזרקים פלסטיק ידועים להיות גז חדיר, ולכן מזרקים זכוכית או מתכת עדיפים לאחסון לטווח ארוך.
כפי שתואר לעיל, תחליבים נחשפו לצעד ריכוז סדרתי עבור 15 דקות בדרך כלל מפגינים גז 70% לפי נפח ויכולים להיות מרוכז לגז 90% על ידי צנטריפוגה. גם אם תחליב% 70 נפח רצוי בסופו של הדבר, מצאנו צנטריפוגה כדי להיות מועיל כדי להסיר פוספוליפידים שלא ישולבו LOMs מהתרכיז. זה גם יכול להיות מושלם על ידי מתן תחליבים לעמוד לילה כדי להשיג הפרדת פאזות. לin vivo ניסויים, לעתים קרובות אנו לדלל מרוכזיםLOMs עם פלזמה-Lyte, מערבב בעדינות, אז צנטריפוגות שוב כדי להסיר פוספוליפידים שאינם בשימוש נוסף ופסולת אחרת. צעד זה יכול להיות חזר מספר פעמים לפי צורך כדי להסיר שאריות שומנים עודפות. ההזרקה של פוספוליפידים שלא ישולבו LOMs אינה רצויה בגלל עומס שומנים נוסף שהם מעניקים בקביעת שיעור עירוי גבוה.
מצאנו כמה מלכודות נפוצות להימנע בתהליך ייצור זה. ראשית, חומרים בלתי פעילים שומנים בדם צריכים להיות טריים, מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, ולא להשתמש בו אם פג תוקפו. מבשר הפתרון לא צריך להיות בשימוש חוזר במחקרי vivo, כמו תחליבי כתוצאה מכך הם לא עקביים בהתפלגות גודלם וחלק גז מקסימאלי, ועלול להכיל מזהמים חיידקיים, שומני חמצון, או גושי שומנים בדם. שנית, ברגע שהתחליב מגיע 'צמיגות קריטית "במהלך ייצור, זה כבר לא יהיה נשאב ביעילות באמצעות המערכת, וכיסי גז גדולים יהוו בתוך HCט צמיגות התחליב הגבוה גם הופכת את התחליב קשה להתמודד ולהכין למזרקים. בעיות אלה נמנעים הטובים ביותר על ידי מדידת העלייה בשבריר גז בתוך HCT (על ידי כימותי הגידול בהיקף כפי שעולה שבריר גז) ולעצור את תהליך ריכוז סדרתי פעם אחת זוגות המוצא הנפח.
מגבלה העיקרית אחת של טכניקה זו היא הצורך המתמיד לצעד צנטריפוגה, אשר אינה רצויה משום שהיא יוצרת פוטנציאל לאוויר וזיהום חיידקים של המוצר הסופי, ומונעת את זה מלהיות תהליך מתמשך. בעתיד, צעד הריכוז הסידורי עשוי להיות שונה למערכת אחת צעד לייצור תרופות מסחרי על ידי ניצול מערכת פריקה הידראולית כדי לייתר את הצורך בצנטריפוגה לכלכה. Homogenizer ומערבלי מעבדה ב-line יכולים להיות מפוברק עם 3/16 נירוסטה ומעוקרת במקום. הכללתם של גזים אחרים במערכת עשוי להרחיב את השירות דואר של טכניקה זו עוד יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מימון: מחקר רפואי של צבא ארצות הברית וציוד פיקוד (USAMRMC) ומנוהל על ידי טלרפואה וטכנולוגיה מתקדם מרכז מחקר. Shunxi ג'י תרם השינוי של המזרקים כפי שמתואר כאן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 ml syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
References
- Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5 (11), 2161-2170 (2009).
- Ren, J. L., et al. A Novel Ultrasound Microbubble Carrying Gene and Tat Peptide: Preparation and Characterization. Academic Radiology. 16 (12), 1457-1465 (2009).
- Tinkov, S., et al. Microbubbles as Ultrasound Triggered Drug Carriers. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (6), 1935-1961 (2009).
- Hernot, S., Klibanov, A. L. Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (10), 1153-1166 (2008).
- Lanza, G. M., et al. A novel site-targeted ultrasonic contrast agent with broad biomedical application. Circulation. 94 (12), 3334-3340 (1996).
- Cavalli, R., et al. Preparation and characterization of dextran nanobubbles for oxygen delivery. International Journal of Pharmaceutics. 381 (2), 160-165 (2009).
- Kheir, J. N., et al. Oxygen Gas-Filled Microparticles Provide Intravenous Oxygen Delivery. Science Translational Medicine. 4 (140), (2012).
- Lindner, J. R., et al. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. Journal of the American Society of Echocardiography. 15 (5), 396-403 (2002).
- Zhao, Y. Z., et al. Preparation, characterization and in vivo observation of phospholipid-based gas-filled microbubbles containing hirudin. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (9), 1237-1243 (2005).
- Seo, M., et al. Microfluidic Assembly of Monodisperse, Nanoparticle-Incorporated Perfluorocarbon Microbubbles for Medical Imaging and Therapy. Langmuir. 26 (17), 13855-13860 (2010).
- Wan, J. D., Stone, H. A. Coated Gas Bubbles for the Continuous Synthesis of Hollow Inorganic Particles. Langmuir. 28 (1), 37-41 (2012).
- Duncanson, W. J., et al. Monodisperse Gas-Filled Microparticles from Reactions in Double Emulsions. Langmuir. 28 (17), 6742-6745 (2012).
- Kendall, M. R., et al. Scaled-Up Production of Monodisperse, Dual Layer Microbubbles Using Multi-Array Microfluidic Module for Medical Imaging and Drug Delivery. Bubble Science Engineering and Technology. 4 (1), 12-20 (2012).
- Szijjarto, C., et al. Effects of Perfluorocarbon Gases on the Size and Stability Characteristics of Phospholipid-Coated Microbubbles: Osmotic Effect versus Interfacial Film Stabilization. Langmuir. 28 (2), 1182-1189 (2012).
- Rossi, S., Waton, G., Krafft, M. P. Phospholipid-Coated Gas Bubble Engineering: Key Parameters for Size and Stability Control, as Determined by an Acoustical Method. Langmuir. 26 (3), 1649-1655 (2010).
- Swanson, E. J., et al. Phospholipid-Stabilized Microbubble Foam for Injectable Oxygen Delivery. Langmuir. 26 (20), 15726-15729 (2010).
- Kvåle, S., et al. Size fractionation of gas-filled microspheres by flotation. Separations Technology. 6 (4), 219-226 (1996).
- Dressaire, E., et al. Interfacial polygonal nanopatterning of stable microbubbles. Science. 320 (5880), 1198-1201 (2008).
- Kheir, J. N., et al. Bulk Manufacture of Concentrated Oxygen Gas-Filled Microparticles for Intravenous Oxygen Delivery. Advanced Healthcare Materials. , (2013).
