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Bioengineering

Fabricação de concentrado, oxigênio à base de microbolhas Lipid Emulsões pelo Alto cisalhamento homogeneização e Concentração de série

doi: 10.3791/51467 Published: May 26, 2014

Summary

Nós descrevem métodos para o fabrico de grandes volumes de microbolhas de oxigénio à base de lípidos (LOMs) concebidas para o fornecimento de oxigénio intravenosa usando homogeneização de alto cisalhamento e de concentração em série.

Abstract

Microbolhas cheias de gás têm sido desenvolvidos como agentes de contraste de ultra-sons e de entrega de drogas. As microbolhas pode ser produzido através da transformação de surfactantes usando sonicação, agitação mecânica, dispositivos de microfluidos, ou homogeneização. Recentemente, microbolhas de oxigênio à base de lipídios (LOMs) foram projetados para fornecer oxigênio por via intravenosa durante emergências médicas, revertendo hipoxemia risco de vida, prevenção de lesões e posterior do órgão, parada cardíaca e morte. Nós apresentamos métodos para produção em escala-up de microbolhas altamente oxigenados usando um circuito fechado de alto cisalhamento homogeneizador. O processo pode produzir 2 L de LOM concentradas (90% em volume), em 90 min. Bolhas resultantes têm um diâmetro médio de cerca de 2 um, e um perfil reológico consistente com o do sangue, quando diluído para 60% em volume. Esta técnica produz LOM em alta capacidade e com uma pureza elevada de oxigénio, o que sugere que esta técnica pode ser útil para laboratórios de pesquisa translacional.

Introduction

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As microbolhas compostas de proteína, de polímero, e os reservatórios de lípidos têm sido desenvolvidos como vectores para a entrega da droga, a terapia génica, e os agentes de contraste de ultra-sons 1-5. Porque esses usos terapêuticos exigem persistência microbolhas intravascular, tais microbolhas são comumente cheio de inertes, altos gases peso molecular, tais como perfluorcarbonos 6, que possuem baixa solubilidade no sangue e estabilizar a 3,4 bolha.

Recentemente, microbolhas de oxigênio à base de lipídios (LOMs) foram projetados para fornecer as doses terapêuticas de oxigênio, que podem preservar a oferta de oxigênio de órgãos-alvo e evitar instabilidade hemodinâmica durante os períodos de obstrução das vias aéreas ou hipoxemia 7. Emulsões projetados para entrega de gás intravenosa requerem diferentes características de design do que os utilizados para os agentes de contraste de ultra-som ou entrega de drogas específicas. Primeiro, porque o corpo consome grandes volumes de gás de oxigénio (~ 200 ml / min), de LOM deve ser produzido einjectado em larga escala. Isto requer que o processo de fabrico seja eficaz. Em segundo lugar, o processo de fabrico deve ser de circuito fechado, a fim de evitar a contaminação de azoto através da exposição de LOM (que deve ser preenchido com 100% de oxigénio) para o ar ambiente. Em terceiro lugar, porque a finalidade da LOM é a entrega de gás por via intravenosa, a fração de gás de LOMs deve ser maximizado, reconhecendo as limitações impostas pela emulsão viscosidade 7. Finalmente, como com qualquer injectável intravenosa, o controlo preciso sobre a distribuição de tamanho de partícula é essencial para evitar a obstrução microvascular 8.

Existem vários métodos estabelecidos para o fabrico de micro-bolhas. A sonicação utiliza alta intensidade, o ultra-som de baixa frequência aplicada para a interface ar-fluido de uma emulsão que compreende um surfactante, tal como um fosfolípido anfipática, na presença de uma câmara de expansão de gás para produzir microbolhas 7,9. Este processo pode ser controlado por variação de ultrafrequência de som, energia e duração do impulso, e a distribuição de tamanho resultante pode ser adaptada para a produção de microbolhas com uma distribuição de tamanho específico, embora sonicação é raramente utilizado no fabrico de microbolhas clinicamente utilizadas. Fusão é a intensa agitação mecânica de um surfactante e gás num sistema fechado, o que também é difícil escalar para acomodar grandes volumes de 2. Microfluídica baseada em gota permite o controle preciso da distribuição de tamanho de microbolhas 10-13. Embora tradicionalmente difícil de escalar, multi-canal, microfluídica de alta velocidade foram descritos o que aumenta a eficiência da produção de microbolhas 13. Microbolhas fabricados usando qualquer um destes métodos pode exigir processos de redução de tamanho de pós-fabricação, tais como fracionamento centrífuga 14,15 e microbolhas flutuação 16,17.

