Summary
我们描述了大容量的基于脂质的氧气微气泡（的LOM），使用高剪切均化和串行浓度设计用于静脉内的氧气输送的制造方法。
Abstract
充气微泡已经开发作为超声造影和药物递送剂。微泡可以通过使用超声处理，机械搅拌，微流体装置，或均化处理的表面活性剂来制备。最近，基于脂质的氧气微泡（的LOM）已经被设计在医疗紧急静脉输送氧气，扭转危及生命的低氧血症，防止后续的脏器损伤，心脏骤停而死亡。我们提出使用闭环高剪切均化器的方法按比例扩大生产的高度氧化的微泡。该过程可产生2升浓缩的LOM（90体积％）中90分钟。产生气泡的平均直径为〜2μm时，以及流变更新与该血液时，稀释至60％（体积）是一致的。该技术生产的高容量和高纯度氧的LOM，这表明该技术可用于转化研究实验室有用。
Introduction
微泡的蛋白质，聚合物和脂质壳的组成已经被开发作为药物递送载体，基因治疗，和超声造影剂1-5。因为这些治疗用途需要血管内微泡的持久性，这样的微泡通常填充有惰性的，高分子量的气体如全氟化碳6，它具有低的溶解度在血液和稳定的气泡3,4。
最近，基于脂质的氧气微泡（的LOM）被设计用于提供治疗剂量的氧，这可能保留终末器官的氧输送和防止在气道阻塞或低氧血症7期血流动力学不稳定。设计用于静脉内气体输送乳剂需要比那些用于超声造影剂或靶向药物递送不同的设计特点。首先，因为身体消耗大量的氧气（〜200毫升/分钟）的，的LOM必须生产和注射大规模。这需要在制造过程是有效的。第二，在制造过程中应该是闭环，以避免氮气污染过的LOM的曝光（它应该充满100％的氧气）到环境空气中。第三，因为的LOM的目的是静脉内气体输送，LOM中的气体馏分应最大化，认识到通过乳液粘度7所施加的限制。最后，与任何静脉注射，精确地控制粒度分布是必要的，避免微血管梗阻8。
有用于制造微泡几个成熟的方法。超声处理采用强度高，低频超声应用于乳液，它包括表面活性剂，如两亲性的磷脂，以气体的顶部空间，以产生微泡7,9的存在下的空气-液体界面。这个过程是可控的，通过改变超声音的频率，功率和脉冲持续时间，并将得到的粒度分布可以根据产生特定尺寸分布的微泡，虽然超声处理在临床上使用的微泡的制备很少使用。合并是表面活性剂和气体的封闭系统，该系统也难于扩大，以适应大容量的2的强烈机械搅拌。液滴型微流控使微气泡大小分布10-13的精确控制。虽然传统上难以扩大规模，多通道，高速微流体已经描述了增加微泡的生产效率13。使用上述任何一种方法制造的微泡可能需要制造后尺寸减小过程中，如离心分馏14,15和微泡浮选16,17。
另一种既定方法的高度稳定微泡的制造是剪切homogeniz振动性6，这可能会导致对微泡的表面18上的稳定六边形磷脂图案。在此基础上的概念，我们描述了在线高剪切均质机来创建自组装的LOM 19日注册成立。在这个过程中，利用匀化器快速旋转接近双细网眼emulsor屏幕叶片，产生高的机械和液压剪用于创建微泡。脂质乳剂通过本系统的串行浓度产生越来越浓的气体馏分，可进一步通过离心浓缩。
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Protocol
1，系统设置了
该系统由配有单级混合器，在线高剪切均化器，辊子泵来移动HCT和均化器之间的流体，和一个热交换器（图1）的保持和浓缩罐（HCT）的。
- 放置消毒，广口4升的玻璃集装上2底座端口和3个侧端口的单级混频器下方容器。降低混频器头在容器的口部，并确保气密接头用橡胶密封件或带（为了防止环境空气污染的头部空间）。
- 适合的基地港口之一，用无菌3/8的HCT（图1，端口＃1）“（ID）的透明管，约10”长，配备了3路阀在尖端收集浓缩乳液。
- 配合第二基本端口（图1，口＃2）用无菌3/8“（ID）的油管，approximatelŸ36“的长度。通过滚压泵送入这个管道。适合高剪切均质机的入口有一个T形件包括两个端口，并连接如下：从端口＃2连接管，通过滚轮泵和连接到T形件的侧端口。使用低流量的氧气流量计连接的另一端口，氧气罐。
- 高剪切均化器的出口端连接至保持在4℃下对在线热交换器的入口所述热交换器的出口连接到HCT的返回口（图1，端口＃3），产生一个闭环系统。
- 附加氧气罐（经由流量计）的HCT（图1，端口＃4）。附加气体成分监测，是开放的对HCT的顶部端口（图1，口＃5）气氛 。
- 如果不育性是需要的，每次使用由高压釜之前消毒的玻璃和金属部件。消毒管道元件和塑胶有限公司nnectors由环氧乙烷每次使用前。这是特别重要的，如果产品是在体内进行测试。
2，LOM制造
