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Bioengineering

높은 가위 균질화 및 시리얼 농도로 농축, 지질 기반 산소 마이크로 버블 에멀젼의 제조

doi: 10.3791/51467 Published: May 26, 2014

Summary

우리는 높은 전단 균질화 및 일련 농도를 사용하여 정맥 산소 전달을 위해 설계 지질 기반 산소 마이크로 버블 (LOM의) 많은 양의 제조 방법을 설명합니다.

Abstract

가스 충전 미세 기포 초음파 대비 및 약물 전달 에이전트로 개발되고있다. 마이크로 버블은 초음파 처리, 기계적 교반, 마이크로 유체 장치 또는 균질화를 사용하여 계면 활성제를 처리함으로써 제조 할 수있다. 최근, 지질 기반 산소 마이크로 버블 (LOM의)는 생명을 위협하는 저산소 혈증을 반전, 응급 의료 상황시 정맥 산소를 제공 할 수 있도록 설계하고, 이후의 장기 손상, 심장 마비, 사망을 방지하고 있습니다. 우리는 폐쇄 루프 높은 전단 균질기를 사용하여 높은 산소 마이크로 버블의 스케일 업 생산을위한 방법을 제시한다. 이 과정은 90 분에 집중 LOM의 2 L (부피 기준 90 %)를 생성 할 수 있습니다. 생성 된 기포가 혈액의 60 부피 %로 희석 할 때와 일치 ~ 2 ㎛의 평균 직경 및 레올 프로필이. 이 기술은이 기술 번역 연구소에 유용 할 수 있다는 것을 제안, 높은 용량과 높은 산소 순도 LOM의를 생성합니다.

Introduction

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단백질, 폴리머, 지질 껍질 이루어지는 미세 기포는 약물 전달 벡터, 유전자 치료, 초음파 조영제 1-5로 개발되어왔다. 이러한 치료가 사용하는 혈관 마이크로 버블 지속성을 필요로하기 때문에, 이러한 마이크로 버블은 일반적으로 혈액에서 낮은 용해도를 가지고 거품 3,4 안정 과불 화탄소 6, 불활성, 높은 분자량의 가스로 채워져있다.

최근, 지질 기반 산소 마이크로 버블 (LOM의)는 최종 장기 산소 전달을 유지하고기도 폐쇄 또는 저산소증 (7)의 기간 동안 혈역학 적 불안정을 방지 할 수 있습니다 산소 치료 용량을 제공하도록 설계되었습니다. 정맥 가스 공급을 위해 설계 유제 초음파 조영제 또는 타겟 약물 전달을 위해 사용되는 것보다 다른 디자인의 기능을 필요로합니다. 신체가 산소 가스 (~ 200 ㎖ / 분)를 대량 소비하기 때문에 먼저, LOM의 생산되어야큰 규모에 주입했다. 이는 제조 공정이 효율적으로 될 것을 요구한다. 둘째, 제조 공정이 외기 행 (100 % 산소로 채워 져야)의 LOM의 노광 질소 오염을 방지하기 위해 폐쇄 루프이어야한다. LOM의의 목적은 정맥 내 가스 전달이므로 셋째, LOM의 가스의 분율은 에멀젼 점도 (7)에 의해 부과 된 제한 사항을 인식 최대화되어야한다. 마지막으로, 정맥 내 주사와 같이 입자 크기 분포에 대한 정밀한 제어는 미세 혈관 폐색 8을 피하는 것이 필수적이다.

마이크로 버블의 제조를위한 여러 가지 설정 방법이 있습니다. 초음파는 고강도를 이용한다 저주파 초음파 7,9 미세 기포를 생성하는 헤드 스페이스 가스의 존재 하에서 예컨대 인지질과 같은 양친 매성 계면 활성제를 포함 에멀젼의 공기 - 액체 인터페이스에 적용. 이 과정은 매우 다양하여 제어 할 수 있습니다초음파 드물게 임상 사용 미세 기포의 제조에 사용되지 않지만 음향 주파수, 전력 및 펄스 지속 시간, 생성 된 크기 분포는 특정 크기 분포의 미세 기포를 생성하기 위하여 맞추어 질 수있다. 융합은 대량 2를 수용하도록 확장하는 것도 어렵다 폐쇄계에서 계면 활성제 및 가스의 격렬한 기계적 교반이다. 액적 기반 미세 유체는 마이크로 버블의 크기 분포 10-13을 정밀하게 제어 할 수 있습니다. 전통적으로 어려운까지 확장 할 수 있지만, 멀티 채널, 고속 미세 유체는 마이크로 버블 생산 효율이 13 증가하는 기술되었다. 이러한 방법을 사용하여 제조 된 마이크로 버블은 원심 분획 (14, 15) 및 마이크로 버블 부상 16, 17 등의 제조 후 사이즈 감소 프로세스를 필요로 할 수있다.