Outro método estabelecido para a produção de microbolhas é altamente estáveis ​​homogeniz cisalhamentoção 6, o que pode resultar num padrão hexagonal fosfolípido estabilizador sobre a superfície da microbolha 18. Com base neste conceito, descrevemos a incorporação de um homogeneizador de alto cisalhamento in-line para criar auto-montagem LOMs 19. Neste processo, o homogeneizador utiliza lâminas de rotação rápida, em estreita proximidade com as telas de malha dupla Emulsor finas, criando alto cisalhamento mecânico e hidráulico para a criação de microbolhas. Concentração de série da emulsão lipídica, por meio deste sistema produz uma fracção de gás cada vez mais concentrada, o que pode ser ainda mais concentrado por centrifugação.

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Protocol

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1. System Set-up

O sistema consiste de um tanque de retenção e a concentração (HCT), equipado com um misturador único estágio, um homogeneizador de cisalhamento elevado, em linha, uma bomba de rolo para deslocar o fluido entre o HCT e o homogeneizador, e um permutador de calor (Figura 1).

  1. Coloque uma esterilizado de boca larga 4 L embarcação, coleta de vidro equipado com 2 portas de base e 3 portas laterais abaixo do único misturador palco. Abaixe a cabeça misturadora para a boca do navio e garantir um encaixe à prova de gás utilizando vedações de borracha ou fita (a fim de evitar que o ar ambiente de contaminar o espaço cabeça).
  2. Coloque uma das portas de base (Figura 1, a porta # 1) do HCT com estéril 3/8 "(ID) tubulação clara, aproximadamente 10" de comprimento, equipado com uma torneira de 3 vias na ponta para a coleta da emulsão concentrada .
  3. Coloque a segunda porta de base (Figura 1, a porta # 2) com estéril 3/8 "(ID) tubulação, approximately 36 "de comprimento. Alimente esta tubulação através de uma bomba de roletes. Coloque a entrada do homogeneizador de alto cisalhamento com uma peça em T, incluindo duas portas e ligar da seguinte forma: conectar a tubulação da porta n º 2, por meio da bomba de roletes e conectar à porta lateral do T-peça. Prenda a outra porta para um tanque de oxigênio usando um baixo fluxo de medidor de vazão de gás oxigênio.
  4. Ligue o orifício de saída do homogeneizador de cisalhamento elevado à porta de entrada de um permutador de calor em linha, mantida a 4 ° C. Ligue o orifício de saída do permutador de calor para o canal de retorno do HCT (Figura 1, a porta # 3), a criação de um sistema de circuito fechado.
  5. Anexar um tanque de oxigênio (através de um medidor de fluxo) para o HCT (Figura 1, a porta # 4). Anexar um monitor de composição do gás que está aberto para a atmosfera para o topo da porta do HCT (Figura 1, a porta n º 5).
  6. Se for desejada a esterilidade, esterilizar os componentes de vidro e de metal, antes de cada uso por autoclavagem. Esterilizar os componentes de tubulação e co plásticonnectors por óxido de etileno, antes de cada utilização. Isto é especialmente importante se o produto é para ser testado in vivo.

