Summary
GABA作動性シナプス前抑制は、モータと脊髄ネットワークでの感覚信号の統合のための重要な脊髄の強力な阻害のメカニズムです。基礎となる一次求心性の脱分極は、後根電位（DRP）の記録により測定することができる。ここでは、マウスにおけるDRP のインビボ記録する方法を実証する。
Abstract
シナプス前抑制は、脊髄の中で最も強力な阻害メカニズムの1つです。基本的な生理学的なメカニズムは、GABA作動性AXO-軸索シナプス（一次求心性脱分極）が介在する一次求心性線維の脱分極である。一次求心性脱分極の強度は、後根（後根電位、DRP）で体積を行っ電位を記録することによって測定することができる。シナプス前抑制の病理学的変化は、特定の疼痛症状の異常な中央演算処理において、モータ過剰興奮のいくつかの疾患において重要である。ここでは、マウスにおいてインビボで DRPを記録する方法を記載している。麻酔した動物および吸引電極を用いて記録手順における脊髄後根の調製について説明する。この方法は、GABA作動性、DRPを測定し、それによって生きているマウスでは脊髄シナプス前抑制を推定することができます。トランスジェニックマウスモデルとの組み合わせで、DRP記録月SE疾患関連脊椎の病態生理学を研究するための強力なツールとしてRVEは、 インビボ記録は、 例えば、同時記録又は脊柱上のネットワークおよび末梢神経の刺激によるDRPの誘導の操作の可能性をex vivoで単離された脊髄調製物と比較していくつかの利点を有する。
Introduction
シナプス前抑制は、脊髄の中で最も強力な阻害メカニズムの1つです。これは、シナプス後膜電位および運動ニューロン1-3の興奮性を変更することなく、monosynaptically興奮運動ニューロンにおける興奮性シナプス後電位（EPSPS）を阻害する。感覚シナプス前繊維にGABA作動性AXO-軸索シナプスによって誘導された一次求心性脱分極（PAD）は、基本的なメカニズム4-7（もFigure1aを参照）である。これらのシナプスは、GABA Aと GABA B受容体（GABA A R及びGABA B R） を含んでいる。 GABA A Rの活性は、ローカルイオン分布にPADを誘発クロライドコンダクタンスの増加をもたらす。この脱分極をブロック軸索終末に活動電位の伝播と減少したのCa 2 +流入と伝達物質放出の減少をもたらす彼らの強さを軽減します。 GABA B受容体の活性化はないなしトンPADに寄与せず、+流入は、それによってシナプス前抑制を増強するCa 2 +の減 少をもたらす。 GABA A Rの活性化が短期阻害に関与しているように見える一方で、GABA B Rは、長期8-10変調に関与している。 PADとシナプス前抑制の大部分を占めるGABAに加えて、他の送信機システムはまた調節する可能性があり、この機構11,12に寄与する。
シナプス前抑制における病理学的変化は、欠陥のあるGABA作動性伝達17によって媒介運動過剰興奮性と末梢性炎症および神経障害性疼痛13,14、ならびに異常な中枢性疼痛処理15、脊髄損傷16、およびCNS疾患、例えば 、いくつかの疾患状態において重要であると思わ18。従って、シナプス前抑制を推定するin vivoでの脊髄レベルに関する実験病理学的状態を調査する価値がある7の刺激後に脊髄後根から測定することができる。
DRPの最初の測定値は、猫やカエル19で報告されており、集中的に、1970年代初頭3,4,20,21にエクルズ、シュミット、そして他の人が猫で研究した。ネコおよびラット22 23 DRP のインビボ記録は、広く使用されてきたが、マウスでの測定は、ほぼ独占的にex vivoで単離された脊髄調製物15,24に行われている。ここでは、完全な生物体におけるシナプス前抑制の直接測定を可能に生体内で麻酔したマウスでは、DRPを記録する方法を説明している。
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Protocol
以下のプロトコルに記載されている全ての実験手順は、チューリンゲン州当局（テゥーリンガーLandesamtエリーゼVerbraucherschutz、Reg.-Nr. 02-044/12）によって承認された。
1。実験に向けた準備
- 吸引電極の作製
- 例えば 、標準のパッチ電極マイクロピペットプラー、標準ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用してマイクロピペットを引き出します。
- ブレーキダイヤモンドファイルを使用して（背側根の直径よりもわずかに大きい）0.5〜1ミリメートルの直径を傾けるための電極。
- 熱ポリッシュは、それが標準的な実験トーチインチ吸引する際には、後根に害を与えないように先端が適切であろう。
- 負圧を適用することができる介してシリンジに接続された電極ホルダにガラスフィラメントを取り付ける。