매우 안정적인 마이크로 버블의 제조를위한 또 다른 설치 방법은 전단 homogeniz입니다마이크로 버블의 표면 (18)에 안정화 육각형 인지질 패턴이 발생할 수 있습니다 ATION 6. 이 개념에 기반하여, 우리는 자기 조립 LOM의 19을 만들 수있는 인라인 높은 전단 균질의 설립에 대해 설명합니다. 이 과정에서, 균질 빠르게 미세 기포의 생성을 위해 높은 기계적 및 유압 전단을 만들어 이중 미세 메쉬 emulsor 스크린 가까이에 블레이드를 회전 이용한다. 이 시스템을 통해 지질 에멀젼의 직렬 농도는 더욱 원심 분리에 의해 농축 될 수 점점 농축 기체 분획을 산출한다.

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Protocol

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1. 시스템 셋업

시스템은 단일 단계 믹서, 라인 고전 단 균질화, HCT 및 균질화 사이의 유체를 이동하는 롤러 펌프 및 열교환 기 (도 1)를 장착 유지 탱크를 집중 (HCT)로 구성된다.

  1. 단일 단계 믹서 아래 2 기본 포트와 3 사이드 포트가 장착 된 살균, 입이 큰 4 L 유리 수집 용기를 놓습니다. 용기의 입구까지 믹서 헤드를 내리고 (헤드 공간을 오염으로부터 외기를 방지하기 위해) 고무 씰 또는 테이프를 사용하여 기밀 끼워 맞춤을 보장한다.
  2. 멸균 3 / 8와 HCT의 (그림 1, 포트 # 1) 기본 포트 중 하나에 맞게 "(ID) 클리어 튜브, 약 10"오래, 농축 에멀젼의 수집을위한 팁에서 3 방향 스톱 콕이 장착 .
  3. 제 2베이스 포트 멸균 3 / 8와 (그림 1, 포트 # 2) "(ID) 튜브, approximatel를 장착길이 Y 36 ". 롤러 펌프를 통해 튜브를 넣습니다. 두 개의 포트를 포함하는 T-조각으로 높은 전단 균질의 입구에 맞게 다음과 같이 연결 : 롤러 펌프를 통해, 포트 # 2에서 튜브를 연결하고 T 조각의 측면 포트에 연결합니다. 저 유량 산소 가스 유량계를 사용하여 산소 탱크에 다른 포트를 연결합니다.
  4. 4 ℃에서 라인 열 교환기의 유입구에 고 전단 균질의 출구 포트에 연결 폐 루프 시스템을 생성, HCT의 리턴 포트 (도 1, 포트 # 3)에 열교환 기의 출구 포트를 연결한다.
  5. HCT에 (유량계를 통해) 산소 탱크를 연결합니다 (그림 1, 포트 # 4). HCT의 상단 포트 (그림 1, 포트 # 5)을 대기에 개방 된 가스 조성 모니터를 연결합니다.
  6. 무균 원하는 경우, 오토 클레이브 각각 사용 전에 유리 및 금속 성분을 살균. 튜브의 구성 요소 및 플라스틱 공동 소독각 사용하기 전에 산화 에틸렌 nnectors. 제품은 생체 내에서 테스트 할 경우 특히 중요합니다.