- 放置20克GMP的1,2 -二硬脂酰-sn-甘油-3 -磷酸胆碱（DSPC）和10克胆固醇在HCT的基部的。添加1L的等离子体莱特A向HCT和手搅拌1分钟，尽可能多的脂质尽可能集成到水相中。
- 降低单级混频器进入水相，从而确保了整个混合器头部分在水相中。确保HCT的顶部是气密性（参见上面的步骤1.1），且没有打开的侧口。打开连接到端口＃4气源，然后等待，直到HCT顶部空间的氧气分数达到> 95％。在10升/分钟（LPM），这应该采取〜10分钟。
- 使用单级混合器中，混合所述前体乳液5分钟，在5,000 rpm。将所得的混合物应该出现淡白色的，不包含任何可见的梨皮ð团块。一旦混合后，未使用的脂质 - 水混合物可以储存在4℃为单次使用前最多30天。
- 素的整个闭环系统通过接通滚筒泵在1.3 LPM的前体乳液。一旦系统催芽，保持泵的1.3 LPM。
- 开始制造的LOM的，打开的行高剪切均化器以7500转每分钟。紧随其后，打开氧气流至均化0.5 LPM的入口部分。保持单级混频器（在HCT）上在3,500 rpm。的LOM形成在在线均化器（图2）内的转子叶片和emulsor画面的界面。几分钟之内，流体应该成为明显更粘稠。更严格的方法是确定的粘度作为时间的函数，这可以通过在制造过程中从端口1取出等分试样并用粘度计分析来完成。
注意：如果可见气泡存在于管排出的混合器，氧流向在线均化器是太高了。滴定向下气流，直至流体是不透明和不含有可见的气泡。 - 运行系统15分钟，然后关闭高剪切均质机和氧气入口吧。继续在HCT运行的单级混合器直至乳液被去除;这减轻了相分离，并保持产品的HCT内相对统一。
注意：所述气体填充的乳浊液的体积应在串行浓度相增加约2-3倍。如果没有，请检查以确保氧气流入高剪切均质机和前体乳液脂质浓度是正确的。生产效率降低脂质浓度降低。
3，收集，浓缩，评估，和的LOM的存储
- 附上一个无菌，修改140毫升鲁尔锁注射器连接到基座端口＃1的收集容器的活塞。制定100毫升液。盖紧瓶盖注射器和重复，直到所有液体已被删除。
- 通过抽出百毫升空气进入注射器，然后锯切多余柱塞和注射器材料上面的140毫升标记修改注射器。填写并利用齿镊制定柱塞空的注射器。这一修改使得更容易离心。
- 离心机注射器与封顶年底在冷藏（4℃）离心桶在225×g离心10分钟朝下。
- 离心后三层材料就会出现。排出体内多余的混浊水相的底层和丢弃。第二层是明亮的白色和含有浓缩的LOM。转浓泡沫使用三路活塞，以防止环境气体污染不透气注射器。放弃最后一层，其中含有游离氧的气体从破裂的LOM。
- 泡沫质量可以通过达到浓泡沫的≥90％的气体进行评估。演算吃气体浓度如下：
体积％的气体= [（泡沫重量/体积泡沫） - 1]×100- 作为第二质量控制，微气泡大小以减光，以确定是否粒径是所期望的范围内。但应注意的是，在均化时间或制剂的改变可能改变气泡的大小。
- 盖紧瓶盖与鲁尔锁接头的玻璃注射器。浓缩的LOM可与等离子莱特一个在使用时被摊薄。注射器可存放在22，4，或-20℃;较低温度下可提供增强的保质期稳定性7。
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Representative Results
高剪切均质使效率（ 即在一个下午）生产足够的LOM对动物的研究，也不需要专业技术。一旦熟练，高达2升浓缩的LOM的可以在90分钟来制造。
微气泡的大小和形态，光镜和光遮蔽评估。时的LOM的10微升样品是可视化，球形的LOM中所指出的，以及脂质碎片的相对贫乏（图3A）。这一点尤其是当GMP产物被使用。时的LOM的相同的样品，通过减光评估的平均粒径为2.624±0.332微米（SD）。大于90％的LOM分别为<10微米的直径，和人口是多分散的（图3B）。
乳液的粘度在很大程度上取决于气体组分（因此，对微泡浓度）。两毫升分装改变气体的浓度的LOM的是用一个稳态流扫使用40毫米的平行板几何形状的应力是变化从0.1至10,000μN·米的研究。所有LOM气体组分表现出剪切稀化行为，并且这种现象被大多数在较高的气体馏分发音。含有60％（体积）的气体的LOM表现出流变学特性类似于血（图4A）。
最后，LOM中的氧含量（包括气体馏分和氧气的分数浓度）加入氧气60％（体积）的LOM内所含的非饱和人体血液等分试样与已知的缺氧变化量进行了测试。如先前所述，的LOM中的氧含量可以从增加的氧合血红蛋白浓度7进行计算。氧气量的LOM内添加和血液中的氧含量的体积增加之间的关系是1.053±0.03025（SD）（95％CI = 0.9865-1.120）（ 图URE 4B），这表明测试的LOM含有近100％的氧，表现出一些气体捕集袋（它不能有效地传递氧气到血液中，但浮出来迅速），并有效地传递他们的整个有效载荷氧对人体的血液在体外 。