2. LOM Fabricação

  1. Colocar 20 g de 1,2-GMP distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) e 10 g de colesterol na base da HCT. Adicionar 1 L de Plasma-Lyte A a o HCT e agitar mão durante 1 min, integrando tanto lipídica como possível para a fase aquosa.
  2. Diminuir o misturador único estágio para a fase aquosa, assegurando que toda a cabeça do misturador é coberto pela fase aquosa. Certifique-se de que o topo do HCT é o gás apertado (ver passo 1.1 acima), e que não há portas laterais abertas. Ligue a fonte de gás conectado à porta # 4 e esperar até que a fração de oxigênio do headspace HCT atinge> 95%. Aos 10 L / min (LPM), este deve tomar ~ 10 min.
  3. Utilizando o misturador único estágio, misturar a emulsão precursora durante 5 min a 5000 rpm. A mistura resultante deve aparecer pálida e não contêm lipi visíveld aglomerados. Uma vez misturado, mistura lipídica de água não utilizada pode ser armazenado a 4 º C por até 30 dias antes da utilização única.
  4. Primeiro o sistema de circuito fechado de todo com a emulsão precursor ligando a bomba de roletes em 1,3 LPM. Uma vez que o sistema está preparado, mantenha a bomba em 1,3 LPM.
  5. Para começar a fabricação dos LOMs, ligue o homogeneizador de alto cisalhamento em linha de 7.500 rpm. Imediatamente depois, ligar o fluxo de oxigênio para o troço de entrada do homogeneizador de 0,5 LPM. Manter a batedeira fase única (no HCT) sobre a 3.500 rpm. LOM são formadas na interface das lâminas do rotor e as telas Emulsor dentro do homogeneizador em linha (Figura 2). Dentro de minutos, o líquido deve tornar-se visivelmente mais viscoso. Uma abordagem mais rigorosa é a determinação da viscosidade em função do tempo, o que pode ser feito através da remoção de alíquotas a partir de uma porta, durante a fabricação e analisando com um viscosímetro.
    Nota: Se as bolhas de ar visíveis estão presentes na tubagem de saída do misturador, oxigéniofluir para o homogeneizador em linha é demasiado elevada. Titular baixo fluxo de gás até que o fluido é opaco e não contém bolhas de gás visíveis.
  6. Execute o sistema por 15 min, em seguida, desligue o homogeneizador de alto cisalhamento ea entrada de oxigênio para ele. Continuar a rodar o misturador único estágio no HCT até a emulsão é removido; isto reduz a separação de fases e mantém o produto relativamente uniforme no interior da HCT.
    Nota: O volume da emulsão cheia de gás deve aumentar de cerca de 2 a 3 vezes durante a fase de concentração de série. Se isso não ocorrer, verifique se o oxigênio está fluindo para o homogeneizador de alto cisalhamento e que as concentrações de lipídios na emulsão precursor estão corretos. A eficiência de produção diminui à medida que diminui a concentração de lípidos.

3. Cobrança, a concentração, Avaliação e armazenamento de LOMs

  1. Anexar uma estéril, modificado 140 ml seringa luer-lock para a torneira ligada a porta base N º 1 na embarcação coleção. Elaborar 100 ml de fluido. Tapar bem seringa e repetir até que todo o fluido foi removido.
    1. Modificar seringas retirando 100 ml de ar na seringa e, em seguida, o excesso de serrar o êmbolo e o material da seringa acima da marca de 140 ml. Preencha e seringas vazias, usando uma pinça dentada para elaborar o êmbolo. Esta modificação facilita a centrifugação.
  2. Seringas de centrífuga com a extremidade tampada orientada para baixo num frigorífico (4 ° C) balde centrifugar a 225 xg durante 10 min.
  3. Três camadas de material aparece após centrifugação. Expulse a camada inferior do excesso de fase aquosa nublado e descarte. A segunda camada é branco brilhante e contém LOMs concentrados. Transferir espuma concentrada para uma seringa impermeável aos gases utilizando uma torneira de três vias para evitar uma contaminação de gás ambiente. Descarte a camada final, que contém gás oxigênio livre de LOMs rompidos.
  4. A qualidade da espuma pode ser avaliada pela atingindo ≥ 90% de gás de espuma concentrada. CalculComeram a concentração de gás como se segue:
    Volume de gás% = [(peso da espuma / volume de espuma) - 1] x 100
    1. Como um controlo de qualidade segundo, microbolhas de tamanho por obscurecimento de luz para determinar se o tamanho das partículas está dentro do intervalo esperado. Deve notar-se que uma alteração no tempo de homogeneização ou formulação pode alterar o tamanho da bolha.
  5. Tapar bem a seringa de vidro com um encaixe luer. LOM concentradas podem ser diluídas com Plasma-Lyte A a o tempo de utilização. As seringas podem ser armazenadas a 22, 4, ou -20 º C; temperaturas mais baixas podem proporcionar maior estabilidade vida de prateleira 7.

