Nós descrevem métodos para o fabrico de grandes volumes de microbolhas de oxigénio à base de lípidos (LOMs) concebidas para o fornecimento de oxigénio intravenosa usando homogeneização de alto cisalhamento e de concentração em série.
Microbolhas cheias de gás têm sido desenvolvidos como agentes de contraste de ultra-sons e de entrega de drogas. As microbolhas pode ser produzido através da transformação de surfactantes usando sonicação, agitação mecânica, dispositivos de microfluidos, ou homogeneização. Recentemente, microbolhas de oxigênio à base de lipídios (LOMs) foram projetados para fornecer oxigênio por via intravenosa durante emergências médicas, revertendo hipoxemia risco de vida, prevenção de lesões e posterior do órgão, parada cardíaca e morte. Nós apresentamos métodos para produção em escala-up de microbolhas altamente oxigenados usando um circuito fechado de alto cisalhamento homogeneizador. O processo pode produzir 2 L de LOM concentradas (90% em volume), em 90 min. Bolhas resultantes têm um diâmetro médio de cerca de 2 um, e um perfil reológico consistente com o do sangue, quando diluído para 60% em volume. Esta técnica produz LOM em alta capacidade e com uma pureza elevada de oxigénio, o que sugere que esta técnica pode ser útil para laboratórios de pesquisa translacional.
As microbolhas compostas de proteína, de polímero, e os reservatórios de lípidos têm sido desenvolvidos como vectores para a entrega da droga, a terapia génica, e os agentes de contraste de ultra-sons 1-5. Porque esses usos terapêuticos exigem persistência microbolhas intravascular, tais microbolhas são comumente cheio de inertes, altos gases peso molecular, tais como perfluorcarbonos 6, que possuem baixa solubilidade no sangue e estabilizar a 3,4 bolha.
Recentemente, microbolhas de oxigênio à base de lipídios (LOMs) foram projetados para fornecer as doses terapêuticas de oxigênio, que podem preservar a oferta de oxigênio de órgãos-alvo e evitar instabilidade hemodinâmica durante os períodos de obstrução das vias aéreas ou hipoxemia 7. Emulsões projetados para entrega de gás intravenosa requerem diferentes características de design do que os utilizados para os agentes de contraste de ultra-som ou entrega de drogas específicas. Primeiro, porque o corpo consome grandes volumes de gás de oxigénio (~ 200 ml / min), de LOM deve ser produzido einjectado em larga escala. Isto requer que o processo de fabrico seja eficaz. Em segundo lugar, o processo de fabrico deve ser de circuito fechado, a fim de evitar a contaminação de azoto através da exposição de LOM (que deve ser preenchido com 100% de oxigénio) para o ar ambiente. Em terceiro lugar, porque a finalidade da LOM é a entrega de gás por via intravenosa, a fração de gás de LOMs deve ser maximizado, reconhecendo as limitações impostas pela emulsão viscosidade 7. Finalmente, como com qualquer injectável intravenosa, o controlo preciso sobre a distribuição de tamanho de partícula é essencial para evitar a obstrução microvascular 8.
Existem vários métodos estabelecidos para o fabrico de micro-bolhas. A sonicação utiliza alta intensidade, o ultra-som de baixa frequência aplicada para a interface ar-fluido de uma emulsão que compreende um surfactante, tal como um fosfolípido anfipática, na presença de uma câmara de expansão de gás para produzir microbolhas 7,9. Este processo pode ser controlado por variação de ultrafrequência de som, energia e duração do impulso, e a distribuição de tamanho resultante pode ser adaptada para a produção de microbolhas com uma distribuição de tamanho específico, embora sonicação é raramente utilizado no fabrico de microbolhas clinicamente utilizadas. Fusão é a intensa agitação mecânica de um surfactante e gás num sistema fechado, o que também é difícil escalar para acomodar grandes volumes de 2. Microfluídica baseada em gota permite o controle preciso da distribuição de tamanho de microbolhas 10-13. Embora tradicionalmente difícil de escalar, multi-canal, microfluídica de alta velocidade foram descritos o que aumenta a eficiência da produção de microbolhas 13. Microbolhas fabricados usando qualquer um destes métodos pode exigir processos de redução de tamanho de pós-fabricação, tais como fracionamento centrífuga 14,15 e microbolhas flutuação 16,17.
Outro método estabelecido para a produção de microbolhas é altamente estáveis homogeniz cisalhamentoção 6, o que pode resultar num padrão hexagonal fosfolípido estabilizador sobre a superfície da microbolha 18. Com base neste conceito, descrevemos a incorporação de um homogeneizador de alto cisalhamento in-line para criar auto-montagem LOMs 19. Neste processo, o homogeneizador utiliza lâminas de rotação rápida, em estreita proximidade com as telas de malha dupla Emulsor finas, criando alto cisalhamento mecânico e hidráulico para a criação de microbolhas. Concentração de série da emulsão lipídica, por meio deste sistema produz uma fracção de gás cada vez mais concentrada, o que pode ser ainda mais concentrado por centrifugação.
Os passos mais importantes para a criação de concentrados, LOMs altamente oxigenados incluem: 1) assegurar que o espaço livre dentro do HCT permanece totalmente oxigenado; 2) garantia de que a pureza dos excipientes de lipídios é o ideal (incluindo as condições de armazenamento e uso de produtos de BPF); 3) assegurar que os lípidos em pó misturar completamente com a fase aquosa antes de escorvamento do sistema; e 4) prestando atenção para o aumento da fração de gás dentro do HCT para garantir que a fraçã…
The authors have nothing to disclose.
Financiamento: Exército dos EUA Medical Research & Comando de Material (USAMRMC) e gerido pela Telemedicina e Tecnologia Avançada Research Center. Shunxi Ji contribuiu a modificação das seringas, conforme descrito aqui.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Polar Lipids | 770365 | Alternate product: non-GMP from NOF America (Coatsome MC-8080) |
Cholesterol | Sigma Aldrich | C75209 | |
Plasma-Lyte A | VWR | 80089-818 | Alternatively can use NaCl |
Glass collection vessel | Specialty Glass, Inc. | Custom | Contact: Pam Zurbrick – 281-595-2210 |
Gas composition (oxygen) monitor | Precision Medical | PM5900L | |
Sarns 8000 roller pump | Calicut Medical | 16407 | Part of a modular perfusion system |
BIOtherm Heat Exchanger | Medtronic | ECMOtherm-II | |
Verso laboratory in-line mixer | Silverson Machines, Inc | TH-IL-102-VERSO | Use multistage workheads and front-end extension with T piece |
T-piece for Silverson Verso inlet port | Process Innovations | Custom | Contact: Brian Leavitt – 508-423-2266 |
L5M-A laboratory mixer | Silverson Machines, Inc | NC0136483 | Use mesh emulsor screen (fine) |
Rochester-Ochsner toothed forceps | Fisher Scientific | 13-812-18 | |
140 mL syringe | Kendall Healthcare Monoject | 8881114030 | Ensure there is a luer lock. |
IX71 Inverted light microscope | Olympus | IX71 | |
Retiga-2000R microscope camera | QImaging | RET-2000R-F-M-12 | |
Accusizer 780A Autodilution | PSS-NICOMP Particle Sizing Systems | Out of production |