图1：制造安装示意图。的LOM使用的是直列，高剪切均化器在闭环系统中产生。的LOM被保持于保持并在持续搅拌下浓缩罐（HCT）。该乳液是通过该系统采用的辊子泵移动。由均质所产生的热量通过换热器取出。 请点击此处查看该图的放大版本。</ A>
在一个细网emulsor屏幕的LOM图2。自组装。A）快速旋转的叶片经过细网emulsor屏，创建绘制在水相和气相虹吸作用。微小氧气气泡被剪切形成的，并迅速通过两亲性的磷脂的疏水脂质尾部包围，形成自组装气体填充的泡沫（B）。
图3。表征的LOM A）球形的LOM呈现出多分散粒径分布的代表性显微照片。比例尺=10微米。 LOM中的B）所评估的减光面积分布。数据=平均值，误差= SEM。
图4，A）的LOM乳液在60的流变曲线，70％和90％（体积） 的气体离心浓缩的LOM属性 。浓泡沫至60％（体积）的气体的稀释产生一个流变曲线类似于人类血液（血细胞比容四成）。数据=平均值，误差= SEM。 B）的LOM的氧含量之间的关系添加到人的血液和血液中的氧含量的测量的增加。数据=平均值，误差=扫描电镜，行=与最佳拟合线的95％CI为线性回归。
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Discussion
最重要的步骤，以建立集中的，高度氧化的LOM包括：1）确保HCT内的顶部空间保持完全氧化; 2）确保所述脂质赋形剂的纯度为最佳（包括储存条件和使用GMP的产品）; 3）确保粉状脂质一起吸系统之前水相混匀;和4）密切关注的HCT内增加的气体馏分，以确保气体的体积分数不超过70％。
我们在这里描述的方法，利用高剪切均质创建空心微。两亲性脂质悬浮的水相，它是用于承载脂质进入在线均化器。 GMP级别脂质被用于活体内研究，并且通常是优选的，因为它们含有较少的脂质聚集物和杂质。血脂也受到脂质氧化（特别是存储时充氧液体内）和细菌污染。的LOM时形成的疏水尾排列在线均化器（图2）中创建的周围小的氧气的微气泡。在7500转均匀化的LOM受试者的微泡，以额外的机械应力，因为它们是在转子叶片和定子的内壁的前端之间碾磨。的LOM也经受水力剪切，因为它们是通过超精细网格emulsor屏幕被迫以极高的速度，从而进一步降低粒度。剪切力生成内联线均化，并在本地在单级混频器的热;返回到HCT前在线热交换器需要除去该热量。的热交换器的情况下可以提高温度高于所述脂质（55℃DSPC），从而增加了脂质和结果中的产品损失的流动性的相变温度。建立在封闭的乳液，在在线设备确保了纯oxygen被并入LOM芯，防止空气污染。此外，的LOM不断接触与HCT的气体顶空。因此当务之急是要确保HCT内由实验室混合器产生的抽吸作用不从大气中创建一个逆转的气流进入HCT（通过气体组成的显示器，它是与大气相通，以防止HCT的加压） 。这里所描述的氧气气体流速应足以防止这种现象。
通过在串行浓度相的在线均化器回收的乳液会从剩余的在水相中的“未使用的”磷脂，附加LOM和也受试者完好的LOM反复剪切，从而可以进一步减小颗粒尺寸。颗粒大小和气体的浓度可以通过调节调音台的速度进行量身定做，因此，emulsor屏，网格大小和运行时间（ 即串行C的持续时间oncentration工序）。机械搅拌产生多分散尺寸分布。宽粒度分布允许更紧密的微泡包装，从而提高了最大封装的气体馏分中泡沫的一个给定的容积。通过加入粘度提高剂改变化学配方可以使用，如果需要建立一个更均匀的粒度分布。我们已发现，15分钟的运行时间是最理想的;作为微泡浓度的增加，乳化变得越来越粘稠。一旦达到临界粘度，它不再使用辊泵有效泵送。这将导致游离气体通过均化而不被并入LOM和可以在透明管中可以看出。在这个阶段中，我们通常选择以停止串行浓缩步骤，但如果需要，该气体流速进入在线均化器可以减少和辊泵的流速可以提高到建立较高的气体馏分。然而，高度viscous乳液需要更多的力来撤入注射器的离心步骤，并且可以减少该过程的产率。