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Representative Results

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Homogeneização de alto cisalhamento permite a produção eficiente (ou seja, dentro de uma tarde) de LOMs suficientes para um estudo animal e não requer conhecimento técnico. Uma vez proficiente, até 2 L de LOM concentradas podem ser fabricados em 90 min.

Tamanhos de microbolhas e morfologia foi analisada por microscopia de luz e pelo obscurecimento. Quando uma amostra de 10 ul da LOM foi visualizado, LOM esféricas, foram observadas, bem como uma relativa escassez de detritos de lípidos (Figura 3A). Isto é especialmente verdade quando o produto é usado GMP. Quando a mesma amostra de LOM foi avaliada por obscurecimento de luz, o diâmetro médio das partículas era de 2,624 ± 0,332 mM (SD). Mais do que 90% da LOM foram <10 um de diâmetro, e a população foi polidispersa (Figura 3B).

Emulsão viscosidade era fortemente dependente de fração de gás (e, portanto, sobre a concentração de microbolhas). Dois ml de aliquotasde LOMs de diferentes concentrações de gás foram estudadas usando uma varredura de fluxo de estado estacionário com uma 40 milímetros geometria de placas paralelas como estresse variou de 0,1 a 10.000 μN · m. Todas as fracções de gás LOM apresentar um comportamento pseudoplástico, e esse fenômeno foi mais pronunciado em fracções de gás mais elevados. LOM gás contendo 60% em volume exibiu um perfil reológico semelhante ao sangue (Figura 4A).

Finalmente, o conteúdo de oxigênio (incluindo a fracção de gás e concentração fracional de oxigênio) de LOMs foi testada pela adição de diferentes volumes de oxigênio contidos 60% do volume LOMs a alíquotas de sangue humano Saturado com um déficit de oxigênio conhecido. Conforme descrito anteriormente, o teor de oxigênio LOMs pode ser calculado a partir do aumento da concentração de oxi-hemoglobina 7. A relação entre o volume de oxigênio adicionados dentro LOMs e do aumento volumétrico do conteúdo de oxigênio do sangue foi 1,053 ± 0,03025 (SD) (IC 95% = ,9865-1,120) (Fig.ure 4B), o que sugere que os LOM testadas continham cerca de 100% de oxigénio, exibiu algumas bolsas de gases aprisionados (que não se transferir de forma eficiente de oxigénio para o sangue, mas flutuam rapidamente para fora), e transferir eficazmente toda a sua carga de oxigénio para o sangue humano in vitro.

Figura 1
Figura 1. Fabricação configuração esquemática. LOMs são produzidos usando, um homogeneizador de alto cisalhamento in-line em um sistema de circuito fechado. LOMs são realizadas no interior da exploração e concentrando-tanque (HCT) sob agitação constante. A emulsão é movido através do sistema através de uma bomba de rolos. O calor gerado pelo homogeneizador é removido utilizando um trocador de calor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ A>

Figura 2
Figura 2. De auto-montagem de LOM dentro de uma tela de malha fina emulsor. A) Uma lâmina de rotação rápida, passa por cima de uma tela de malha fina emulsor, criando um efeito de sifão, que atrai as fases aquosas e de gás. Pequenas bolhas de oxigénio são formados por corte, e são rapidamente rodeado pelas caudas lipídicas anfipáticas hidrofóbicos de fosfolípidos, a criação de uma bolha de gás cheias de auto-montagem (B).

