Summary
GABAergica inibizione presinaptica è un potente meccanismo inibitorio nel midollo spinale importante per il motore e l'integrazione del segnale sensoriale in reti midollo spinale. Sottostante afferenti primari depolarizzazione può essere misurata mediante registrazione dei potenziali radice dorsale (DRP). Qui mostriamo un metodo di registrazione in vivo di DRP nei topi.
Abstract
Inibizione presinaptica è uno dei più potenti meccanismi inibitori nel midollo spinale. Il meccanismo fisiologico alla base è una depolarizzazione delle fibre afferenti primarie mediate da GABAergici sinapsi axo-assonale (primaria depolarizzazione afferente). La forza di primaria depolarizzazione afferente può essere misurata mediante registrazione dei potenziali volumi condotto alla radice dorsale (potenziali radice dorsale, DRP). Le alterazioni patologiche di inibizione presinaptica sono cruciali nella elaborazione centrale anormale di alcune condizioni di dolore e in alcuni disturbi di ipereccitabilità del motore. Qui, si descrive un metodo di registrazione DRP in vivo nei topi. La preparazione del midollo spinale radici dorsali nella procedura di registrazione utilizzando elettrodi di aspirazione animale anestetizzato e sono spiegato. Questo metodo permette di misurare GABAergica DRP e quindi stimare inibizione presinaptica spinale nel topo vivente. In combinazione con modelli di topi transgenici, la registrazione DRP può serve come un potente strumento per studiare associata a malattia del midollo fisiopatologia. In vivo la registrazione ha diversi vantaggi rispetto alle ex vivo isolato preparazioni midollo spinale, ad esempio, la possibilità di registrazione simultanea o manipolazione di reti sopraspinali e induzione di DRP dalla stimolazione dei nervi periferici.
Introduction
Inibizione presinaptica è uno dei più potenti meccanismi inibitori nel midollo spinale. Inibisce potenziali postsinaptici eccitatori (EPSPS) in motoneuroni monosinaptica eccitati senza modificare il potenziale di membrana post-sinaptica e l'eccitabilità dei motoneuroni 1-3. Depolarizzazione afferenti primari (PAD) indotta da GABAergici sinapsi axo-assonale su fibre presinaptiche sensoriali è il meccanismo sottostante 4-7 (vedi anche Figure1a). Queste sinapsi contengono GABA A e GABA B recettori GABA A (R e GABA B R). Attività GABA A R porta ad un aumento della conduttanza cloruro che suscita PAD dovuto alla distribuzione ione locale. Questo blocca depolarizzazione la propagazione dei potenziali d'azione nei terminali dell'assone e riduce la loro forza con conseguente riduzione del Ca 2 +-afflusso e una riduzione del rilascio trasmettitore. Attivazione dei recettori GABA B non fat contribuiscono al PAD ma porta ad una riduzione di Ca 2 +-afflusso migliorando così inibizione presinaptica. Mentre l'attivazione di GABA A R sembra essere coinvolto nella inibizione breve termine, GABA B R sono coinvolti nella modulazione a lungo termine 8-10. Oltre al GABA, che rappresenta la maggior parte del PAD e l'inibizione presinaptica, altri sistemi di trasmettitori possono anche modulare e contribuire a questo meccanismo 11,12.
Alterazioni patologiche inibizione presinaptica sembrano determinanti in diversi stati patologici esempio infiammazione periferica e dolore neuropatico 13,14, così come anormale trasformazione dolore centrale 15, lesioni del midollo spinale 16, e malattie del SNC con ipereccitabilità motore mediata da difettoso trasmissione GABAergica 17, 18. Pertanto, la stima inibizione presinaptica la pena di indagare sulle condizioni patologiche sperimentali a livello del midollo spinale in vivo 7.
Le prime misure di DRP sono stati riportati in gatti e rane 19 e sono state intensamente studiate nei gatti da Eccles, Schmidt e altri nei primi anni 1970 3,4,20,21. Mentre le registrazioni in vivo di DRP nei gatti 22 e 23 ratti sono stati ampiamente utilizzati, misurazioni nei topi sono stati condotti quasi esclusivamente in ex vivo isolato preparazioni midollo spinale 15,24. Qui, descriviamo un metodo per registrare DRP in topi anestetizzati in vivo permette una misura diretta di inibizione presinaptica nell'organismo intatto.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali di cui al seguente protocollo sono stati approvati dalle autorità statali della Turingia (Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Reg.-Nr. 02-044/12).