- 溶液の調製
- マウス用の注射麻酔：0.75ミリリットルケタミン10パーセント、0.24ミリリットルキシラジン2％Aを混ぜるND 5ミリリットル0.9％生理食塩水。溶液10μl/ gの体重（BW）は、腹腔内（ip）注射する。
- 人工脳脊髄液（ACSF）：（単位：mm）再蒸留水に希釈し、次の塩：NaClの134;塩化カリウム3、KH 2 PO 4 1.25、硫酸マグネシウム4•H 2 O 2、 炭酸水素ナトリウム25、 塩化カルシウム2、D-グルコース10。 0.003％の最終濃度までH 2 O 2を追加する。常に新鮮に調製した溶液を使用してください。
- 録画設定します（ 図2）の調製
- データをデジタル化するためのPCインターフェースにアンプを接続します。
- PCのハードドライブ上の方形パルス刺激とデータ収集をトリガするために、PCベースのプログラムまたはアナログタイマを使用。
- 刺激と記録用として標準的なガラス電極ホルダに接続塩素化silverwiresを使用してください。
- ステールのまわり、それぞれの刺激、記録と参照電極のための3つのマニピュレータを組み立てるマウスについてのotacticフレーム、全ての電極は、後で準備脊髄へのアクセス権を持つように。
- 負圧を適用するリンゴであると電極ホルダにチューブや注射器を接続します。
2。記録手順のための動物実験や動物の準備のための一般的なコメント
- それぞれの制度的動物管理使用委員会のガイドラインに従って、マウスを使用して、すべての実験を行う。動物の苦痛を最小化していることを確実にする、深い麻酔下で、すべての手術との録音を行う。
- （;上記のように調製した溶液を10μl/ G BWのそれぞれ125mgのケタミン及びキシラジン、のG BWあたり8mgの）ケタミン/キシラジンの腹腔内注射することによって動物を麻酔。長期記録時に必要な場合、追加の注射は腹腔内または筋肉にすることができる
注：0.05〜0.1の反復筋肉内注射を上部大腿部におけるケタミン/キシラジン溶液のmlを適切であることが証明されている最大3時間、深麻酔で動物を維持する。 - 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
- 定位フレームに動物の頭部を固定し、実験中、動物の体温を制御するために、直腸プローブと反射的ループで加熱パッドを使用しています。定位フレーム中の脊髄の固定は必要ありません。
- 準備を始める前に、マウスの足の指の間に瞬目反射および単収縮による麻酔の深さを確認してください。反射は廃止すべき。
- メスを用いて明確な運用のフィールドを取得するために腰椎の領域を下げる胸部上部レベルから脊髄上記の正中線に沿って皮膚を開きます。皮膚切開を行うためにハサミを使用しないでください。慎重に下にある組織から皮膚を失う。その後の工程の間に0.9％生理食塩水で湿らせた傷を保つ。
- 小刀やはさみを使って胸椎レベルに腰椎から脊椎の両側に腱および結合組織を切断する。 小さなニッパーを使って脊椎の周りの棘突起および結合組織の残りの部分を削除します。
- 慎重に解剖顕微鏡下で腰椎レベル（L4/L5）から始まるニッパーで脊椎割れ。脊椎と脊髄の間の空間にニッパーの先端を突き出すと離れて骨片を持ち上げます。硬膜を害すると脊髄に圧力を避けるためにしないでください。どちらも、成功のために重要である。全体の手順の間、湿らせた脊髄に保管してください。半ば胸部のレベルに進みます。
3。後根およびDRPの記録を分離します（図2）
- 慎重に曲がった先端を細い針（30 G）を使用して硬膜を開きます。これから加湿のためのaCSFを使用してください。
- ゲージを使用して、可能な限り後根を分離し、可能な限り遠位として2隣接根を切る。活発な分離の間に根を引っ張ると、実験の成功に影響を与えます。
- DOに吸引電極を下に下げるRSALルーツ。液体は後根を吸引するのに役立ちますので、可能な限り、脊髄に限りのaCSFを追加します。
- シリンジを介して負圧を印加することによって一方のガラスピペット内に1後根の切断端を吸う。必要に応じて、細い針を使用し、電極開口部の前面に後根を移動します。
- 後根は、吸引電極内の乾燥にある場合、慎重に吸引しながら、ピペットを十分のaCSFで満たされるまで、その先端にいくつかのaCSFを追加します。
- 後根が吸い込まれた後、脊髄から電極先端を高めています。ピペットチップや脊髄短絡記録/刺激電極の間には "水の橋」と注意してください。
- 繰り返します同側隣接するルートのための3.3から3.6を繰り返します。
- 後根にできるだけ近い参照電極を配置し、aCSFのを適用することで湿らせ、それを維持する。
- 録画設定を確立することによって、1ルートがすでに刺激のために選択され、録音用です。二後根から記録が電流クランプモードで行われている間、電圧を段階的に増やします。一つは、DRPを表す遅く、長期的な上向きのたわみが続いている短い下方への撓みが発生することがあります。