Figura 3
Figura 3. Caracterização da LOM. A) Um fotomicrografia representativa de LOM esféricas que apresentam uma distribuição de tamanhos polidispersa. Barra de escala =10 um. B) Distribuição de tamanhos de LOM como avaliado por obscurecimento. Dados = média, erro = SEM.

Figura 4
Figura 4. Propriedades de LOM centrifugadas e concentradas. A) O perfil reológico de uma emulsão de LOM a 60, o gás 70 e 90% em volume. Diluição de espuma concentrada para 60% do volume de gás produz um perfil reológico semelhante ao sangue humano (hematócrito de 40%). Dados = média, erro = SEM. B) A relação entre o teor de oxigénio da LOM adicionado ao sangue humano e o aumento medido em teor de oxigénio do sangue. Dados = média, erro = SEM, linha = regressão linear com IC de 95% da linha de melhor ajuste.

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Discussion

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Os passos mais importantes para a criação de concentrados, LOMs altamente oxigenados incluem: 1) assegurar que o espaço livre dentro do HCT permanece totalmente oxigenado; 2) garantia de que a pureza dos excipientes de lipídios é o ideal (incluindo as condições de armazenamento e uso de produtos de BPF); 3) assegurar que os lípidos em pó misturar completamente com a fase aquosa antes de escorvamento do sistema; e 4) prestando atenção para o aumento da fração de gás dentro do HCT para garantir que a fração de volume de gás não ultrapasse 70%.

O método aqui descrito utiliza alta homogeneização de cisalhamento para criar microbolhas ocos. Lípidos anfipáticos são suspensos com a fase aquosa, o qual é utilizado para transportar os lípidos para o homogeneizador em linha. Lípidos GMP grau são utilizados para estudos in vivo, e são geralmente preferidos porque contêm menos agregados lipídicos e impurezas. Os lípidos são também sujeitos a oxidação de lípidos (especialmente quando armazenadodentro de um fluido oxigenado) e contaminação bacteriana. LOM são formadas quando as caudas hidrofóbicas organizar em torno de pequenos microbolhas de gás de oxigénio criados dentro do homogeneizador em linha (Figura 2). Homogeneizar a 7500 rpm LOM submete as microbolhas a tensões mecânicas adicionais à medida que são triturados entre as pontas das pás do rotor e a parede interior do estator. LOM também submetidos ao corte hidráulico à medida que são forçados a alta velocidade através do crivo de malha emulsor ultra-fino, reduzindo ainda mais o tamanho de partícula. As forças de cisalhamento gerar calor dentro do homogeneizador em linha e localmente no misturador único estágio; um permutador de calor em linha, antes de voltar para o TCH é necessário para remover o calor. Ausência de um permutador de calor pode elevar a temperatura acima da temperatura de transição de fase do lípido (55 ° C para DSPC), o que aumenta a fluidez de lípido e resulta em perda de produto. Criação da emulsão num fechada, em-linha do dispositivo assegura que a oxigenação puron é incorporado no núcleo LOM, prevenindo a contaminação do ar. Além disso, LOM são expostos continuamente para com a câmara de expansão gasoso do HCT. Por conseguinte, é necessário assegurar que o efeito de aspiração criado pelo misturador de laboratório dentro da HCT não criar uma inversão do fluxo de ar da atmosfera para o HCT (através do monitor de gás de composição, que é aberto para a atmosfera para evitar a pressurização do HCT) . As taxas de fluxo de gás de oxigénio aqui descritos devem ser suficientes para evitar este fenómeno.