1. Preparativi per Experiment
- Fabbricazione di elettrodi di aspirazione
- Tirare una micropipetta con un capillare di vetro borosilicato di serie con un estrattore micropipetta, ad esempio, un elettrodo di patch standard.
- Freno l'elettrodo a punta diametro di 0,5-1 mm (leggermente più grande del diametro delle radici dorsali) utilizzando un file di diamante.
- Polish calore la punta in modo da non danneggiare la radice dorsale quando viene risucchiato dentro una torcia laboratorio standard sarà adatto.
- Montare il filo di vetro su un supporto di elettrodo collegato ad una siringa attraverso il quale la pressione negativa può essere applicata.
- Preparazione di soluzioni
- Anestesia iniettabile per topi: Miscelare 0,75 ml di ketamina 10%, 0,24 ml xylazina 2%nd 5 ml di soluzione fisiologica 0,9%. 10 microlitri / g di peso corporeo (BW) della soluzione viene iniettata per via intraperitoneale (ip).
- Liquido cerebrospinale artificiale (aCSF): diluire in acqua bidistillata i seguenti sali (in mm): 134 NaCl, KCl 3; KH 2 PO 4 1,25; MgSO 4 • H 2 O 2; NaHCO 3 25; CaCl 2, 2, D- glucosio 10. Aggiungere H 2 O 2 ad una concentrazione finale di 0,003%. Utilizzare una soluzione sempre preparata al momento.
- Preparazione della configurazione di registrazione (Figura 2)
- Collegare l'amplificatore ad una interfaccia PC per la digitalizzazione dei dati.
- Utilizzare un programma basato su PC o un timer analogico per innescare uno stimolatore impulso quadrato e l'acquisizione dei dati sul disco rigido del PC.
- Utilizzare silverwires chlorided collegati alla porta elettrodi vetro standard, per la stimolazione e la registrazione.
- Montare tre manipolatori per la stimolazione, la registrazione e l'elettrodo di riferimento, rispettivamente, intorno a un sterecornice otactic per topi, in modo che tutti gli elettrodi hanno accesso al midollo spinale preparato in seguito.
- Collegare tubi e siringhe ai titolari elettrodi essere mela per applicare una pressione negativa.
2. Commenti generali per la sperimentazione animale e preparazione degli animali Procedura di registrazione
- Eseguire tutti gli esperimenti con i topi secondo le direttive del rispettivo comitato cura degli animali istituzionale e l'uso. Eseguire tutti gli interventi chirurgici e le registrazioni in anestesia profonde assicurando che la sofferenza degli animali è ridotta al minimo.
- Anestetizzare l'animale mediante iniezione ip di ketamina / xilazina (125 mg e 8 mg per g BW di ketamina e xilazina, rispettivamente 10 ml / g di peso corporeo della soluzione preparata come descritto sopra). Se necessario, durante le registrazioni a lungo termine, ulteriori iniezioni possono essere effettuate ip o im
Nota: ripetitivi im iniezioni di 0,05-0,1 ml di soluzione di ketamina / xylazina nelle cosce hanno dimostrato di essere adattoper mantenere l'animale in anestesia profonda fino a 3 ore. - Utilizzare veterinario unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Fissare la testa dell'animale in un telaio stereotassico e utilizzare una piastra elettrica con sonda rettale e anello riflesso per controllare la temperatura corporea dell'animale durante l'esperimento. Fissazione del midollo spinale in un telaio stereotassico non è necessario.
- Prima di iniziare la preparazione, verificare la profondità della narcosi da reflex eyeblink e contrazioni tra le dita dei topi. Riflessi dovrebbero essere aboliti.
- Aprire la pelle lungo la linea mediana sopra il midollo spinale dal livello toracico superiore ad abbassare le zone lombari per ottenere un campo operativo chiaro con un bisturi. Non usare le forbici per fare incisioni cutanee. Perdere con cura la pelle dal tessuto sottostante. Durante le fasi successive mantengono la ferita inumidito dello 0,9% soluzione salina.