2. LOM 제조

  1. GMP 1,2 - 디스 테아-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린 (DSPC) 및 HCT의 기본 콜레스테롤 10 g을 20 g의를 놓습니다. 수성 단계로 가능한 한 많은 지질을 통합, 1 분의 HCT와 손을 저어 플라즈마 LYTE의 1 L를 추가합니다.
  2. 전체 믹서 헤드 성상 의해 포함되도록 보장 수성 상에 단일 단계 믹서를 낮추. HCT의 상단이 꽉 가스입니다 (위의 단계 1.1 참조) 열린 사이드 포트가 있는지 확인하십시오. 포트 번호 4에 부착 된 가스 소스를 켜고 HCT 헤드 스페이스의 산소 분율> 95 %에 도달 할 때까지 기다립니다. 10 L / 분 (LPM),이는 ~ 10 분 소요됩니다.
  3. 단일 단계 믹서를 사용하여 5,000 rpm에서 5 분 동안 전구체 에멀젼을 혼합. 생성 된 혼합물을 옅은 백색을 표시하고 가시적 lipi 포함될 없어야D 덩어리. 일단 혼합되지 않는 지질 물 혼합물은 단일 사용하기 전에 최대 30 일 동안 4 º C에 저장할 수 있습니다.
  4. 국무 1.3 LPM에서 롤러 펌프를 돌려 전구체 에멀젼 전체 폐 루프 시스템. 시스템이 끝났다되면, 1.3 LPM에서의 펌프를 유지합니다.
  5. LOM의 제조를 시작하려면, 7,500 rpm의 인라인 높은 전단 균질의 전원을 켭니다. 그 직후, 0.5 LPM에서 균질의 입구 부분에 산소 흐름을 켭니다. 3,500 rpm에서에 (HCT의) 단일 단계 믹서를 유지합니다. LOM의이 라인 모지 나이저 (도 2) 내의 로터 블레이드 및 emulsor 스크린의 계면에 형성된다. 분 안에 액체가 눈에 띄게 더 점성이 될 것이다. 보다 엄격한 방식은 제조 중에 포트 (1)로부터 분취 량을 제거하고 점도계로 분석하여 수행 할 수있는 시간의 함수로서 점도를 결정하는 것이다.
    참고 : 보이는 기포 믹서, 산소를 배출 튜브에 존재한다면라인 모지 나이저로 유동은 너무 높다. 유체가 불투명이고 가시적 인 기포를 포함하지 않을 때까지 가스 유량을 적정한다.
  6. 15 분 동안 시스템을 실행 한 다음에 높은 전단 균질과 산소 유입을 끄십시오. 에멀젼이 제거 될 때까지 HCT에서 단일 단계 믹서를 계속 실행; 이 상 분리를 완화하고 HCT 내에서 비​​교적 균일 한 제품을 유지합니다.
    주의 : 가스 충전 에멀젼의 부피가 직렬 농축 단계에서 약 2 ~ 3 배 증가한다. 그것을 보장하기 위해 검사하지 않는 경우 산소는 높은 전단 균질로 유입되고 전구체 에멀젼 그 지질 농도는 정확하다. 지질 농도가 감소함에 따라 생산의 효율성은 감소한다.

3. 수집, 집중, 평가, 및 LOM의 저장

  1. 멸균을 연결, 수집 용기에 기본 포트 # 1에 부착 된 크레인에 140 ㎖의 루어 잠금 주사기를 수정했습니다. (10)을 작성유체의 0 ML. 모든 유체가 제거 될 때까지 단단히 주사기를 반복 모자.
    1. 주사기로 공기 100 ㎖를 회수 한 후 140 ㎖의 마크 위의 여분의 플런저와 주사기 재료를 절단하여 주사기를 수정합니다. 를 입력하고 플런저를 그리는 이가 집게를 사용하여 빈 주사기. 이 수정은 쉽게 원심 분리를 할 수 있습니다.
  2. 10 분 225 XG에 냉장 (4 º C에서) 버킷 원심 분리기 하향 지향 덮인 끝이 원심 분리기 주사기.
  3. 물질의 세 가지 층은 원심 분리 한 후 나타납니다. 초과 흐린 수상의 바닥 층을 추방 버린다. 제 2 층은 밝은 흰색과 집중 LOM의가 포함되어 있습니다. 주위 가스의 오염을 방지하기 위해 삼방 스톱 콕을 이용하여 가스 배리어 주사기로 농축 발포체를 전송합니다. 파열 된 LOM의에서 무료로 산소 가스를 포함하는 마지막 층을 폐기하십시오.
  4. 거품 품질이 집중 거품의 ≥ 90 % 가스를 도달에 의해 평가 될 수있다. calcul을다음과 같이 가스 농도를 먹었다 :
    볼륨 % 가스 = [(거품 무게 / 거품 볼륨) - 1] × 100
    1. 입경이 기대 범위 내에 있다면 제 품질 관리 같이, 광 엄폐 의한 미세 기포의 크기가 결정한다. 그것은 균질화 시간 또는 제형의 변화가 기포 크기를 변경할 수 있음을 주목해야한다.
  5. 단단히 루어 잠금 피팅 유리 주사기 모자. 농축 LOM의 사용시에 플라즈마 LYTE로 희석 될 수있다. 주사기는 22 일 4에 저장 될 수있다, 또는 -20 º C; 추운 온도는 향상된 저장 수명 안정성 7을 제공 할 수있다.