Reciclagem da emulsão através do homogeneizador em linha durante a fase de concentração de série cria LOM adicionais de fosfolípidos 'não utilizadas »restantes na fase aquosa, e também submete LOM intactas para cisalhamento repetidas, o que pode reduzir ainda mais o tamanho de partícula. O tamanho das partículas e gás concentração pode ser, portanto, adaptado, ajustando as velocidades do mixer, emulsor telas, tamanho da malha, e tempo de execução (isto é, duração da série concentration etapa). Agitação mecânica produz uma distribuição de tamanhos polidispersa. A distribuição de tamanho de largura permite mais apertado da embalagem de microbolhas, aumentando assim a fracção de gás encapsulado máximo num dado volume de espuma. Alterando formulação química por agentes de aumento de viscosidade de inclusão pode ser usado para criar uma distribuição de tamanhos mais homogénea, se desejado. Descobrimos que um tempo de execução de 15 minutos é o mais ideal; medida que aumenta a concentração de microbolhas, a emulsão torna-se cada vez mais viscoso. Uma vez que se atinge uma viscosidade crítica, já não é eficaz bombeada utilizando uma bomba de rolos. Isto faz com que o gás livre para passar através do homogeneizador sem ser incorporada LOM e pode ser visto no tubo transparente. Nesta fase, geralmente escolher parar a etapa de concentração em série, embora, se desejado, a taxa de escoamento do gás para o homogeneizador em linha pode ser diminuída e a taxa de fluxo da bomba de rolos pode ser aumentada para criar as fracções de gás mais altos. No entanto, altamente viscous emulsões exige mais força para retirar em seringas para o passo de centrifugação, e pode diminuir o rendimento deste processo.

O passo de centrifugação foi facilitada pela modificação de 140 ml de seringas para truncar o êmbolo e a base da seringa, de modo que as seringas cheias formar um cilindro uniforme. Isto facilita muito a carga e descarga de seringas no centrifugador. Após a centrifugação, seringas contêm tipicamente três camadas. A camada mais densa (perto da ponta da seringa quando seringas são carregados de nariz para baixo) contém fosfolípidos não utilizados e o volume da fase aquosa. Em alguns casos, nublado 'restos' pode ser visto dentro da seringa, que normalmente contém aglomerados lipídicos. Para as experiências de base, os conteúdos deste "fase aquosa" pode ser reutilizada para as experiências subsequentes, embora nós descobrimos que isto diminui substancialmente a eficiência do processo. (Para atenuar esse problema, excipientes fosfolipídios adicionais podemser adicionados à emulsão precursora reciclado, tendo o cuidado de manter a razão molar de cada excipiente.) A camada do meio dentro de cada seringa é brilhante branco e contém LOM concentradas. Existe normalmente uma linha nítida de demarcação entre o fundo e as camadas médias. A camada do meio de cada seringa pode ser combinado para tratamento posterior, tal como descrito abaixo. A camada superior contém espuma macia contendo gás livre de LOMs quebrados durante todo o processo de fabricação. As camadas superior e inferior são normalmente descartado. Durante a centrifugação, é importante para garantir que cada seringa está coberto por uma capa de seringa estanque a fim de evitar a extrusão da emulsão no centrifugador durante o processamento. A centrifugação a velocidades mais elevadas foi limitada pela resistência ao esmagamento das seringas nós utilizados. Se for necessário para conseguir uma linha nítida de demarcação entre as camadas inferiores e médias (geralmente quando emulsões contendo alta fração de gás estavam sendo centrifugado), tempo de centrifugação pode seralargado. Utilização de uma torneira de passagem de 3 vias estanque ao gás para combinar LOM concentrado é útil para prevenir a contaminação do ar. É também importante assegurar que LOM contendo seringas são mantidos sempre tapados e que todo o ar ambiente é imediatamente expulso. Para limitar a contaminação do ar durante o armazenamento, as seringas devem ser selados com apenas tampas luer-lock. Seringas de plástico são conhecidas por ser permeável ao gás, de modo que as seringas de vidro ou de metal, são preferíveis para o armazenamento a longo prazo.