- Tagliare tendini e tessuto connettivo su entrambi i lati delle vertebre lombari da livelli toracici usando bisturi e forbici. Rimuovere i processi spinosi e resto del tessuto connettivo intorno alle vertebre con una piccola pinza.
- Rompere con cautela vertebre con la pinza a partire dai livelli lombari (L4/L5) sotto un microscopio da dissezione. Spingere la punta della pinza nello spazio tra le vertebre e il midollo spinale e sollevare pezzi di ossa a parte. Non danneggiare la dura ed evitare una pressione al midollo spinale. Entrambi sono fondamentali per il successo. Mantenere il midollo spinale inumidito durante l'intera procedura. Procedere a livelli medio-toracici.
3. Separazione delle radici dorsali e DRP registrazione (Figura 2)
- Aprire la dura madre con cura utilizzando un ago sottile (30 G) con una punta piegata. Utilizzare aCSF per inumidire da ora in poi.
- Separare le radici dorsali, per quanto possibile con il calibro e tagliare due radici adiacenti come distale possibile. Vigorosa tirando le radici durante separazione colpisce il successo dell'esperimento.
- Abbassare l'elettrodo di aspirazione verso il basso per il faiRSAL radici. Aggiungere tanto aCSF al midollo spinale possibile perché liquido aiuta a succhiare nelle radici dorsali.
- Succhiare la fine taglio di una radice dorsale in una pipette di vetro applicando una pressione negativa attraverso una siringa. Se necessario, spostare la radice dorsale di fronte all'apertura elettrodo utilizzando un ago sottile.
- Se la radice dorsale si trova a secco entro l'elettrodo di aspirazione, aggiungere un po 'aCSF alla sua punta, mentre con cura succhia fino a quando la pipetta è sufficientemente pieno di aCSF.
- Dopo la radice dorsale viene aspirata, sollevare la punta dell'elettrodo dal midollo spinale. Fate attenzione che nessun "ponte acqua" tra il puntale e il midollo spinale corto circuito l'elettrodo di registrazione / stimolazione.
- Ripetere i passaggi 3,3-3,6 per una radice adiacente omolaterale.
- Posizionare l'elettrodo di riferimento più vicino possibile alle radici dorsali e tenerlo inumidito applicando aCSF.
- Stabilendo la configurazione della registrazione, una radice è già scelto per la stimolazione, ilaltra per la registrazione. Aumentare la tensione di graduale durante la registrazione della seconda radice dorsale è fatto in modo pinza corrente. Si può notare una breve deviazione verso il basso che è seguita da una lenta, lunga durata deflessione verso l'alto rappresenta il DRP.
- Regolare la tensione stimolo per sopramassimale livelli e registrare diverse scansioni (almeno 20 - 30 spazza / radice dorsale a 0.1 Hz, filtra tra 0,3 Hz-3 kHz).
- Registrare treni corti di tre stimoli (100 Hz) per ottenere informazioni circa la sommatoria tempo-dipendente della DRP.
- Passare la registrazione e il sito di stimolazione per ulteriori registrazioni controlaterale.
- Animali non sono destinati a sopravvivere alla procedura. Sacrifica animali dopo l'ultima registrazione per decapitazione, mentre ancora sotto anestesia profonda (ketamina / xylazina, vedi sopra, passo 2.2).
4. Analisi dei dati
- Trasferire i dati al programma di analisi (ad esempio Sigma Plot, Igor Pro, o MATLAB).
- Calcola tracce medi from 20-30 spazza.
- Prendere la massima ampiezza della deflessione tensione (rispetto al basale; DRP ampiezza di picco) per ulteriore analisi (Figura 3).
- Calcolare il rapporto tra l'ampiezza picco DRP dopo tre impulsi e del singolo impulso per ottenere una misura della sommatoria dipendente dal tempo di potenziali successive.