- （ - 0.1ヘルツ、0.3ヘルツ、3 kHzの間のフィルタで30スイープ/後根少なくとも20）のレベルを最大上、いくつかのスイープを記録するための刺激電圧を調整します。
- DRPの時間依存合計に関する情報を取得するために3つの刺激（100ヘルツ）の短い列車を記録します。
- 追加の対側記録に記録し、刺激部位を切り替える。
- 動物を手順に耐えることを意図するものではない。まだ深麻酔下にある間断頭により最後の記録の後に動物を犠牲に（ケタミン/キシラジン、上記参照、ステップ2.2）。
4。データ解析
- 解析プログラムにデータを転送（ 例えばシグマプロット、イゴールプロ、またはMATLAB）。
- 平均トレースFRを計算するOM、20〜30スイープ。
- さらに分析するため（ 図3）、（DRPのピーク振幅ベースラインからの）電圧振れの最大振幅をとる。
- その後のポテンシャルの時間依存合計の測定値を得るために3パルスと単一パルスの後に、DRPのピーク振幅の比を計算します。
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Representative Results
典型的なDRPトレースを図3に示す。著名な刺激アーティファクトは通常は短い下方への撓みが続いている。その後、DRPを表す遅い、長期持続上向き偏向は、明確に区別される。録音の一部では、脊髄後根反射は、DRPの上に小さなスパイクとして表示されます。刺激電圧が過剰になると正常な野生型マウスでは、後根反射は最も頻繁に現れる。後根反射神経がこの準備に再現性よく誘発することはできませんので、それらを分析のために採取されておらず、注意が最低に刺激電圧を低減するために撮影していたが、さらに最大上強度。 DRPピーク振幅の解析のために、20〜30以降の掃引のトレースが（図3a）が使用される平均化。 DRPのピーク振幅は、従来の刺激アーチファクトのベースラインレベルと比較して計算することができる。
DRPの時間依存性の総和は、反復番目から分析することができるimulations（3刺激、100Hzで、 図3b）。ピーク振幅は、単一の刺激実験に応じて算出される。高い周波数での単一および3回刺激後の振幅の比は、PADの時間依存総和の推定値を与える。
図1。 PADの関連脊髄経路及び録画設定の模式図。図は、後根の刺激後の脊髄におけるシナプス前抑制の概略経路を示す（3）。一次求心性脱分極（PAD）は、一次ニューロン（1）とのIa求心性繊維（2）上の軸索、軸索のシナプスと抑制性介在ニューロンによる連続GABA作動性抑制のプールの活性化により媒介される。後根電位（DRP）は、PADを反映し、後根に沿って電子的に広がり、脊髄（4）。Bにそのエントリーの近くを記録した。データ収集は、（1）LIH 8 +8コンピュータインタフェース（2）を用いてpatchmasterソフトウェアを実行するパーソナルコンピュータによって行われる。 ELCユニバーサル増幅器からの電圧信号は、（7）、10kHzでデジタル化される。刺激はS88デュアル出力方形パルス刺激を制御するTTL信号によってトリガされる（3）。電圧パルスは、吸引電極（4）を介して印加される。記録電極は、プリアンプ（6）に接続されている。塩素化銀線は（5）を接地するために使用されます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。その場での DRP記録。麻酔したマウスの脊髄は、露出した硬膜を除去し、人工脳脊髄液で湿らせる。吸引電極（1：刺激電極、2：記録電極は、）脊髄上に配置されている。挿入図は、脊髄（黒矢印）および後根（青矢印）を示しています。後根を切断し、分離し、電極（1,2）。Bの先端に吸い込まれている。それらが周囲の流体と接触しないように、後根（挿入図、黄色の矢印）を含有するピペットの先端が、注意深く脊髄表面から上昇することがある。後根の伸張と脊髄に触れては（およびB：刺激電極1と、記録電極2、参照極3）は避けるべきである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。代表的な結果。後根の1組から28の連続したトレース（右パネル）の。平均化記録（左パネル）。刺激アーチファクト（1）は、DRPを反射長時間の負電位（2、上方）が続く。いくつかのレコーディングでは、心拍（ECG）がアーチファクト（右パネル、赤矢印）と見られているが、明らかにDRPと区別することができる。 DRPに重畳されたオーバーラップ心電図アーチファクトトレースが分析。Bから除外されなければならない。反復刺激（3刺激は、10ヘルツ）をするc。DRPの実施例の録音（黒線）の前および5分後（横軸が時間的加重を明確にするために拡大される）DRPの時間依存総和をもたらす局所（赤線）さらさ脊髄へのGABA作動性ブロッカーbicucullin（0.5ミリモル、500μL）の適用。地元のGABA作動性ニューロンの阻止は（時々 、時々 、生体内記録における DRP中に発生し、赤の曲線の50 Hzの正弦波の人工物に注意しては適切であっても防ぐことができない記録された可能性のGABA作動性の原点を確認し、DRPピーク振幅の著しい減少につながるアースとシールド）。