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Representative Results

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높은 전단 균질화는 동물 연구에 대한 충분한 LOM의 효율적 (한 오후 내에서, 즉) 생산이 가능하고 기술적 인 전문 지식을 필요로하지 않습니다. 일단 실력, 집중 LOM의 최대 2 L는 90 분으로 제조 할 수있다.

마이크로 버블의 크기와 형태는 광학 현미경으로 빛 엄폐에 의해 평가되었다. LOM의의 10 μL 샘플이 가시화 될 때, 구면 LOM의 언급은,뿐만 아니라 지질 파편의 상대적인 소수 (도 3a) 하였다. GMP 제품이 사용될 때 특히 그러하다. LOM의 동일한 샘플이 광 모호하여 평가했을 때의 평균 입경은 2.624 ± 0.332 μM (SD)이었다. LOM의의 90 % 이상이 <직경 10 ㎛이었으며, 인구는 다 분산 (그림 3B)이었다.

에멀젼의 점도는 (마이크로 버블 농도, 따라서) 크게 기체 분획에 의존 하였다. 두 ML 분주다른 가스 농도의 LOM의 스트레스가 0.1 내지 10,000 μN하도록 변화되었을 때 m · 40mm 평행 판 기하를 사용하여 정상 상태 유동 스위프를 이용하여 연구 하였다. 모든 LOM 가스 분수는 전단 숱이 동작을 전시하고,이 현상은 가장 높은 가스 분수에서 발음했다. 60 체적 %를 함유 가스 LOM의 혈액과 유사한 유동 학적 프로파일 (도 4a)을 나타내었다.

마지막으로, LOM의의 (기체 분획 및 산소 농도 등의 소수), 산소 농도는 공지 된 산소 결핍과 흐릿한 인간 혈액의 분취 량 60 체적 %의 LOM의에 포함 된 산소의 변화하는 양을 첨가하여 시험 하였다. 전술 한 바와 같이, LOM의의 산소 함량은 헤모글로빈 농도 (7)의 증가로부터 계산 될 수있다. LOM의 안에 첨가 산소의 양 및 혈액의 산소 함량의 체적의 증가 사이의 관계는 1.053 ± 0.03025 (SD) (95 % CI = 0.9865-1.120) (도이었다우레 4B), 테스트 LOM의 거의 100 %의 산소를 포함 것을 제안, (효율적으로 혈액에 산소를 전송하지만, 급속 뜨지 않는) 몇 갇혀 가스 포켓을 전시, 효과적으로 체외에서 인간의 혈액에 자신의 전체 산소의 페이로드를 전송합니다.

그림 1
그림 1. 설치 설계도를 제조. LOM의는 폐쇄 루프 시스템에서 인라인 높은 전단 균질기를 사용하여 생산됩니다. LOM의이 보유에서 개최 일정에 따라 혼합 탱크 (HCT)를 집중하고 있습니다. 에멀젼 롤러 펌프를 사용하여 시스템을 통해 이동된다. 균질화에 의해 생성 된 열을 열 교환기를 사용하여 제거한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </>

그림 2
좋은 메쉬 emulsor 화면 내에서 LOM의 그림 2. 자기 조립.) 빠르게 회전하는 블레이드는 수성 가스 단계에서 그리는 사이펀 효과를 만들어, 좋은 메쉬 emulsor 화면을 통해 전달합니다. 작은 산소 기포가 전단에 의해 형성되고, 신속하게 자기 조립 가스로 채워진 기포 (B)를 만들고, 양친 매성 인지질의 소수성 지질 꼬리에 의해 둘러싸여있다.