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Representative Results
Tracce tipiche DRP sono mostrati in Figura 3. La stimolazione manufatto di rilievo è di solito seguita da una breve deviazione verso il basso. Successivamente una lenta, lunga durata deflessione verso l'alto, che rappresenta il DRP è chiaramente distinguibile. In un sottogruppo di registrazioni, i riflessi spinali sono visibili come piccole punte sulla parte superiore del DRP. In normali topi wild-type, i riflessi spinali appaiono più spesso quando la tensione è eccessiva stimolazione. Come i riflessi spinali non può essere suscitato con un elevato riproducibilità in questa preparazione, essi non sono stati presi per l'analisi e la cura è stata presa per ridurre la tensione stimolo al più basso, ma la forza ancora sovramassimale. Per l'analisi del DRP ampiezze di picco, media tracce di 20-30 successive scansioni vengono utilizzati (Figura 3a). Le ampiezze di picco DRP possono essere calcolati rispetto ai livelli basali prima del manufatto stimolazione.
La sommatoria dipendente dal tempo del DRP può essere analizzato ripetitivo stimulations (3 stimoli, 100 Hz, Figura 3b). L'ampiezza di picco viene calcolata secondo l'esperimento singolo stimolazione. Il rapporto delle ampiezze dopo una singola e tre stimolazioni ad alta frequenza fornisce una stima della sommatoria dipendente dal tempo di PAD.
Figura 1. Disegni schematici dei percorsi del midollo spinale PAD-associate e impostazione della registrazione. A. Il diagramma mostra il percorso schematica di inibizione presinaptica nel midollo spinale dopo la stimolazione della radice dorsale (3). Depolarizzazione afferenti primari (PAD) è mediata attraverso l'attivazione di un pool di neuroni di primo ordine (1) e inibizione consecutivamente GABAergici da un interneuroni inibitori con una sinapsi axo-assonale su fibre afferenti Ia (2). Potenziali radice dorsale (DRP) riflettono la PAD, diffondere elettronicamente lungo la radice dorsale e sono stati registrati vicino al suo ingresso al midollo spinale (4). B. L'acquisizione dei dati viene effettuata da un software personal computer acceso patchmaster (1) utilizzando un LIA 8 +8 interfaccia computer (2). Segnali di tensione dall'amplificatore universale ELC (7) sono digitalizzati a 10 kHz. La stimolazione viene attivato da un segnale TTL controlla un S88 doppia uscita piazza stimolatore ad impulsi (3). Impulsi di tensione vengono applicati attraverso un elettrodo di aspirazione (4). L'elettrodo di registrazione è collegato ad un preamplificatore (6). Un filo d'argento chlorided viene utilizzato per la messa a terra (5). Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2.Registrazione DRP in situ. A. Il midollo spinale del topo anestetizzato è esposta, la dura madre rimosso, e inumidito con fluido cerebrospinale artificiale. Gli elettrodi di aspirazione (1: Maggiore elettrodo; 2: registrazione elettrodo,) sono posizionati sul midollo spinale. L'inserto mostra il midollo spinale (freccia nera) e le radici dorsali (frecce blu). Le radici dorsali sono separate, tagliare, e risucchiati le punte degli elettrodi (1,2). B. Le punte delle pipette contenenti le radici dorsali (inserto, giallo frecce) devono essere attentamente elevato dalla superficie del midollo spinale, in modo che non siano a contatto con il fluido circostante. Stretching delle radici dorsali e toccando il midollo spinale deve essere evitato (in A e B: la stimolazione dell'elettrodo 1; registrazione elettrodo 2; elettrodo di riferimento 3). cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Risultati rappresentativi. Una. Averaged registrazione (pannello di sinistra) di 28 tracce consecutive (pannello di destra) da un paio di radici dorsali. Il manufatto stimolazione (1) è seguita da una prolungata potenziale negativo (2, verso l'alto), che riflette la DRP. In alcune registrazioni, battito cardiaco (ECG) è visto come un artefatto (pannello di destra, frecce rosse), ma può essere chiaramente differenziato dal DRP. Tracce con artefatti ECG sovrapposti sovrapposti al DRP devono essere esclusi dall'analisi. B. Stimolazione ripetitiva (3 stimoli, 10 Hz) porta ad una somma dipendente dal tempo del DRP (ascissa è allargato a chiarire sommatoria temporale). C. Esempio registrazioni di DRP prima (linea nera), e 5 minuti dopo (linea rossa) localeapplicazione del bloccante bicucullin GABAergica (0,5 mM, 500 microlitri) sul midollo spinale esposti. Blocco degli interneuroni GABAergici locali porta ad un marcato declino di DRP picco di ampiezza, a conferma dell'origine GABAergici del potenziale registrata (notare il manufatto di 50 Hz sinusoidale in curva rossa che si verifica di tanto in tanto durante la DRP nella registrazione vivo e, talvolta, non può essere impedito anche da una corretta messa a terra e schermatura).