Como descrito acima, as emulsões expostas ao passo de concentração em série durante 15 minutos exibem tipicamente gás de 70% em volume e podem ser concentrados de gás de 90% por centrifugação. Mesmo que 70% em volume de emulsão é desejado no final, verificou-se a centrifugação para ser útil para remover os fosfolípidos que não são incorporados de LOM a partir do concentrado. Isto também pode ser conseguido permitindo que emulsões de repousar durante a noite para conseguir a separação de fase. Para experimentos in vivo, que muitas vezes diluir o concentradoLOMs com Plasma-Lyte A, misture delicadamente, em seguida, centrifugar novamente para remover fosfolipídios não utilizados adicionais e outros detritos. Este passo pode ser repetido várias vezes quando necessário, para remover o excesso de restos de lípidos. A injecção de fosfolípidos que não são incorporadas nas LOM é indesejável por causa da carga de lípidos adicionais que conferem no ajuste de uma elevada taxa de infusão.

Foram encontradas várias armadilhas comuns a evitar no processo de fabricação. Em primeiro lugar, os excipientes de lípidos deverá ser fresca, armazenada a -80 ° C, e não usado, se expirou. A solução precursora não deve ser reutilizada para estudos in vivo, como emulsões resultantes são inconsistentes na sua distribuição de tamanho e a fracção máxima de gás, e pode conter contaminantes bacterianos, lípidos oxidados, ou aglomerados de lípidos. Em segundo lugar, uma vez que a emulsão atinge 'viscosidade crítica »durante a fabricação, isto não será mais eficazmente bombeada através do sistema, e grandes bolsas de gás vai formar na HCT. A alta viscosidade da emulsão também faz com que a emulsão difícil de manusear e de elaborar em seringas. Estes problemas são evitados melhor medindo o aumento na fracção de gás dentro do HCT (por quantificação do aumento de volume à medida da fracção de gás aumenta) e interrompendo o processo de concentração de série, uma vez as que dobra a quantidade de partida.

Uma limitação fundamental desta técnica é a necessidade persistente de um passo de centrifugação, o que é indesejável porque cria o potencial para o ar e contaminação bacteriana do produto final, e impede este de ser um processo contínuo. No futuro, o passo de concentração em série pode ser modificado para um sistema de um só passo para a produção comercial de drogas através da utilização de um sistema de descarga hidráulica para obviar a necessidade de centrifugação em lote. O homogeneizador em linha e misturadores de laboratório pode ser fabricado com 3/16 de aço inoxidável e esterilizado no local. A inclusão de outros gases no sistema pode alargar the utilidade desta técnica adicional.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Financiamento: Exército dos EUA Medical Research & Comando de Material (USAMRMC) e gerido pela Telemedicina e Tecnologia Avançada Research Center. Shunxi Ji contribuiu a modificação das seringas, conforme descrito aqui.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Polar Lipids 770365 Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080)
Cholesterol Sigma Aldrich C75209
Plasma-Lyte A VWR 80089-818 Alternatively can use NaCl
Glass collection vessel Specialty Glass, Inc. Custom Contact: Pam Zurbrick - 281-595-2210
Gas composition (oxygen) monitor Precision Medical PM5900L
Sarns 8000 roller pump Calicut Medical 16407 Part of a modular perfusion system
BIOtherm Heat Exchanger Medtronic ECMOtherm-II
Verso laboratory in-line mixer Silverson Machines, Inc TH-IL-102-VERSO Use multistage workheads and front-end extension with T piece
T-piece for Silverson Verso inlet port Process Innovations Custom Contact: Brian Leavitt - 508-423-2266
L5M-A laboratory mixer Silverson Machines, Inc NC0136483 Use mesh emulsor screen (fine)
Rochester-Ochsner toothed forceps Fisher Scientific 13-812-18
140 ml syringe Kendall Healthcare Monoject 8881114030 Ensure there is a luer lock.
IX71 Inverted light microscope Olympus IX71
Retiga-2000R microscope camera QImaging RET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A Autodilution PSS-NICOMP Particle Sizing Systems Out of production

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Fabricação de concentrado, oxigênio à base de microbolhas Lipid Emulsões pelo Alto cisalhamento homogeneização e Concentração de série
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Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).More

Thomson, L. M., Polizzotti, B. D., McGowan, F. X., Kheir, J. N. Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration. J. Vis. Exp. (87), e51467, doi:10.3791/51467 (2014).

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