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Discussion
in vivoでの神経活動やシナプス電位の細胞外および細胞内電気生理学的記録は、CNS神経機能と病態生理を調査中の最新技術である。脊髄統合は、運動機能などの四肢の動きやマルチモーダル感覚知覚するために重要である。シナプス前抑制は、感覚入力への適切な対応を確保すること、この計算プロセスにおける1重要なメカニズムである。のIa求心性線維上のGABA作動性シナプスは、パッドによる運動ニューロンの興奮を抑制する。 in vivoでの脊髄後根電位記録を直接無傷動物パッドを測定するための可能性を開く。この技術は、異常脊椎阻害は、疼痛、脊髄損傷、末梢神経損傷、又は炎症のような関連である、疾患状態に関連する研究のために特に関心があるかもしれない。遺伝的に改変されたマウスモデルの使用と組み合わせて、この技術は、INVEするための強力であることができる邪魔脊髄抑制の基礎となるstigateメカニズム。ここでこの方法は、単離された脊髄調製物を用いてマウスにおけるDRP記録の代替形態のいくつかの制限を克服する。だから、脊柱上のネットワークへの経路が保存され、また、脊髄および脊柱上神経活動を組み合わせた解析が可能ですされています。 PAD上の脊柱上活性の効果は、それぞれの脳の中心の平行な電気刺激によって調査することができる。また、DRPは、末梢神経病変または炎症の動物モデルにおいて関連があるかもしれない、直接末梢神経の刺激によって誘発することができる。適切な麻酔、警戒および温度制御を用いて、記録が生理学的条件下で無傷の動物における時間実施することができる。
いくつかの浴の制御された局所薬物適用および灌流に関する制限は延びてこれとは対照的に、単離された脊髄調製物の使用と比較して、DRP のインビボ記録は、いわゆるlution。薬物は局所的に適用することができるが、周囲組織への不確実な拡散、記録調製における可変溶液交換し、溶液の量は、それが脊髄および記録部位内の薬剤濃度を制御することは不可能である。表面塗布の急性効果が研究されている場合、これらの制限は、一部のピペットを介してローカル·アプリケーションによって解決することができる。
マウスの脊髄は、圧力やねじれに対して非常に敏感少なく、手術は困難である。したがって、in vivoでの電気生理学のためのマウスの脊髄の製造は、いくつかの訓練を必要とします。特定の重要なポイントがあります。これは、調製中に硬膜を傷つけ、好ましくないか、または少なくとも非常に少数の圧力が脊髄に適用されることはないことが必須である。脊髄は、それぞれNaClおよびaCSFの、と硬膜の開口部の前後に、全体の手順の間に湿らしておく必要があります。信号対雑音DRP記録の比は、それぞれの後根のエントリーポイントにできるだけ近いを刺激し、記録することによって増加させることができる。録画設定の勤勉な接地とシールドは非特異的ノイズを低減するのに役立ちます、解剖顕微鏡のランプがオフになっているか、録音中に削除する必要があります。
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Disclosures
著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
我々は、この方法の確立の際に有用な議論のためのマンフレッドHECKMANNに感謝します。さらに、我々はビデオを生成するサポートのための技術支援やフランク·シューベルトのためクラウディアソマーに感謝します。 01EO1002とイエナ大学病院の臨床研究のための学際センター（IZKF）：仕事は、連邦教育研究省（BMBF）、ドイツ、FKZによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamine 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30 G Microneedle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Universal amplifier | NPI (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
References
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