그림 3
LOM의.) 다 분산 크기 분포를 나타내는 구형 LOM의의 대표적인 현미경의 그림 3. 특성. 스케일 바 =10 ㎛. B) 크기의 빛을 어두움에 의해 평가 LOM의 유통. 데이터 =가, 오류 = SEM을 의미한다.

그림 4
그림 4. 원심 분리 농축 LOM의의 속성을 선택합니다.) 60 LOM 에멀젼의 유동 학적 프로파일, 70 및 90 부피 %의 가스. 60 부피 %로 농축 가스 거품의 희석은 인간 혈액과 유사한 유동 학적 프로파일 (용적률 40 %)을 수득 하였다. 데이터 =가, 오류 = SEM을 의미한다. B)의 LOM의 산소 농도 사이의 관계는 인간 혈액과 혈액의 산소 함량의 측정 증가에 첨가. 데이터 = 말은, 오류 = SEM, 라인 = 가장 적합한 라인의 95 % 신뢰 구간 선형 회귀.

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Discussion

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집중, 높은 산소 LOM의를 만드는 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) HCT 내의 빈 공간이 완전히 산소 상태를 유지하는 것이 보장을; 2) 지질 부형제의 순도 () 저장 조건 및 GMP 제품의 사용을 포함하여 최적임을 보장; 3) 분말 지질 시스템을 프라이밍하기 전에 수 성상과 완전히 혼합 것을 보장; 및 4) 기체의 체적 분율이 70 %를 초과하지 않도록 보장하기 위해 HCT 내의 가스 분율의 증가에 세심한주의를 기울이고.

우리가 여기에서 설명하는 방법은 중공 미세 기포를 생성하는 높은 전단 균질화를 사용합니다. 양친 매성 지질은 라인 모지 나이저로 지질을 수행하는 데 사용되는 수성 상으로 현탁된다. GMP 수준의 지질은 생체 내 연구에 활용하고, 그들이 적은 지질 단위 및 불순물을 포함하고 있기 때문에 일반적으로 바람직하다. 저장 특히 지질 (또한 지질 산화 될 수 있습니다산소 유체 이내) 및 세균 오염. 소수성 꼬리가 인라인 균질화 (그림 2) 내에서 생성 주위에 작은 산소 가스의 미세 기포를 준비 할 때 LOM의이 형성된다. 그들은 로터 블레이드 및 고정자의 내벽의 선단 사이에 가공 된대로 7500 rpm에서 LOM의 균질화 것은 추가적인 기계적 스트레스에 미세 기포를 피사체. 그들은 추가적인 입자 크기를 감소시키는 초 미세 메쉬 emulsor 화면을 통해 고속으로 강제로 LOM의 또한 유압 전단을 겪는다. 전단력은 라인 균질 내에 로컬 단일 단계 믹서에서 열을 발생; HCT로 돌아 가기 전에 인라인 열 교환기는이 열을 제거 할 필요가있다. 열교환 부재는 제품 손실 된 지질 및 결과의 유동성을 증가 지질 (DSPC 55 °의 C)의 상 전이 온도 이상의 온도를 올릴 수있다. 닫힌 내에서 에멀젼의 생성, 인라인 장치는 보장 순수 oxygeN은 공기 오염을 방지하여 LOM 코어에 통합된다. 또한, LOM의 지속적 HCT의 헤드 스페이스 가스에 노출된다. 그것은 HCT 이내에 실험실 혼합기에 의해 생성 흡입 효과 (HCT의 가압을 방지하기 위해 대기 개방 가스 성분 모니터를 통해) HCT으로 대기로부터 공기 흐름의 반전을 만들지 않는다는 것을 보장하는 것이 필수적이다 . 여기에 설명 된 산소 가스 유량이 현상을 방지하기에 충분해야한다.