离心步骤提供了便利，通过修改140毫升注射器截断注射器的柱塞和碱，使填充注射器形成均匀的圆柱体。这大大方便了装载和针筒卸载进入离心机。离心后，注射器通常包含三层。最致密层（注射器尖端附近时，注射器被加载机头向下）包含未用的磷脂和大量的水相。在某些情况下，阴'碎片'可注射器尖端通常包含脂质团块内可见。对于基本的实验中，这种“水相”中的内容可以被重新用于随后的实验中，尽管我们已经发现，这实质上削弱了处理的效率。 （为了缓解这个问题，更多的磷脂辅料可能每个注射器内加入回收的前体乳液，同时注意保持各辅料的摩尔比。）中间层是亮白色，并含有浓缩的LOM。通常有底部和中间层之间的分界的尖锐线。每个注射器的中间层可以被组合为如下所述进一步处理。顶层包含含游离气体的LOM整个制造过程中打破蓬松的泡沫。在顶部和底部层通常被丢弃。在离心过程中，它确保每一个注射器中，为了防止乳剂的挤压进入离心机处理过程中包括的一个气密注射器帽是很重要的。离心以更高的速度是由我们所使用的注射器的抗碎强度的限制。如果需要实现的底层和中间层（通常当正在离心含有高气体部分乳化液）之间划分界线，离心时间可延长。使用气密，3路活塞结合浓缩的LOM的是有用的，以防止空气污染。同样重要的是确保含LOM注射器总是保持上限和任何周围的空气被立即排出。要储存期间限制空气污染，注射器应密封，只有鲁尔锁帽。塑料注射器被称为是气体可渗透的，因此，玻璃或金属注射器优选用于长期存储。
如上所述，暴露15分钟，串行浓缩步骤乳剂典型地显示出70％的气体通过量，并可以通过离心浓缩到90％的气体。即使70％（体积）乳液期望在年底，我们已经找到离心有助于去除磷脂这是不纳入从精矿的LOM。这也可以通过使乳液静置过夜，以实现相分离来实现的。 在体内实验中，我们经常稀浓的LOM与等离子体莱特A，轻轻混匀，然后再次离心，除去额外的未使用的磷脂和其他杂物。这一步可以根据需要除去过量的脂质碎片被重复多次。磷脂的未并入的LOM的喷射是因为它们在高输注率的设定赋予额外的脂质负荷的不希望的。
我们已经发现了一些常见的陷阱，以避免在此制造工艺。首先，脂质赋形剂应是新鲜，保存于-80℃，并且不使用，如果过期。该前体溶液不应再用于体内研究中 ，作为得到的乳液是在其粒径分布和最大气体馏分不一致，并且可能包含细菌污染物，氧化的脂，或脂质团块。第二，一旦乳液达到在制造过程中“临界粘度”时，它便不再被有效地通过系统泵送，以及大的气体的口袋将形成在HC中T的高粘度乳液也使得乳液难以处理并绘制成注射器。最好是通过测量HCT内增加的气体馏分（通过量化的体积增加，作为气体馏分的增加），停止串行浓缩过程一旦初始体积加倍避免这些问题。
这种技术的一个关键限制是持久需要离心步骤，这是不希望的，因为它产生对空气和最终产物的细菌污染的可能性，并防止这从一个连续的过程。在未来，串行浓缩步骤可以被修改成利用一个液压系统排出以避免需要为分批离心单步系统用于商业制造药物。在在线均化器和实验室混合器可被制造为3/16不锈钢和灭菌到位。在该系统中包括的其它气体可扩大第Ë实用这一技术进一步的。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
资金：美国陆军医学研究和装备司令部（USAMRMC）及远程医疗与先进技术研究中心管理。顺溪籍提供如这里所描述的注射器的修改。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
| Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
| Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210 |
| Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
| Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
| BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
| Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
| T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266 |
| L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
| Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
| 140 ml syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
| IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
| Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
| Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |
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