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Discussion
Registrazioni-extra e intracellulari elettrofisiologici di attività neuronale e potenziali sinaptici in vivo sono allo stato dell'arte delle tecniche di indagine delle funzioni neuronali del sistema nervoso centrale e fisiopatologia. Integrazione spinale è fondamentale per la funzione motoria, ad esempio, il movimento degli arti e per la percezione sensoriale multimodale. Inibizione presinaptica è un meccanismo fondamentale in questo processo computazionale garantire risposte adeguate a input sensoriali. Sinapsi GABAergici su fibre afferenti Ia inibiscono l'eccitazione dei motoneuroni da PAD. Radice dorsale potenziale-registrazione in vivo apre la possibilità di misurare direttamente PAD nell'animale intatto. Questa tecnica potrebbe essere di particolare interesse per la ricerca relativa agli stati di malattia in cui l'inibizione spinale anormale è rilevante come il dolore, lesioni del midollo spinale, lesioni dei nervi periferici, o infiammazione. In combinazione con l'uso di modelli murini geneticamente modificati questa tecnica può essere efficace per invemeccanismi stigate sottostante disturbati inibizione spinale. Il metodo qui supera alcune limitazioni della forma alternativa di registrazioni DRP nei topi mediante isolato preparazioni midollo spinale. Quindi, percorsi di reti sovraspinali sono conservati e anche l'analisi combinata di attività neuronale spinale e sopraspinale è possibile. L'effetto di attività sovraspinale sul PAD può essere indagato dalla stimolazione elettrica parallela di rispettivi centri cerebrali. Inoltre, DRP può essere evocato dalla stimolazione del nervo periferico direttamente, che potrebbe essere rilevante in modelli animali di lesione dei nervi periferici o infiammazione. Uso corretto anestesia, vigilanza e controllo della temperatura, le registrazioni possono essere effettuate per ore nel intatta di un animale in condizioni fisiologiche.
Al contrario, rispetto all'uso di preparati isolati midollo spinale, in vivo di registrazione DRP è in certa misura limitata per quanto riguarda l'applicazione locale di droga controllato e perfusione del bagno cosìluzione. I farmaci possono essere applicati localmente ma a causa della diffusione incerto nel tessuto circostante, lo scambio soluzione variabile e quantità di soluzione nella preparazione di registrazione non è possibile controllare la concentrazione di farmaco nel midollo spinale e il sito di registrazione. Quando gli effetti acuti di applicazione superficiale sono studiati, queste limitazioni possono essere parzialmente risolti con l'applicazione locale attraverso pipette.
Il midollo spinale di topi è piccola, molto sensibile alla pressione e torsione, e la chirurgia è difficile. Pertanto, la preparazione del midollo spinale di topo in vivo elettrofisiologia bisogno di una formazione. Ci sono alcuni punti critici. È essenziale che durante la preparazione della dura madre non è danneggiato e che preferibilmente non o almeno molto pochi pressione viene applicata al midollo spinale. Il midollo spinale è conservata inumidita durante l'intera procedura, prima e dopo l'apertura della dura con NaCl e aCSF rispettivamente. Il segnale di rumorerapporto di registrazioni DRP può essere aumentata stimolando e registrando il più vicino possibile al punto di ingresso della rispettiva radice dorsale. Messa a terra diligente e schermatura del setup di registrazione contribuisce a ridurre il rumore aspecifica, lampade del microscopio dissezione devono essere spenti o rimossi durante la registrazione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Manfred Heckmann per utili discussioni durante stabilisce il metodo. Inoltre, ringraziamo Claudia Sommer per l'assistenza tecnica e Frank Schubert per il supporto la produzione del video. Il lavoro è stato supportato dal Ministero federale dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF), Germania, FKZ: 01EO1002 e il Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) di Jena University Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamine 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30 G Microneedle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Universal amplifier | NPI (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
References
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