직렬 농축 단계 동안 라인 균질기를 에멀젼의 재활용은 수성 상에 남아있는 '미사용'인지질로부터 LOM의 추가를 생성하고 또한 상기 입자의 크기를 감소시킬 수있다 반복 전단에 그대로 LOM의 과목. 입자 크기 및 가스 농도 따라서 emulsor 스크린 메쉬 크기, 일련의 C 런타임 (즉, 재생 시간, 혼합기 속도를 조정함으로써 조정될 수있다oncentration 단계). 기계적 교반은 다 분산 크기 분포를 생성한다. 넓은 크기 분포하여 거품의 주어진 볼륨의 최대 된 가스의 비율을 증가, 마이크로 버블의 단단한 포장 할 수 있습니다. 포접 점도 증진제 의해 제형 화학을 변경하면, 원하는 경우에 더 균질 한 크기 분포를 생성하기 위해 사용될 수있다. 우리는 15 분의 실행 시간이 가장 이상적입니다 것으로 나타났습니다; 마이크로 버블의 농도가 증가함에 따라, 유액은 점차 점성이된다. 그것이 중요 점도에 도달하면, 더 이상 효과적으로 롤러 펌프를 사용하여 펌핑 없다. 이 LOM의에 통합되기과 맑은 튜브 내에서 볼 수없는 균질 통과 무료로 가스가 발생합니다. 원하는 경우, 라인 모지 나이저로 가스 유속이 감소 될 수 있고, 롤러 펌프 유량이 높은 가스 분획을 생성하도록 증가 될 수 있지만,이 단계에서, 우리는 일반적으로 직렬 농축 단계를 중지하도록 선택. 그러나, 높은 viscou발 유제는 원심 분리 공정을위한 주사기로 철회 이상의 힘이 필요하고,이 공정의 수율을 감소있다.

채워진 주사기조차 실린더 형성되도록 원심 분리 단계는, 주사기의 플런저와베이스를 잘라야 140 ㎖를 주사기를 수정에 의해 촉진되었다. 이것은 크게 원심 분리기에로드 주사기의 하역을 용이하게한다. 원심 분리 후, 주사기는 일반적으로 3 층을 포함한다. (주사기 코 다운로드 된 주사기의 끝 근처) 조밀 한 층을 사용하지 않는 인지질과 수상의 대부분을 포함하고 있습니다. 어떤 경우에는, 흐림 '파편'전형적 지질 덩어리를 포함하는 주사기 팁 내에서 볼 수있다. 본 실질적 프로세스의 효율을 감소 것을 발견 하였다하더라도 기본적인 실험은이 '수성 상'의 내용은, 후속 실험에서 재사용 될 수있다. (이 문제를 완화하기 위해 추가 인지질 부형제 수도각 주사기 내의 각 첨가제의 몰 비율을 유지하기 위해주의하면서 재활용 전구체 에멀젼에 추가 될 수있다.) 중간 층은 밝은 흰색과 집중 LOM의가 포함되어 있습니다. 바닥과 중간 계층 간의 경계의 날카로운 라인은 일반적으로있다. 각 주사기의 중간층은 후술하는 바와 같이 추가 처리를 위해 조합 될 수있다. 상부 층은 제조 공정 전반에서 끊어짐 LOM의 자유로운 함유 가스 무성 발포체를 포함한다. 상하 층은 일반적으로 폐기됩니다. 원심 분리시, 각각의 주사기는 프로세싱 동안 원심 분리기에 에멀젼의 돌출을 방지하기 위하여 타이트 주사기 캡에 의해 커버되는 것을 보장하는 것이 중요하다. 빠른 속도로 원심 분리는 우리가 사용하는 주사기의 분쇄 강도에 의해 제한되었다. 하단과 중간 층 (보통 높은 가스 분획을 함유하는 에멀젼은 원심 분리 될 때) 사이의 경계의 샤프한 라인을 달성하기 위해 필요한 경우, 원심 분리 시간이 될 수있다확장. 농축 LOM의 배합하는 기밀, 3 방향 스톱 콕의 사용은 대기 오염을 방지하기 위해 유용하다. 그것은 LOM 함유 주사기는 항상 출장 유지하고 대기 즉시 추방되어 있는지 확인하는 것도 중요합니다. 보관시 공기 오염을 제한하기 위해 주사기는 루어 잠금 캡으로 밀​​봉해야한다. 플라스틱 주사기 투과성 가스 것으로 알려져 있으므로, 유리 또는 금속 주사기 장기 저장을 위해 바람직하다된다.

전술 한 바와 같이, 15 분 동안 연속 농축 단계에 노출 에멀젼은 전형적 체적 70 % 가스를 나타내고 원심 분리에 의해 90 %의 가스로 농축 될 수있다. 70 부피 % 에멀젼이 결국 원하는 경우에도, 우리는 집중에서 LOM의에 포함되지 않습니다 인지질을 제거하는 것이 도움이 될 원심 분리를 발견했습니다. 이것은 또한 에멀젼 상 분리를 달성하기 위해 밤새 방치함으로써 달성 될 수있다. 생체 실험을 위해, 우리는 종종 집중을 희석플라즈마 LYTE와 LOM의이 부드럽게 혼합 한 후 추가되지 않은 인지질 및 기타 이물질을 제거하기 위해 다시 원심 분리. 과도한 지질 파편을 제거하기 위해 필요에 따라이 단계는 여러 번 반복 될 수있다. LOM의에 혼입되지 인지질의 주입 때문에 그들은 높은 주입 속도의 설정에 부여 추가적인 지질로드로 바람직하지 않다.

우리는이 제조 공정에 방지하기 위해 몇 가지 일반적인 함정을 발견했다. 첫째, 지질 부형제, 신선한 -80 ° C에 저장하고, 만료 된 경우 사용되지해야합니다. 전구체 용액은 결과 에멀젼의 크기 분포와 최대 가스 부분에서 일치하지 않는 한, 생체 내 연구에 재사용하지 말아야하며, 세균의 오염 물질, 산화 지질 또는 지질 덩어리를 포함 할 수 있습니다. 에멀션 제조시 '중요한 점도'에 도달하면 둘째, 더 이상 효과적으로 시스템을 통해 펌핑되지 않으며, 큰 가스​​ 포켓 HC 내에 형성 할 것이다T. 높은 에멀젼의 점도도 처리하고 주사기로 헤어 그릴 에멀젼 어렵게 만든다. 이러한 문제는 베스트 (가스 분율이 증가함에 따라 양의 증가에 의해 정량화) HCT 내의 가스 분율의 증가를 측정하여 초기 부피 두배 일단 직렬 농축 공정을 중지함으로써 회피된다.

이 기술의 한 가지 중요한 한계는 공기와 최종 제품의 세균 오염의 가능성을 생성하고, 연속 공정 인에서이 문제를 방지하기 때문에 바람직하지 않다 원심 분리 단계에 대한 지속적인 필요합니다. 장래에, 직렬 농축 단계는 일괄 원심 분리의 필요성을 미연에 방지하기 위해 유압 배출 시스템을 이용하여 시판 약물 제조를위한 단일 - 단계 시스템으로 변형 될 수있다. 인라인 균질화 및 실험실 믹서는 3 / 16 스테인레스 스틸로 제작 자리에 살균 할 수있다. 시스템의 다른 가스의 포함은 일 범위를 확장 할 수있다또한이 기술의 전자 유틸리티입니다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

자금 조달 : 미국 육군 의학 연구 및 군수품 명령 (USAMRMC) 및 원격 의료 및 고급 기술 연구 센터에 의해 관리. Shunxi 지 여기에 설명 된대로 주사기의 수정을 기여했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 770365 Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)
Cholesterol Sigma Aldrich C75209
Plasma-Lyte A VWR 80089-818 Alternatively can use NaCl
Glass collection vessel Specialty Glass, Inc. Custom Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210
Gas composition (oxygen) monitor Precision Medical PM5900L
Sarns 8000 roller pump Calicut Medical 16407 Part of a modular perfusion system
BIOtherm Heat Exchanger Medtronic ECMOtherm-II
Verso laboratory in-line mixer Silverson Machines, Inc TH-IL-102-VERSO Use multistage workheads and front-end extension with T piece
T-piece for Silverson Verso inlet port Process Innovations Custom Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266
L5M-A laboratory mixer Silverson Machines, Inc NC0136483 Use mesh emulsor screen (fine)
Rochester-Ochsner toothed forceps Fisher Scientific 13-812-18
140 ml syringe Kendall Healthcare Monoject 8881114030 Ensure there is a luer lock.
IX71 Inverted light microscope Olympus IX71
Retiga-2000R microscope camera QImaging RET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A Autodilution PSS-NICOMP Particle Sizing Systems Out of production

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References

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높은 가위 균질화 및 시리얼 농도로 농축, 지질 기반 산소 마이크로 버블 에멀젼의 제조
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Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).More

Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).

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